姜黄素对EMs大鼠子宫异位内膜体积的影响及作用机制

Effect of curcumin on endometrial volume in endometriosis rats and its mechanism

摘要

目的 探讨姜黄素介导Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号转导转录激活因子3（signal transducers and transcriptional activators 3，STAT3）信号通路对子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）大鼠的影响。 方法 随机选择10只雌性Wistar大鼠作为假手术组，剩余大鼠于第3个动情期通过子宫内膜自体移植构建EMs模型，建模成功后随机分为模型组、姜黄素低剂量组（48 mg·kg^-1）、姜黄素高剂量组（96 mg·kg^－1）及达那唑组（36 mg·kg^-1），每组10只，假手术组及模型组大鼠灌服等体积生理盐水，每日1次，连续处理15 d。评估治疗后腹腔内粘连程度；检测异位内膜体积；HE染色观察异位内膜病理形态学改变；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测大鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平；免疫组织化学技术检测异位内膜CD31、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）阳性表达；蛋白印迹法（Western blotting）法检测子宫内膜组织中B细胞淋巴瘤/白血病-xl（B-cell lymphocytoma / leukemia xl，Bcl-xl）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）蛋白的相对表达水平及JAK2、STAT3蛋白磷酸化情况。 结果 成功构建EMs大鼠模型；模型组大鼠腹腔内粘连评分升高，异位子宫内膜体积增大，间质细胞增多，结构致密，血供丰富。与假手术组比较，模型组大鼠异位子宫内膜组织中PCNA、CD31阳性细胞比例及腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6、VEGF水平均升高，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Bcl-xl蛋白高表达，Bax蛋白低表达（P<0.05）；与模型组比较，姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组及达那唑组大鼠腹腔内粘连评分均降低，异位子宫内膜体积减小（P<0.05），上皮结构不完整，间质细胞稀疏、结构松散和炎性细胞浸润，供血不足，异位子宫内膜PCNA、CD31阳性细胞比例及腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和VEGF水平降低，且异位子宫内膜组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Bcl-xl蛋白低表达，Bax蛋白高表达（P<0.05）；姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组及达那唑组对降低EMs大鼠异位子宫内膜体积、JAK2/STAT3信号通路相关因子表达及异位子宫内膜结构的病理损伤作用逐渐增强（P<0.05）。 结论 姜黄素可减小异位子宫内膜体积，增强对异位子宫内膜的损伤，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活进而降低炎性因子水平，减少细胞增殖、促进细胞凋亡并抑制血管新生有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of curcumin-mediated Janus kinase 2 （JAK2）/signal transducers and transcriptional activators 3 （STAT3） signaling pathway in endometriosis （EMs） rats. Methods Ten female Wistar rats were randomly selected as the sham operation group， and the remaining rats were randomly divided into model group， curcumin low （48 mg·kg^-1）， curcumin high dose group （96 mg·kg^-1） and danazol group （36 mg·kg^-1） after successful modeling by endometrial auto transplantation in the third estrous stage， with 10 rats in each group. Rats in sham operation group and model group were given equal volume of normal saline orally， once a day， for consecutive 15 days. The degree of intraperitoneal adhesion after treatment was evaluated. The volume of ectopic endometrium was detected. The pathological changes of ectopic endometrium were observed by HE staining. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in abdominal lavage fluid of rats were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The positive expression of CD31 and proliferating nuclear antigen （PCNA） in ectopic endometrium was detected by immunohistochemistry. The relative expression levels of B-cell lymphoma/leukemia-xl （Bcl-xl） and Bcl-2 associated X protein （Bax） and the phosphorylation of JAK2 and STAT3 proteins in endometrial tissues were detected by Western blotting. Results The EMs rat model was successfully constructed. In model group， the intraperitoneal adhesion score increased， the volume of ectopic endometrium increased， the interstitial cells increased， the structure was dense， and the blood supply was rich. Compared with the sham operation group， the proportion of PCNA and CD31 positive cells in the ectopic endometrium tissues and the levels of TNF-α， IL-6 and VEGF in the peritoneal irrigation fluid in model group were increased. The p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 ratio and the relative expression level of Bcl-xl protein were increased， while the relative expression level of Bax protein was decreased （P<0.05）. Compared with model group， the intraperitoneal adhesion score， ectopic endometrial volume decreased in curcumin low-dose， high-dose and danazol groups （P<0.05）， the epithelial structure was incomplete， the interstitial cells were sparse and loose， the inflammatory cells were infiltrated， and the blood supply was insufficient. The proportion of PCNA and CD31 positive cells in ectopic endometrium and the levels of TNF-α， IL-6 and VEGF in peritoneal perfusion fluid decreased， and the p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 ratio and relative expression of Bcl-xl protein in ectopic endometrium tissue decreased. The relative expression level of Bax protein was increased （P<0.05）. The effects of curcumin low-dose， high-dose and danazol group on reducing the volume of ectopic endometrium， the expression of JAK2/STAT3 signal pathway related factors and the pathological damage of ectopic endometrium structure in EMs rats were gradually enhanced （P<0.05）. Conclusion Curcumin could reduce the volume of ectopic endometrium and enhance the damage to ectopic endometrium. The mechanism may be related to the inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway activation， thereby reducing the level of inflammatory factors， reducing cell proliferation， promoting apoptosis and inhibiting angiogenesis.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / Janus激酶2/信号转导转录激活因子3信号通路 / 子宫内膜异位症 / 异位内膜体积

Key words

curcumin / Janus kinase 2/signal transduction transcription activator 3 signaling pathway / endometriosis / ectopic endometrial volume

子宫内膜异位症定义为具有生长功能的子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫腔以外的部位，约有10%育龄妇女患有此病^［1］。EMs病因复杂，有多种理论假设，其发病机制包括遗传易感性、免疫学改变等^［2］。EMs是一种涉及活动性细胞侵袭和迁移的疾病^［3］，与炎症反应和血管生成密切相关^［4］，Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信号转导转录激活因子3（signal transducers and transcription activators 3，STAT3）广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡及炎症反应，可在EMs中促进新生血管形成，参与疾病的发生、发展过程^［5］。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种黄色天然多酚化合物^［6］，可通过抗炎、抗增殖、抗血管生成和促凋亡等机制，发挥减轻EMs的积极作用^［7］，故本研究拟通过子宫组织自体移植构建EMs大鼠模型，观察姜黄素对异位内膜及JAK2/STAT3信号通路的影响，以期为EMs治疗药物的选择提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

伯乐680全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；FluorChem M化学发光凝胶成像系统（美国ProteinSimple公司）。

1.2 试药

姜黄素（质量分数≥98%，货号458-37-7，上海源叶生物科技有限公司）；达那唑（质量分数≥98%，货号17230-88-5，上海凯试科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA试剂盒（上海古朵生物科技有限公司）；兔抗CD31多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗JAK2、兔抗STAT3、兔抗B细胞淋巴细胞瘤/白血病-xl（B-cell lymphocytoma/leukemia xl，Bcl-xl）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）单克隆抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗p-JAK2多克隆抗体（美国Abcam公司）；兔抗p-STAT3单克隆抗体（美国CST公司）。

1.3 动物

SPF级6周龄雌性Wistar大鼠70只，体质量为（200±20） g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号为SCXK（湘）2019-0013。

2 方法

2.1 造模、分组及给药

70只大鼠于室温，相对湿度为45%~65%环境下普通饲养，12 h光-暗交替，适应性饲养1周后，每日阴道涂片确定大鼠的发情周期，选择有连续2个正常动情周期的大鼠62只，随机选取10只大鼠作为假手术组，剩余用于构建EMs大鼠模型^［8］：戊巴比妥钠30 mg·kg^-1腹腔注射麻醉，仰卧固定，加热垫维持大鼠体温，腹部消毒备皮并暴露腹腔，结扎左侧子宫角并切除，将切除的子宫角置于生理盐水中并切除浆膜层，修剪成5 mm×5 mm碎片，缝合至腹壁内侧，子宫内膜面朝向腹腔，闭合腹腔，假手术组不进行移植操作。术后前3 d连续肌肉注射庆大霉素0.1 mL，分笼常规饲养2周再次开腹，肉眼可见内膜组织生长且内有液体积聚的透明小囊，则为造模成功^［9］。成功造模大鼠43只，随机剔除3只，并用随机数字表分为模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组及达那唑组，每组10只。其中姜黄素低剂量组大鼠每日灌服48 mg·kg^-1姜黄素，姜黄素高剂量组^［10］每日灌服96 mg·kg^-1姜黄素，达那唑组^［11］每日灌服36 mg·kg^-1达那唑，假手术组及模型组大鼠每日灌服等体积生理盐水0.5 mL。连续处理15 d。

2.2 腹腔内粘连评分

给药15 d后开腹时，观察并根据Blauer评分系统对腹腔内粘连情况进行评分^［12］：无粘连计0分；薄而易分离的粘连计1分；仅限一个区域的厚粘连计2分；广泛厚粘连计3分；厚而广泛粘连加上内脏与腹壁粘连计4分。

2.3 ELISA检测相关因子水平

处死大鼠前，心脏取血，于4 °C以3 000 r·min^-1离心15 min，收集血清保存于-80 °C，用于检测血清CA125、EMAb水平；处死大鼠后于腹膜处切开小口，腹腔内注入生理盐水1 mL并轻轻摇晃以充分灌洗，收集灌洗液，以3 000 r·min^-1（离心半径10 cm）离心15 min，收集上清液以检测TNF-α、IL-6和VEGF的水平。

2.4 检测治疗后异位子宫内膜的体积

给药15 d后开腹时，用千分尺测量大鼠异位内膜组织的长（mm）、宽（mm）和高（mm），根据体积（mm³）=0.52×长（mm）×宽（mm）×高（mm）^［13］，计算治疗后异位子宫内膜囊肿的体积。

2.5 HE染色检测子宫内膜组织形态

处死大鼠，分离假手术组大鼠子宫内膜组织及造模组大鼠异位子宫内膜组织，用常规石蜡包埋并制备为厚4 μm的切片，用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，经苏木精染色5 min、曙红染色5 min，脱水固定后，用中性树脂封片，置于显微镜下观察并拍照记录。

2.6 检测CD31及PCNA抗体的阳性表达情况

CD31阳性细胞比例用于评估血管生成；PCNA阳性细胞比例用于评估增殖细胞。组织切片脱蜡、水化，用过氧化氢溶液孵育20 min淬灭内源性过氧化物酶活性，于0.01 mol·L^-1柠檬酸钠缓冲液中煮沸30 s进行抗原修复；山羊血清封闭30 min，4 °C一抗（CD31抗体以1∶200稀释，PCNA以1∶500稀释）孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中37 °C孵育1 h， 3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐孵育2 min显色，苏木素复染20 s，用乙醇及二甲苯脱水、透明、封片。随机选取5个视野，用Image-Pro Plus软件评估100个细胞内CD31与PCNA阳性细胞比例，即［CD31与PCNA阳性细胞数/100］×100%，阳性细胞见棕黄色。

2.7 检测子宫内膜组织中相关蛋白的表达情况

取各组大鼠子宫内膜组织并保存于液氮中备用。取100 mg液氮保存的样品，研钵碾碎并移入裂解液内裂解，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液。测定蛋白质量浓度并加热变性，用SDS-PAGE电泳（浓缩胶60 V，25 min；分离胶120 V，65 min）分离蛋白，转膜（200 mA，120 min），将PVDF膜于0.5 g·mL^-1脱脂乳中封闭2 h，后直接于一抗（均用1×TBST行1∶1 000稀释）内4 ℃孵育过夜；次日洗膜，于二抗（用1×TBST行1∶8 000稀释）内孵育2 h，洗膜，用ECL显影试剂显影，于化学发光凝胶成像系统中曝光并拍照记录。用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白JAK、STAT3、Bcl-xl、Bax与内参GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相对表达量，以p-JAK2/JAK、p-STAT3/STAT3评价蛋白活性。

2.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件处理数据，计量资料均以（\overline{x}±s）表示，多计量资料比较及两组间比较分别用单因素方差分析及LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 腹腔内粘连评分的比较

经观察并评分，治疗后的4组大鼠腹腔内粘连评分比较差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果显示，与模型组比较，姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组及达那唑组大鼠腹腔内粘连评分均降低（P<0.05）；而且达那唑组评分最低，姜黄素低剂量组分值最高，姜黄素高剂量组居中（P<0.05）。见表1。

3.2 大鼠异位子宫内膜体积的比较

经测量分析，治疗后的4组大鼠异位子宫内膜体积比较差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组及达那唑组大鼠异位子宫内膜体积均减小（P<0.05）；而且达那唑组体积减小最多，姜黄素低剂量组减小最少，姜黄素高剂量组居中（P<0.05）。见表2。

3.3 子宫内膜的组织形态变化的比较

HE染色结果显示，假手术组大鼠子宫内膜组织结构完整；模型组大鼠异位子宫内膜较厚，间质细胞增多，结构致密，血供丰富；与模型组比较，姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组及达那唑组大鼠异位子宫内膜组织上皮结构不完整，间质细胞稀疏，结构松散，炎性细胞浸润，供血不足。见图1。

3.4 子宫内膜组织细胞增殖情况的比较

免疫组织化学结果显示，PCNA主要表达于子宫内膜血管内皮细胞核，5组大鼠PCNA阳性细胞比例比较差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠异位子宫内膜PCNA阳性细胞比例升高（P<0.05）；与模型组比较，3个给药组及达那唑组大鼠异位子宫内膜PCNA阳性细胞比例降低（P<0.05）；达那唑组PCNA阳性细胞比例降低最多，姜黄素低剂量组细胞比例降低最少，姜黄素高剂量组居中（P<0.05）。见表3、图2。

3.5 异位子宫内膜血管生成情况的比较

免疫组织化学结果显示，CD31阳性表达主要位于血管内皮细胞中，5组大鼠CD31阳性细胞比例比较差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠异位子宫内膜CD31阳性细胞比例升高（P<0.05）；与模型组比较，3个给药组大鼠异位子宫内膜CD31阳性细胞比例降低（P<0.05）；其中达那唑组CD31阳性细胞比例降低最多，姜黄素低剂量组细胞比例降低最少，姜黄素高剂量组居中（P<0.05）。见表4、图3。

3.6 腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和VEGF水平的比较

ELISA结果显示，5组大鼠腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和VEGF水平比较差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和VEGF的水平升高（P<0.05）；与模型组比较，3个给药组大鼠腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和VEGF的水平降低（P<0.05）；达那唑组3项指数降低最多，姜黄素低剂量组降低最少，姜黄素高剂量组居中（P<0.05）。见表5。

3.7 诸项蛋白相对表达及比值情况的比较

Western blotting结果显示，5组大鼠子宫内组织中JAK2、STAT3全蛋白相对表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Bcl-xl、Bax蛋白相对表达水平比较差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠子宫内膜组织中，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Bcl-xl蛋白相对表达水平升高，Bax相对表达水平降低（P<0.05）；与模型组比较，3个给药组大鼠子宫内膜组织中，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Bcl-xl蛋白相对表达水平均降低，Bax相对表达水平升高（P<0.05）；其中达那唑组变化最显著，姜黄素低剂量组变化最小，姜黄素高剂量组居中（P<0.05）。见图4、表6。

4 讨论

根据经血逆流理论，子宫内膜经逆行移位可导致EMs形成^［14］。EMs的具体发病机制仍未明确，且病变范围较广泛，病症类型多样^［15］，根据部位，EMs可分为浅表腹膜EMs、卵巢EMs及深部EMs结节，异位内膜的生长由免疫、激素、遗传和环境介质等复杂因素相互作用所致^［16-17］。本研究中，经自体子宫内膜移植，见大鼠腹壁处肉眼可见结节样移植病灶及异位子宫内膜有血管生成的透明囊泡，表明机体存在病理反应，成功构建EMs大鼠模型。

EMs形态特征是周围组织增生、浸润和严重粘连，是与先前手术无关的粘连发展的主要潜在原因之一，局部炎症反应是粘连形成的重要因素^［18］。本研究中模型组大鼠腹腔见有严重粘连，表明子宫内膜组织的异位病变可能导致机体炎症，经检测，模型组大鼠腹腔灌洗液中促炎因子TNF-α、IL-6的水平升高，表明炎症反应发生；炎症是触发任何涉及细胞转移和侵袭疾病的主要机制之一，可调节黏附、增殖和血管生成，并为肿瘤或病变发生创造有利环境，EMs侵袭性表型与肿瘤转移具有一致性^［17］，正常情况下，细胞凋亡可阻止其侵袭及积累^［19］。本研究发现，模型组大鼠异位子宫内膜体积增大，间质细胞增多，结构致密，血供丰富，表明EMs发展可能与炎症促进子宫内皮细胞增殖、血管生成及凋亡异常相关；而经姜黄素低剂量、姜黄素高剂量治疗后，异位子宫内膜体积减小、异位子宫内膜组织发生损伤，腹腔内粘连评分及灌洗液中炎性因子TNF-α、IL-6水平均降低，表明姜黄素可能通过抑制机体不良炎性反应，减少异位子宫内膜细胞增殖、血管生成，促进细胞凋亡异常恢复，进而抑制EMs进展。

异位病灶的植入和增殖需要血管生成，VEGF是关键的刺激物^［20］。研究发现，EMs腹腔液中VEGF水平明显高于健康女性^［21］，EMs严重程度与患者腹腔液中VEGF水平呈正相关^［22］；研究中PCNA、CD31分别用于评估子宫内皮细胞细胞增殖及血管生成^［23］；另有研究发现，抗凋亡信号分子Bcl-xl在EMs组织中高表达，而促凋亡因子Bax低表达^［24］，抑制子宫内膜细胞增殖、炎症及血管生成并促进凋亡是减轻EMs的有效途径^［25］。本研究结果显示，模型组大鼠腹腔灌洗液中VEGF水平、异位子宫内膜组织中PCNA和CD31阳性细胞比例及Bcl-xl蛋白相对表达水平均显著升高，Bax蛋白相对表达水平降低，而姜黄素处理可逆转此结果，表明姜黄素抑制EMs进展与抑制异位子宫内膜增殖、血管生成及促进细胞凋亡有关。

JAK2/STAT3信号通路与细胞增殖、凋亡及炎症反应相关^［26］，同时也是参与细胞增殖、侵袭及远处转移的重要转导途径，不仅在恶性肿瘤组织中广泛存在，在异位子宫内膜中也呈异常活化状态^［27］，本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠JAK2、STAT3蛋白活化水平显著升高，表明EMs大鼠异位子宫内膜中JAK2/STAT3的激活，而经姜黄素低、高剂量治疗后，该信号通路JAK2、STAT3蛋白活化水平显著降低，表明姜黄素可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活从而减轻EMs大鼠炎症反应，减少异位子宫内膜细胞增殖、诱导凋亡，抑制血管生成进而减小异位子宫内膜体积并促进其消退。

综上所述，姜黄素可降低异位子宫内膜体积，促进其消退，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活进而减轻炎症、减少异位子宫内膜细胞细胞增殖、促进细胞凋亡并抑制血管生成有关。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划项目(201602346)