利拉鲁肽基于线粒体-细胞色素C介导心肌细胞凋亡

Liraglutide ameliorates hypoxia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocyte apoptosis via mitochondrial-cytochrome C pathway

摘要

目的 探讨利拉鲁肽在缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）处理的心肌细胞中的作用及其潜在机制。 方法 建立大鼠心肌细胞株（H9C2） H/R模型以模拟体外心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤。用四甲基偶氮唑盐［3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT］和Annexin V FITC-PI染色法测定细胞增殖和凋亡。检测细胞氧化应激产物和线粒体功能。用蛋白印迹法（Western blotting）检测细胞凋亡蛋白表达和细胞色素C的释放。 结果 利拉鲁肽保护H9C2细胞免受H/R诱导的损伤，因其可减弱H/R对H9C2细胞活力、细胞凋亡和活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的影响（P<0.05）。利拉鲁肽可保护线粒体功能并防止H/R损伤后H9C2细胞中细胞色素C的释放（P<0.05）。 结论 阐明了利拉鲁肽在治疗I/R相关心肌损伤中的潜在心血管保护作用。

Abstract

Objective To further study the role of liraglutide in cardiomyocytes treated with hypoxia/reoxygenation （H/R） and its underlying mechanism. Methods A H/R model of rat myocardial cell line （H9C2） was established to simulate myocardial ischemia/reperfusion （I/R） injury in vitro. 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide （MTT） and Annexin V FITC-PI staining methods were used to measure the cell proliferation and apoptosis. Cellular oxidative stress products and mitochondrial function were detected. Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related protein and the release of cytochrome C. Results Liraglutide protected H9C2 cells from H/R-induced damage， because the administration of liraglutide attenuated the effects of H/R on H9C2 cell viability， apoptosis and reactive oxygen species （ROS） production （P<0.05）. More importantly， liraglutide protected mitochondrial function and prevented the release of cytochrome C in H9C2 cells after H/R injury （P<0.05）. Conclusion These results revealed the potential cardiovascular protective effects of liraglutide in the treatment of I/R-related myocardial injury.

Graphical abstract

关键词

利拉鲁肽 / 缺氧/复氧 / 线粒体-细胞色素C / 心肌细胞株 / 凋亡

Key words

liraglutide / hypoxia/reoxygenation / mitochondria-cytochrome C / H9C2 / apoptosis

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤已成为心肌梗死后心肌病理改变的主要原因之一^［1-2］，其发病机制涉及多种因素和机制。

利拉鲁肽是胰高血糖素样肽（glucagon-likepeptidel，GLP-1）类似物，是临床治疗2型糖尿病的新型药物。研究证明利拉鲁肽具有降低血脂、改善内皮细胞功能、缩小心肌梗死面积和改善心功能等作用^［3-5］。

缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）是I/R阶段的重要病理过程。本研究为了模拟体外心肌I/R损伤，在H9C2细胞中建立了H/R模型，研究利拉鲁肽对H/R处理的H9C2细胞的保护作用，并探讨其潜在的分子机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MIC-101培养箱（美国Billups-Rothenberg公司）；流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）。

1.2 试药

DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清、100 μg·mL^-1青霉素/链霉素（美国Invitrogen公司）；利拉鲁肽（丹麦诺和诺德公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒、JC-1、RIPA缓冲液均购自上海碧云天生物技术公司；乳酸脱氢酶（lLDH）和肌酸激酶（CK）比色测定试剂盒、ATP检测试剂盒均购自中国南京建成生物工程研究所；PVDF膜（美国Millipore公司）；一抗［B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、细胞色素C、细胞色素c氧化酶 Ⅳ（cytochrome c oxidase Ⅳ，COX Ⅳ）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cleaved caspase-9，c-caspase-9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3，c-caspase-3），兔抗鼠一抗均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）偶联的二抗（山羊抗兔）、ATP合酶活性微孔板测定试剂盒、细胞线粒体分离试剂盒均购自英国Abcam公司；电化学发光-Plus检测试剂（美国Santa Cruz公司）。

1.3 细胞

大鼠H9C2心肌细胞（美国ATCC细胞库）。

2 方法

2.1 细胞处理

在37 ℃、体积分数为5%的二氧化碳条件下，将大鼠H9C2心肌细胞转移至DMEM培养基，并补充100 g·L^-1胎牛血清和100 μg·mL^-1青霉素/链霉素进行培养。缺氧条件是通过将H9C2细胞培养在缺乏血清和葡萄糖的DMEM中，然后放入充满体积分数为5%的二氧化碳、体积分数为95% 的氮气和体积分数为1%的氧气的MIC-101培养箱中培养实现。孵育6 h后，将H9C2细胞转移至正常条件复氧12 h，H/R处理前24 h，H9C2细胞分别用10、100、1 000 nmol·L^-1的利拉鲁肽预处理。将在常氧条件下处理的细胞作为对照。

2.2 细胞活力和细胞凋亡的测定

用CCK-8法测定细胞活力，Annexin V FITC-PI染色测定细胞凋亡。对于细胞活力，将H9C2细胞以每孔5×10³的密度接种在96孔板中24 h，用利拉鲁肽预处理，然后暴露于H/R。用CCK-8试剂盒通过酶标仪在450 nm波长处评估细胞活力。对于细胞凋亡，将H9C2细胞铺在6孔板上，并用利拉鲁肽预处理，进行H/R处理。然后收集细胞，用PBS洗涤，重悬于结合缓冲液中。细胞用Annexin V FITC和PI处理，在暗室中放置15 min，用流式细胞仪进行分析。

2.3 ROS的测定

用ROS测定试剂盒测定细胞内ROS。处理后，H9C2细胞与10 μmol·L^-1 DCFH-DA在37 ℃暗室中孵育20 min。收集细胞，并用流式细胞术检测DCFH-DA荧光值。

2.4 LDH、CK、ATP和ATP合酶活性的测定

用比色测定试剂盒分析细胞上清液（0.2 mL）中的LDH和CK。用ATP检测试剂盒测量ATP含量。用ATP合酶活性微孔板测定试剂盒测定ATP合酶的活性。

2.5 线粒体膜电位的测定

如文献^［6］所述，H9C2心肌细胞的线粒体膜电位（mitochondria transmembrane potential，ΔΨm）通过染料JC-1测量。ΔΨm的损失通过红色荧光与绿色荧光的相对荧光单位（relative fluorescence units，RFU）的比率来反映。

2.6 蛋白印迹法（Western blotting）

参照文献^［7］的方法，通过RIPA缓冲液从细胞中分离总蛋白，并用BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白质质量浓度。细胞裂解物通过体积分数为12%的 SDS-PAGE凝胶电泳，并将其电转移到PVDF膜上。与50 g·L^-1 脱脂牛奶孵育后，随后将膜在4 ℃下用一抗孵育过夜。然后将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1 h。通过电化学发光-Plus检测试剂可视化结合信号，并用Image J软件量化条带强度。以GAPDH作为内参。

2.7 线粒体和胞质蛋白分离

如文献^［8］所述，为检测细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，按照细胞线粒体分离试剂盒的说明书操作，分离线粒体和细胞质，提取细胞溶质和线粒体部分的样品，然后进行Western blotting实验。

2.8 统计学方法

GraphPad Prism 6.0软件用于所有统计分析。所有数据均以（\overline{x} ± s）表示，并用未配对的独立样本t检验（双尾）分析组间差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 利拉鲁肽增加H/R损伤后H9C2的细胞活力

利拉鲁肽增加I/R损伤后H9C2细胞活力情况见表1。由表1可知，H/R处理后，存活的H9C2细胞显著减少。与H/R处理的细胞比较，利拉鲁肽处理的H9C2细胞的细胞活力呈剂量依赖性增加（P<0.05）。此外，通过测量细胞上清液中LDH和CK的释放确定心肌细胞损伤情况。H/R处理细胞中LDH和CK的释放显著增加（P<0.05）。以上结果表明，利拉鲁肽处理可增加I/R损伤后H9C2细胞活力，表明利拉鲁肽以剂量依赖性方式在H9C2细胞中发挥保护作用，防止H/R损伤。

3.2 利拉鲁肽抑制H/R诱导的H9C2细胞凋亡

为研究利拉鲁肽是否保护H9C2心肌细胞免受H/R诱导的细胞凋亡，用Annexin V-FITC/PI双染检测细胞，结果见表2、图1。由表2可知，与对照组比较，H/R组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），而用10、100、1 000 nmol·L^-1利拉鲁肽素预处理的H9C2细胞的凋亡率显著降低（P<0.05）。通过Western blotting分析促凋亡因子Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。与对照组比较，H/R组Bax表达水平显著增加，Bcl-2表达水平降低，Bcl-2/Bax降低（P<0.05）；与H/R组比较，利拉鲁肽10、100、1 000 nmol·L^-1组Bax表达水平显著降低，Bcl-2表达水平升高，Bcl-2/Bax升高（P<0.05）。

3.3 利拉鲁肽抑制H/R诱导的H9C2细胞ROS的产生

与对照组［（1.00±0.04）］比较，H/R组ROS水平［（2.80±0.04）］显著增加（P<0.05）；与H/R组比较，利拉鲁肽10、100、1 000 nmol·L^-1组ROS水平［（2.55±0.04）、（2.13±0.06）、（1.85±0.04）］以剂量依赖性方式逐渐降低（P<0.05）。

3.4 利拉鲁肽保护H9C2细胞H/R损伤后的线粒体功能

为阐明利拉鲁肽在H/R处理的H9C2细胞中的抗凋亡作用机制，研究了线粒体功能。利拉鲁肽保护I/R诱导的H9C2细胞损伤后线粒体功能变化见表3。由表3可知，H/R后，H9C2细胞中发现ΔΨm损失增加（P<0.05），表明线粒体可能与H/R诱导的细胞凋亡有关。然而，当用利拉鲁肽处理细胞时，ΔΨm中的这种效应以剂量依赖性方式恢复（P<0.05）。与此同时，利拉鲁肽逆转H9C2细胞免受H/R诱导的ATP水平降低（P<0.05）。H/R后ATP合酶的活性显著降低，用利拉鲁肽处理可产生逆转（P<0.05）。

3.5 利拉鲁肽防止H9C2细胞H/R损伤后细胞色素C的释放

细胞色素C从线粒体向细胞质的释放是细胞凋亡途径中的一个重要标志。实验结果显示，在H/R处理的细胞中细胞色素C从线粒体中的释放增强（P<0.05），且在利拉鲁肽处理后细胞质中的细胞色素C以剂量依赖性方式显著减少（P<0.05）。细胞色素C的释放会激活caspase-9和caspase-3。本研究结果也表明，H/R处理显著增加了活化的caspase-9和caspase-3的蛋白水平，用利拉鲁肽处理可减弱（P<0.05）。见表4。

4 讨论

细胞凋亡在心肌I/R损伤的进程中发挥关键作用^［9-11］，有学者在急性心肌梗死后的心脏梗死区发现大面积细胞凋亡^［12］，揭示了利拉鲁肽可通过调节细胞自噬改善CoCl₂诱导的H9C2细胞氧化应激和细胞凋亡^［13］。凋亡诱导可以由许多基因决定，特别是Bax和Bcl-2之间的平衡^［14］。本研究表明，利拉鲁肽可剂量依赖性地增强H9C2细胞活力并抑制I/R损伤后的细胞凋亡，并且在I/R损伤后利拉鲁肽处理的H9C2细胞中Bax的表达降低且Bcl-2水平增加。表明利拉鲁肽可能是治疗心肌I/R损伤诱导的细胞凋亡的一种有前景的干预措施。

ROS的产生参与心肌细胞凋亡的调节，并与心肌I/R损伤的发病程度呈正相关^［15］。因此，抗氧化剂已被建议用于治疗心肌I/R损伤。利拉鲁肽减弱H/R处理的H9C2细胞中ROS的增加。线粒体已被确定为ROS的主要来源，过多的ROS生成会引发线粒体功能障碍和线粒体膜损伤^［16-17］。本实验也确定了利拉鲁肽对线粒体功能具有保护作用。

心肌细胞富含大量线粒体。由于线粒体膜通透性增加，细胞色素C从线粒体释放到细胞质从而引起细胞凋亡^［18］。因此，心肌细胞中线粒体功能的恢复被认为是减轻心肌I/R损伤的关键因素。据ZHANG L等^［19］研究报道，利拉鲁肽可以保护心肌细胞免受IL-1β诱导的线粒体膜电位降低和ATP减少的影响。本研究结果表明，利拉鲁肽保护线粒体功能并阻止I/R损伤后H9C2细胞中细胞色素C的释放，推测利拉鲁肽在H/R诱导H9C2的细胞中的抗凋亡作用可能与线粒体信号转导有关。通过细胞色素C的释放诱导caspase-9的激活，进而进一步促进caspase-3的激活，caspase-3是执行细胞凋亡的关键蛋白酶^［20］，最终在心肌的I/R损伤中引发细胞凋亡。研究数据显示，利拉鲁肽可有效下调I/R损伤后H9C2细胞中c-caspase-9和c-caspase-3的水平。

综上所述，本研究证明了利拉鲁肽可以通过线粒体细胞色素C途径对H/R诱导的心肌细胞损伤产生保护作用。尽管仅在体外模型中确定了其保护作用，但利拉鲁肽可能成为心肌I/R损伤的治疗策略。未来的研究将会通过体内试验进一步验证利拉鲁肽的作用。

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基金资助

2021河北省卫健委立项课题项目(20211484)