夏枯草抑制人胃癌细胞上皮间质化的机制

Mechanism of Prunella vulgaris inhibiting epithelial mesenchymal transitions of human gastric cancer cells

摘要

目的 探讨夏枯草对胃癌细胞上皮间质化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）的抑制作用及其可能的作用机制。 方法 选取人胃癌细胞株HGC-27，将细胞随机分为对照组及夏枯草低、中、高剂量组（20、40、80 μg·mL^-1 夏枯草提取物）。用四甲基偶氮唑盐［3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazolium bromide，MTT］法检测细胞增殖抑制率；划痕实验检测细胞迁移率；Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；反转录∙聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测miR-155、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和β连环蛋白（β-catenin）mRNA表达情况；蛋白质印迹法（Western blotting）检测GSK-3β、β-catenin、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和锌指蛋白（Snail）表达情况。 结果 与对照组比较，夏枯草3组胃癌细胞增殖抑制率、GSK-3β mRNA、GSK-3β和E-cadherin蛋白表达水平升高，细胞迁移率、细胞侵袭数量、miR-155、β-catenin mRNA水平、β-catenin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表达水平降低（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中剂量组、夏枯草高剂量组胃癌细胞增殖抑制率、GSK-3β mRNA、GSK-3β和E-cadherin蛋白的表达水平升高，细胞迁移率、细胞侵袭数量、miR-155、β-catenin mRNA水平、β-catenin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表达水平降低（P<0.05），夏枯草高剂量组诸项指数变化尤其明显（P<0.05）。 结论 夏枯草对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭有一定的抑制作用，并能有效阻断胃癌细胞发生EMT，可能是通过降低miRNA-155表达水平、抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of Prunella vulgaris on epithelial mesenchymal transitions （EMT） of gastric cancer cells and its possible mechanism. Methods Human gastric cancer cell line HGC-27 was selected and the cells were randomly divided into control group， low， medium and high doses of Prunella vulgaris groups （20， 40 and 80 μg·mL^-1Prunella vulgaris）. The inhibition rate of cell proliferation was detected by 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazolium bromide （MTT） assay. The cell mobility was detected by scratch test. The invasion ability of cells was detected by Transwell chamber experiment. The levels of miR-155， glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） and β‍-catenin mRNA expression were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The levels of GSK-3β， β-catenin， E-cadherin， N-cadherin， Vimentin and Snail protein expression were detected by Western blotting. Results Compared with the control group， the inhibition rate of gastric cancer cell proliferation， the levels of GSK-3β mRNA expression， GSK-3β and E-cadherin protein expression were increased， the cell migration rate， the numbers of cell invasion， the levels of miR-155， β-catenin mRNA expression， β-catenin， N-cadherin， Vimentin and Snail protein expression were decreased in low， medium and high doses of Prunella vulgaris groups （P<0.05）. Compared with the low dose group of Prunella vulgaris， the proliferation inhibition rate of gastric cancer cells， the expression levels of GSK-3β mRNA， GSK-3β and E-cadherin proteins increased， and the cell migration rate， the number of cell invasions， the mRNA levels of miR-155 and β-catenin mRNA， β-catenin， N-cadherin， Vimentin and Snail proteins expression increased in the medium dose and high dose groups of Prunella vulgaris （P<0.05）. The indexes of high dose of Prunella vulgaris group changed significantly （P<0.05）. Conclusion Prunella vulgaris has a certain inhibitory effect on the proliferation， migration and invasion of gastric cancer cells， and can effectively block the EMT of gastric cancer cells， possibly by reducing the expression of mirna-155 and inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway plays a role.

Graphical abstract

关键词

夏枯草 / miR-155 / 胃癌细胞 / 上皮间质化 / 糖原合成酶激酶-3β / β连环蛋白

Key words

Prunella vulgaris / miR-155 / gastric cancer cells / epithelial mesenchymal transitions / glycogen synthase kinase-3β / β catenin

胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，胃癌的治疗包括手术、化疗药物与放射治疗相结合辅助治疗方式等^［1-2］。夏枯草是提取自唇形科植物夏枯草干燥果穗的有效活性成分，具有降压、降血糖、抗炎、抗肿瘤和提高机体免疫力等药理作用，临床常用于治疗高血压病、肝气腹痛等^［3-5］。研究发现，夏枯草可直接或间接影响肿瘤细胞上皮间质化（epithelial mesenchymal transitions， EMT）相关致癌通路，如分泌型糖蛋白（secretory glycoprotein， Wnt）/β连环蛋白（β-catenin）信号通路，从而发挥抗肿瘤作用^［6］。因此，本研究通过检测不同质量浓度夏枯草对胃癌细胞HGC-27增殖、迁移侵袭和EMT的影响，探讨其可能的作用机制，为临床治疗胃癌提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ND-100分光光度计（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HF-90型CO₂恒温细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司）。

1.2 试药

夏枯草提取物（规格20∶1，西安莱保生物科技有限公司）；β-actin多克隆抗体、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthetase kinase， GSK-3β）、β-catenin、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、锌指蛋白（Snail）抗体和山羊抗兔二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）均购自美国Abcam公司；RPMI1640细胞培养基、10 g·L^-1胎牛血清、氨苄青霉素、硫酸链霉素和胰蛋白酶均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 细胞株

人胃癌HGC-27细胞株，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

2 方法

2.1 细胞培养

取人胃癌HGC-27细胞株培养于含有100 g·L^-1胎牛血清和双抗（青霉素/链霉素）的RPMI-1640细胞培养基中，置于37 ℃、含有体积分数5% CO₂的恒温培养箱中培养24 h。

2.2 细胞分组

将人胃癌HGC-27细胞株随机分为对照组及夏枯草低、中、高剂量组。于显微镜下观察细胞状态，确认细胞生长状态良好且密度约为体积分数90%时即可加药，夏枯草低、中、高剂量组分别加入20、40、80 μg·mL^-1 夏枯草提取物^［7-8］，对照组加入等量完全培养基，加药后继续置于37 ℃、含有体积分数5% CO₂的恒温培养箱中培养24 h。

2.3 四甲基偶氮唑盐［3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazolium bromide，MTT］法检测细胞的增殖抑制率

用MTT实验检测细胞增殖能力，取处于对数生长期的HGC-27细胞加入0.25 g·L^-1胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为10⁵个·mL^-1，将细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，设置5个复孔。按照2.2项下方法给药培养，在24、48 h后取出96孔板，每孔加入含有0.5 mg·mL^-1 MTT溶液100 μL，继续培养4 h，再加入DMSO溶解液孵育过夜。用酶联免疫检测仪于波长450 nm处检测各孔吸光度（A）值，评估细胞增殖能力并计算细胞增殖抑制率，实验重复3次。细胞增殖抑制率（%）=（1-夏枯草各剂量组A值/对照组A值）×100%。

2.4 划痕实验检测细胞迁移能力

将HGC-27细胞按照2.2项下方法给药培养24 h后，取对数生长期HGC-27细胞接种于6孔板中（细胞密度为10⁵个·孔^-1），待细胞融合率至90%时，用200 μL无菌移液枪头尖端轻轻刮过细胞（穿过孔中心），冲洗散落细胞加入新鲜培养基继续培养24 h，分别于0、24 h显微镜下观察划痕并拍照，分析细胞迁移能力，计算细胞迁移率，实验重复3次。细胞迁移率（%）=［（0 h划痕距离-24 h划痕距离）/0 h划痕距离］×100%。

2.5 Transwell检测细胞侵袭能力

HGC-27细胞按照2.2项下方法给药培养24 h后，收集HGC-27细胞制备密度为10⁵个·mL^-1的细胞悬液，接种于铺满Matrix胶稀释液Transwell小室的上室内，在小室的下室内加入600 μL 10 g·L^-1胎牛血清培养液，置于37 ℃、含有体积分数5% CO₂恒温培养箱中培养24 h。取出小室并吸干上室中的培养液，用体积分数95%乙醇溶液固定20 min，再用PBS溶液清洗2次，滴加结晶紫染液染色10 min，PBS溶液清洗后在光学显微镜下拍照、观察并统计细胞数量，实验重复3次。

2.6 反转录∙聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测mRNA的表达水平

按照TRIzol试剂盒说明书操作提取胃癌细胞HGC-27中的总RNA，鉴定RNA质量与纯度后用反转录试剂盒合成cDNA。配制PCR反应体系（20 μL）：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Reaction Mix 10 μL，ddH₂O 7 μL。反应条件：95 ℃ 5 s，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，循环40次。以2^-△△CT法计算目的基因相对内参表达量。引物序列为miR-155-F（5′⁃ACACTCCAGCTGTAAACATCCT-3′‍），miR-155-R（5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′）；U6-F（5′-CGTTCACGCATCTTTAAAATTGGA-3′），U6-R（5′-TTATGCGTGTCATCCTTGCG-3′）；GSK-3β-F（5′-ATGGCAGCAAGGTAACCACAG-3′），GSK-3β-R（5′-TCTCGGTTCTTAAATCGCTTGTC-3′）；β-catenin-F（5′-ATGGCAGCAAGGTAACCACAG-3′），β-catenin-R（5′-TCTCGGTTCTTAAATCGCTTGTC-3′）；β-actin-F（5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′），β‍-actin-R（5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′）。

2.7 蛋白印迹法（Western blotting）检测蛋白表达量

取胃癌细胞HGC-27，加入RIPA裂解液500 μL 提取总蛋白，冰上孵育30 min，4 ℃下以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液。BCA法检测蛋白质量浓度，确定蛋白上样量，配制好分离胶与浓缩胶后加入蛋白40 μg，恒压80 V电泳30 min，恒压120 V电泳至溴酚蓝到达底部。将其转至PVDF膜上，加入含有脱脂奶粉的封闭液，置于摇床中封闭2 h，弃液加入TBST冲洗，再加入1∶2 000稀释一抗，于4 ℃孵育过夜，TBST冲洗后加入1∶5 000稀释标记二抗室温下封闭2 h，用TBST清洗，滴加化学发光剂进行显影。采集图像，以β-actin为内参，计算待测蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计量数据以（\overline{x}±s）表示，用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多组间比较，LSD-t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 胃癌细胞增殖抑制率的比较

低、中、高剂量夏枯草作用于胃癌HGC-27细胞24、48 h后，与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞增殖抑制率均升高（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中、高剂量组胃癌细胞增殖抑制率均升高（P<0.05），夏枯草高剂量组升高更显著（P<0.05）。与24 h比较，48 h后夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞增殖抑制率均升高（P<0.05）。见表1。

3.2 胃癌细胞迁移能力的比较

与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞迁移率均降低（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中、高剂量组胃癌细胞迁移率均降低（P<0.05），夏枯草高剂量组降低得更显著（P<0.05）。见表2、图1。

3.3 胃癌细胞侵袭能力的比较

与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞侵袭数量均减少（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中、高剂量组胃癌细胞侵袭数量均减少（P<0.05），夏枯草高剂量组减少得更显著（P<0.05）。见图2、表3。

3.4 miR-155、GSK-3β、β-catenin mRNA水平的比较

与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞中miR-155表达、β-catenin mRNA表达水平均降低，GSK-3β mRNA的表达水平均升高（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中、高剂量组胃癌细胞中miR-155、β-catenin mRNA表达水平均降低，GSK-3β mRNA的表达水平均升高（P<0.05），夏枯草高剂量组诸项指数变化更显著（P<0.05）。见表4。

3.5 Wnt/β-catenin通路相关蛋白水平的比较

与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞中GSK-3β蛋白表达水平均升高，β-catenin蛋白表达水平均降低（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中、高剂量组胃癌细胞中GSK-3β蛋白表达水平均均升高，β-catenin蛋白表达水平均降低（P<0.05），夏枯草高剂量组诸项指标变化更显著（P<0.05）。见表5、图3。

3.6 EMT相关蛋白水平的比较

与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组胃癌细胞中的E-cadherin蛋白表达水平均升高，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表达水平均降低（P<0.05）。与夏枯草低剂量组比较，夏枯草中、高剂量组胃癌细胞中的E-cadherin蛋白表达水平均升高，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达水平均降低（P<0.05），夏枯草高剂量组各种蛋白的表达水平变化更显著（P<0.05）。见图4、表6。

4 讨论

本研究用不同质量浓度夏枯草处理体外培养的胃癌细胞HGC-27，从分子机制上探讨夏枯草对胃癌细胞增殖、迁移侵袭和EMT的影响。结果显示，在MTT实验、划痕实验和Transwell小室实验中，夏枯草低、中、高剂量组与对照组比较，胃癌细胞增殖抑制率均显著升高，细胞迁移率和侵袭细胞数量均处于下降趋势。表明在给予不同质量浓度夏枯草处理后，胃癌细胞HGC-27的生长活性受到抑制，且在高质量浓度（80 μg·mL^-1）夏枯草作用下抑制作用更明显。

EMT是一种癌症细胞在病理状态下由上皮样细胞向间质细胞转化的过程，在恶性肿瘤发展的各个阶段均起关键作用^［9-10］。主要表现为上皮细胞表型特征逐渐减少、消失，细胞极性消失且黏附力下降，而间质细胞表性特征逐渐凸显^［11］，肿瘤细胞基底膜降解且细胞外基质重构，细胞生物学行为（如细胞迁移、侵袭能力）增强^［12-13］。微小RNA是一类内源性非编码小分子单链RNA的总称，长度多为19~22个核苷酸，在基因调控中的转录过程发挥着重要作用，参与细胞的增殖、分化转移和凋亡等多种生理活动^［14］。研究报道，miRNA可直接调控EMT过程，在肿瘤发展过程中扮演着重要角色，miRNA-155在胃癌组织中的表达水平远高于癌旁组织^［15］。多项研究报道，多个致癌信号通路均参与到EMT中，Wnt/β-catenin信号通路就是其中之一^［16-17］。在正常生理条件下，Wnt蛋白缺失且β-catenin降解，信号通路并无活性，当受到异常表达的miRNA-155刺激后，Wnt配体与低密度脂蛋白受体相关蛋白结合^［18］，促使GSK-3β形成的蛋白复合物降解，β-catenin蛋白在细胞质中累积，与转录因子相互作用，启动下游原癌基因，调控癌症细胞的增殖、分化和转移等过程^［19］。ZHANG Y等^［20］研究发现，在胃癌组织中检测到异常表达的miRNAs，可能与Wnt/β-catenin信号通路息息相关，抑制该信号通路可有效降低肿瘤转移率。在本研究中，与对照组比较，夏枯草低、中、高剂量组细胞中miRNA-155表达水平均降低，GSK-3β mRNA和蛋白表达水平均升高，β-catenin mRNA和蛋白表达水平均降低。此外，上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平升高，间质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达水平降低，表明夏枯草可能通过抑制胃癌细胞内miRNA-155表达，降低GSK-3β、β-catenin蛋白水平，阻断Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制胃癌细胞中的EMT过程。表明夏枯草可以通过阻碍胃癌细胞发生EMT，降低细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，夏枯草对胃癌细胞HGC-27增殖、迁移和侵袭有一定的抑制作用，并能有效抑制胃癌细胞发生EMT，可能是通过降低miRNA-155表达、抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，为临床治疗胃癌提供实验依据。

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基金资助

河南省医学科学研究课题计划项目(20210941)