基于星点设计-效应面法联用正交设计优选抗骨质疏松颗粒的制剂工艺

Optimization the preparation process of Anti-osteoporosis Granules based on CCD-RSM and orthogonal experimental design

摘要

目的 用星点设计-效应面法（CCD-RSM）联用正交实验设计优选抗骨质疏松颗粒的制剂工艺。 方法 以溶媒用量、煎煮时间为考察因素，以有效成分补骨脂素、异补骨脂素总量和干膏收率的总评“归一值”（optical density，OD）为评价指标，用CCD-RSM确定最佳提取工艺；以颗粒溶化性、吸湿率、水分、成型率、休止角为评价指标，用正交实验优选最佳成型工艺。 结果 最佳提取工艺为加水量12倍，提取2次，每次130 min；成型工艺为浸膏与辅料的比例为1∶2，可溶性淀粉与糊精的比例为1∶3，用体积分数为90%的乙醇制粒，75 ℃干燥，过16目筛整粒，即得。 结论 优选的制剂工艺条件稳定、可行，可为抗骨质疏松颗粒的实际生产提供依据。

Abstract

Objective To optimize the preparation process of Anti-osteoporosis Granules by central composite design-response surface method （CCD-RSM） and orthogonal experimental design. By taking solvent dosage and decocting time as the factors，the total concentration of effective components （the sum of psoralen and isopsoralen） and the overall desirability value （OD） of dry extract as the evaluation index，the optimal extraction process was determined by CCD-RSM. By taking solubility，moisture absorption rate，moisture，molding rate，and the angle of repose as the evaluation index，the best formalizing process was optimized by orthogonal experiment. Results The optimal extraction process was determined as follows：solvent dosage 12 times，extracted for 2 times and the decocting time 130 minutes；the optimal molding process was determined as follows：extract∶excipient=1∶2，soluble starch∶dextrin=1∶3，granulated with 90%vol ethanol，dried at 75 ℃，and sieved with a 16 mesh sieve again. Conclusion The optimized preparation process is stable and feasible，which can provide the basis for the actual production of Anti-osteoporosis Granules.

Graphical abstract

关键词

抗骨质疏松颗粒 / 补骨脂素 / 异补骨脂素 / 星点设计-效应面法 / 正交实验设计

Key words

Anti-osteoporosis Granules / psoralen / isopsoralen / central composite design-response surface method / orthogonal design

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种常见的全身性骨骼疾病，以骨量低、骨组织微结构损坏、易发生骨折为基本特征，且与年龄增长密切相关。近年来，中医药在OP防治中的作用逐渐成为研究的热点^［1-6］。抗骨质疏松颗粒由盐补骨脂、川牛膝、肉苁蓉等药味组成，具有温脾肾、补阳气的功效，其中君药补骨脂含有的香豆素类和黄酮类成分有抗骨质疏松的作用，且不良反应少^［7-9］。本实验根据药物理化性质，用星点设计-效应面法（CCD-RSM）与正交设计，以补骨脂素、异补骨脂素总量、干膏收率、颗粒的物性特征等作为评价指标，优选抗骨质疏松颗粒的制剂工艺，为该制剂的后续研究提供实验依据与参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-600型高效液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；SL302型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；PWC-124型电子分析天平（武汉艾德姆衡器武汉有限公司）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

盐补骨脂（产地云南）、川牛膝（产地四川）、肉苁蓉（产地内蒙古）、当归（产地甘肃）、盐巴戟天（产地广东）、威灵仙（产地河北），均购自四川新荷花中药饮片股份有限公司；鸡血藤（产地广西，四川千方中药股份有限公司）；可溶性淀粉（成都金山化学试剂有限公司）；糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素，均购自成都科隆化学品有限公司。补骨脂素对照品（质量分数>98%）、异补骨脂素对照品（质量分数>98%），均购自成都曼思特科技有限公司。其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 补骨脂素、异补骨脂素含量的测定

2.1.1 色谱条件

参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版一部“补骨脂”项下方法测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（55∶45）为流动相；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为246 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.1.2 混合对照品溶液的制备

分别取经105 ℃干燥至恒质量的补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释到刻度。取1 mL溶液，置于50 mL量瓶中，用甲醇定容。制成每1 mL含22.2 μg补骨脂素、20.4 μg异补骨脂素的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取制得的样品水提取液5 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，以15 000 r·min^-1离心10 min。取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线

分别精密吸取“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液2、4、6、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，以甲醇定容，配制成系列质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定。以对照品质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），绘制补骨脂素和异补骨脂素标准曲线。补骨脂素标准曲线为y₁=138.00x₁+8.700，r=0.999 9，进样量在4.44~22.2 μg·mL^-1范围内线性关系良好；异补骨脂素标准曲线为y₂=80.686x₂+0.400，r=0.999 9，进样量在4.08~20.4 μg·mL^-1范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度实验

精密吸取“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，按照“2.1.1”项下色谱条件测定。计算得补骨脂素、异补骨脂素的RSD值分别为0.95%、1.33%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 重复性实验

精密量取6份同批供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定。计算得补骨脂素、异补骨脂素含量的RSD值分别为1.32%、1.44%，表明该方法的重复性好。

2.2.4 稳定性实验

精密吸取同一份供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12 h取样，按照“2.1.1”项下色谱条件测定。计算得补骨脂素、异补骨脂素峰面积的RSD值分别为0.88%、0.79%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率实验

精密吸取6份已测定含量的供试品溶液5.0 mL，置于10 mL量瓶中，分别精密加入“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液适量，用甲醇定容。测得补骨脂素、异补骨脂素的平均回收率分别为98.53%、99.42%，RSD值分别为0.97%、1.27%。

2.3 干膏收率测定

量取25 mL水提取液，置于干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱中干燥3 h后取出，移至干燥器中，冷却至室温，迅速精密称定，计算干膏率。

2.4 单因素实验

2.4.1 溶媒用量

按照处方量称取5份饮片，每份约100 g。分别加入4、6、8、10、12倍量的水，浸泡30 min，煎煮1.5 h，静置30 min，用纱布过滤，得滤液。再向残渣中加入对应倍量的水，重复上述操作。合并滤液，并浓缩至500 mL，得到样品水提取液。按照“2.1.3”项下方法制成供试品溶液。按照“2.1.1”项下色谱条件测定补骨脂素、补骨脂素含量，计算水提取液中有效成分的总浓度，绘制“溶媒用量-有效成分总浓度”曲线。结果显示，随着溶媒用量的增加，有效成分总浓度先增高后趋于平缓，加入10倍水时为最高点，加入12倍水时略有下降，故选择溶媒用量8~12倍为星点实验的考察范围。

2.4.2 煎煮时间

按照处方量称取5份饮片，每份约100 g。加入8倍量水，浸泡30 min。分别煎煮0.5、1、1.5、2、2.5 h，静置30 min，用纱布过滤，得滤液。再向残渣中加入8倍量的水，重复上述操作。合并滤液，并浓缩至500 mL，得到样品水提取液。按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液。按照“2.1.1”项下色谱条件测定补骨脂素、补骨脂素含量，计算得水提取液中有效成分的总浓度，绘制“煎煮时间-有效成分总浓度”曲线。结果显示，有效成分总浓度在煎煮时间为2 h时达到最高点，故选择煎煮时间1.5~2.5 h为星点实验的考察范围。

2.4.3 提取次数

因提取次数为非连续变量，回归处理较为困难，参考文献和临床用药实际情况，提取次数拟设定为2次^［10-12］。

2.5 CCD-RSM优选提取工艺

2.5.1 实验设计

根据CCD-RSM原理，结合单因素实验结果（溶媒用量为7.17~12.83倍、煎煮时间为77~162 min）进行2因素5水平实验，因素水平见表1；以有效成分总浓度和干膏率为评价指标，每个指标均标准化地用Hassan法分别转换为0~1的总评“归一值（optical density，OD）”，计算公式为OD_i＝（d₁×d₂×……×d_n ）^1/n，n为指标数，转换公式为d_max=（X_i-X_min）/（X_max-X_min）。星点设计实验安排及结果见表2。

2.5.2 模型拟合

将所得数据用Design Expert 11进行效应面分析，对各因素的OD值（y）进行多元线性回归和多元二项式拟合。多元线性回归方程为y=0.396 3+0.231 9A+0.067 9B（R=0.697 5，P<0.05），多元二项式拟合的方程为y=0.574 9+0.231 9A+0.067 9B+0.034 2AB-0.123 2A²-0.167 1B²（R=0.877 2，P=0.034 0<0.05），由二者的R值可知，多元二项式拟合的效果优于多元线性回归，故选择多元二项式拟合进行提取工艺优化。

2.5.3 方差分析

多元二项式模型拟合的方差分析结果见表3。由表3可知，F值为4.67，且F的概率P＝0.034 0<0.05，可以判断模型是显著的。多元二项式回归方程失拟检验P=0.400 1，表明未知因素对实验结果干扰很小，由于误差导致模型拟合程度不佳的可能性很小，该方程可较好地反映OD值与溶媒用量、煎煮时间的关系。溶媒用量（A）对提取工艺的影响大于煎煮时间（B）对提取工艺的影响。对各变量分别进行显著性检验，其中，溶媒用量（A）的P=0.007 8<0.01，表明其影响具有高度显著性，二次项B²的P=0.042 4，表明其影响显著。

2.5.4 效应面优化和预测

用Design Expert 11软件绘制OD值与各自变量间的三维效应曲面图和等高线图，见图1。当溶媒用量在8~12倍，煎煮时间在90~150 min，在以上区间内的OD值选择最大值时，得到最佳提取工艺参数为溶媒用量11.967倍，煎煮时间为129.144 min。结合生产情况，最优提取工艺定为溶媒用量12倍，煎煮时间为130 min。提取2次。

2.5.5 提取工艺验证实验

按照处方比例称取各饮片，每份约100 g，称取3份，按照“2.5.4”项下确定的最优提取工艺提取。3次实验结果的平均OD值为0.866，方程预测OD值为0.843，相对偏差为2.79%，表明本实验拟合的模型能较好地反映OD值与各考察因素的关系，所建立的数学模型有良好的预测性，所选工艺条件重复性良好。

2.6 浓缩工艺

为简化流程、节约工时，同时考虑药材中化学成分的性质，药材经水提取后所得的水提取液，用常压浓缩至相对密度为1.20~1.30（70~80 ℃）的流浸膏，即得。

2.7 成型工艺的研究

2.7.1 颗粒制备

取流浸膏适量，按一定比例与辅料混合均匀，制软材，过16目筛制粒，置于75 ℃烘箱中干燥30 min，整粒，即得。

2.7.2 评价指标

颗粒剂外观、溶化性、水分、吸湿率等检查均参照2020版《中国药典》四部^［13］；成型率、休止角的检测参考相关文献^［14-17］。

2.7.3 辅料种类的筛选

颗粒剂常用辅料有稀释剂、黏合剂，常用稀释剂有蔗糖、糊精、乳糖、淀粉等，常用黏合剂有淀粉浆、纤维素衍生物等。其中，蔗糖、糊精和乳糖应用较多。取“3.1”项下制得的浸膏20 g，5份，加入以上常用的不同辅料，按一定比例与浸膏混匀，润湿剂用体积分数75%乙醇，以制粒难易程度、外观、溶化性、成型率（收得率）和流动性（串连漏斗法测定休止角）为评价指标筛选辅料种类。见表4。

2.7.4 成型工艺的优化

2.7.4.1 因素水平的选择

由表4可见，用蔗糖制得的颗粒黏性太大，无法过筛，无法制粒；用乳糖制得的颗粒颜色一致，大小较均匀，但颗粒易发生黏合，溶解静置后有沉淀；用微晶纤维素制备时，不易与浸膏混匀，颗粒不均匀，且颗粒水溶性较差，溶解静置后沉淀多。分别用糊精和可溶性淀粉制得的颗粒颜色一致，颗粒均匀，水溶性较好，流动性尚可，且较容易制粒。而单独用可溶性淀粉制备的颗粒虽然均匀，但细粉较多。因此，选择效果较好的2种辅料，即可溶性淀粉和糊精，作混合辅料，以辅料配比（A）、浸膏与辅料比例（B）、乙醇体积分数（C）作为筛选因素，用正交实验进一步优选成型工艺。因素水平见表5。

2.7.4.2 正交实验

选择正交表L₉（3⁴）安排实验，评价指标为颗粒溶化时间、吸湿率、水分、粒度、休止角等。考虑到本实验选取的指标较多，拟用Hassan法做“归一化”处理^［9-10］。其中，颗粒溶化时间、吸湿率、水分、休止角数值越小越好，用公式d_min=（X_max-X_i）/（X_max-X_min）计算；成型率数值越大越好，用公式d_max=（X_i-X_min）/（X_max-X_min）计算。见表6至表8。

2.7.4.3 成型工艺验证实验

按以上成型工艺条件进行重复性验证实验。将制得的3批颗粒，参照2020年版《中国药典》四部颗粒剂项下方法进行检查，结果显示各指标均符合相关规定，表明该工艺稳定可行，重复性良好。

3 讨论

3.1 提取工艺的选择

CCD-RSM是近年新兴的工艺及处方优选方法，具有精确度高、预测性好等优点，适用于非线性模型的拟合^［18-20］。本实验在单因素实验结果的基础上用CCD-RSM得到抗骨质疏松颗粒处方提取工艺中溶媒用量、煎煮时间对有效成分总浓度（补骨脂素、异补骨脂素含量之和）和干膏收率2种指标的影响，并对2种指标进行“归一化”处理，通过总评OD值进行综合评分。根据实验结果建立数学模型，绘制响应面图，可确定最佳工艺条件为溶媒用量12倍，煎煮时间为130 min。

3.2 辅料的筛选

乳糖、糊精、可溶性淀粉和蔗糖等都是制粒过程中常用的赋形剂。蔗糖具有引湿性，在储藏过程中易吸潮软化，影响药物的稳定性，用量过多会加大制粒的难度。本研究结果表明，选择可溶性淀粉和糊精二者配合使用时，颗粒的成型性、引湿性等均较好。本研究结果表明，辅料配比为可溶性淀粉∶糊精=1∶3时，颗粒的成型性较好。

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基金资助

四川省中医药管理局科学技术研究专项基金项目(2020JC0101)