对药“远志-酸枣仁”中CaMK Ⅱ调控成分的虚拟筛选及抗癫痫活性的研究

Virtual screening and antiepileptic activity evaluation of CaMK Ⅱ modulatory components from the herb pair, Polygala tenuifolia and Zizyphus jujuba

摘要

目的 对“远志-酸枣仁”中潜在作用于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）靶点的活性物质进行筛选，阐明其药效物质基础。 方法 采用以药效团为基础的虚拟筛选手段，通过收集已出版文献中报道的具有调控CaMK Ⅱ作用的化合物信息，建立基于CaMK Ⅱ配体的HipHop药效团模型，收集文献中报道的“远志-酸枣仁”中的成分并建立化合物库，对“远志-酸枣仁”中的成分与药效团进行匹配，随后使用分子模拟对接手段对匹配到的小分子化合物与CaMK Ⅱ靶点（PDB ID：2V7O）进行对接，研究潜在活性单体与CaMK Ⅱ的作用。用戊四唑（pentylenetetrazol，PTZ）点燃模型对活性单体细叶远志苷A（39）的抗癫痫作用进行测定，并对CaMK Ⅱ水平的调控作用进行评价。 结论 通过文献检索建立包含“远志-酸枣仁”中109种化学成分的化合物库，通过测试集验证确定将药效团03用于对“远志-酸枣仁”化合物库的虚拟筛选，对匹配度排前6位的单体通过分子模拟对接分析其与CaMK Ⅱ的作用情况，并用抗癫痫动物模型对单体的活性进行评价，化合物39能够在中高剂量下延长PTZ致癫痫发作的潜伏时间，改善PTZ所致的焦虑抑郁样行为，改善PTZ诱导的癫痫发作后脑内尼氏体丢失，提升PTZ所致的CaMK Ⅱ表达水平降低，提升海马CA1、CA3区及颞叶皮层内CaMK Ⅱ免疫阳性细胞数量并进一步对nAChR4受体水平进行调控。表明基于虚拟筛选与活性评价手段探讨“远志-酸枣仁”中CaMK Ⅱ调控作用的成分具有一定的准确性。

Abstract

Objective To screen the potential active calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ （CaMK Ⅱ） modulatory components from Polygala tenuifolia and Zizyphus jujuba with virtual screening and pharmacological evaluation methods. Methods Virtual screening was possessed based on the pharmacophore methods. Bycollecting the information of compounds with CaMK Ⅱ modulatory activity reported in the literature， HipHop pharmacophore model based on CaMK Ⅱ ligands was established， and the components from P. tenuifolia and Z. jujuba was collected to match the pharmacophore. Subsequently， the interactions between matched small molecule compounds and CaMK Ⅱ target （PDB ID：2V7O） were analyzed through molecular docking methods. Pentylenetetrazol （PTZ）-induced seizure mice model was established to evaluate the antiepileptic effect of the screened monomers. Tenuifoliside A （39） was selected to evaluate its modulatory effects of CaMK Ⅱ in the antiepileptic model. Results Through literature search， an in-house compound library with 109 kinds of chemical constituents from P. tenuifolia and Z. jujuba was established， then the optimal pharmacophore 03 was selected through test set verification for virtual screening of the compound library. Six kinds of potential CaMK Ⅱ modulatory constituents were obtained， and the interaction of the compounds with CaMK Ⅱ was analyzed by docking studies. Compound 39 was proved to prolong the latent time of PTZ-induced seizures， improve anxiety and depressive-like behavior induced by PTZ， promote the amount of Nissl body， and increase the expression level of CaMK Ⅱ. The number of CaMK Ⅱ immuno-positive cells in CA1， CA3 of hippocampus and temporal cortex regions was promoted as well with the regulation of the level of nAChR4. Conclusion The results showed that it was reasonable to investigate the CaMK Ⅱ modulatory components of P. tenuifolia and Z. jujuba based on virtual screening and activity evaluation.

Graphical abstract

关键词

远志 / 酸枣仁 / CaMK Ⅱ / 虚拟筛选 / 活性评价

Key words

Polygala tenuifolia / Zizyphus jujuba / CaMK Ⅱ / virtual screening / pharmacological evaluation

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMK Ⅱ）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可在谷氨酸能神经元中通过参与一系列下游级联反应调控突触上的谷氨酸受体活性，是影响突触可塑性及学习记忆的重要蛋白之一，其对于海马长时程（long-term potentiation，LTP）的产生至关重要。海马中CaMK Ⅱ的含量可占总蛋白含量的2%，CaMK Ⅱ主要由2种高度同源的亚型（CaMK ⅡA和CaMK ⅡB）组成。目前的研究结果表明^［1-5］，CaMK Ⅱ基因突变与癫痫的发生关系密切，其主要影响神经元的形成、学习记忆能力的损伤及癫痫易感性的增强等方面。研究表明，中药有效成分可通过调控CaMK Ⅱ通路治疗神经系统疾病^［6］。筛选调控CaMK Ⅱ靶点的化合物并探究其对CaMK Ⅱ下游通路的作用可能为癫痫的治疗提供新方向。

远志Polygala tenuifolia Willd.为远志科远志属植物，根部入药，性苦味辛，中医临床主要用于失眠多梦、心悸怔忡、健忘、癫痫惊狂及咳嗽痰多等的治疗。酸枣仁Ziziphus jujuba Mill.为鼠李科枣属植物的干燥成熟种子，性甘味平，中医临床主要用于虚烦不眠、惊悸怔忡等的治疗，其与远志的配伍见于枣仁远志汤（明代《症因脉治》）及定痫丹（清代《医宗金鉴》）等方剂。课题组通过检索文献，建立“远志-酸枣仁”成分库（见表1），本研究将以此为基础，从成分库中筛选具有调控CaMK Ⅱ作用的成分。课题组前期对中药治疗癫痫的物质基础开展了一系列工作^［7-10］，本研究将运用药效团与分子对接技术，预测“远志-酸枣仁”中具有调控CaMK Ⅱ作用的成分及其与该靶标的结合模式。随后通过蛋白免疫印迹法（Western blotting）、尼式染色及免疫荧光手段对筛选单体在戊四唑（pentamethylenete-trazole，PTZ）诱导的小鼠癫痫模型中的CaMK Ⅱ调控作用做初步验证，为进一步开展对该药的研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

旷场实验箱、高架十字迷宫、悬尾测试箱、强迫游泳测试箱均购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Etho Vision行为学记录分析系统（荷兰Noldus公司）；HM525NX冰冻切片机（美国Thermo Scientific公司）；VS200-BU玻片扫描仪（日本Olympus公司）。

1.2 试药

细叶远志苷A（上海源叶生物科技有限公司）；戊四唑（pentamethylenetetrazole，PTZ，上海麦克林生化科技有限公司）；CaMK Ⅱ一抗（1∶500，武汉三鹰生物技术有限公司）；nAChR4-基因名CHRNA4一抗（Abcam公司）。

1.3 动物

选取4~7周龄SPF级雄性KM小鼠，体质量为（25±3） g，购自西安交通大学医学部动物实验中心，动物许可证号SCXK（陕）2018（021）。KM小鼠饲养于陕西中医药大学SPF级动物实验室，所有动物自由进食和水，实验过程由陕西中医药大学动物实验伦理委员会的批准。

2 方法

2.1 实验动物的处理

以PTZ为造模剂对动物进行点燃^［38-39］，急性模型下，将细叶远志苷A（TenA）高（high dosage，H，5 mmol·L^-1）、中（medium dosage，M，1 mmol·L^-1）、低剂量（low dosage，L，0.3 mmol·L^-1）组腹腔注射给药，经体内代谢0.5 h后皮下注射85 mg·kg^-1的PTZ，注射后立即将受试小鼠单独置于一个透明的塑料方盒中观察30 min，若强直性发作持续时间短于5 s，则视为该剂量的化合物具有保护作用，记录给药后0.5 h小鼠阵挛性发作潜伏时间。随后参照文献^［12］实验方法，在慢性模型下将亚惊厥剂量PTZ（10 mg·kg^-1）重复进行皮下注射，将动物随机分为5组，即对照组，模型组及TenA高、中、低剂量组，每组6只小鼠。动物造模前1周，对TenA高、中、低剂量组小鼠连续腹腔注射给药，对照组和模型组用9 mg·mL^-1生理盐水腹腔注射1周。除对照组外，其余小鼠皮下注射PTZ，每日1次，对照组小鼠注射等量生理盐水。

2.2 对药“远志-酸枣仁”化学成分的收集及CaMK Ⅱ药效团的构建

通过检索文献，寻找对药“远志-酸枣仁”中的化学成分，收集化合物结构后进行能量最小化并建立包含“远志-酸枣仁”中所含成分3D结构的化合物库。用Discovery Studio软件中的Common Feature Pharmacophore Generation模块构建基于小分子配体的HipHop药效团模型。选取5种具有CaMK Ⅱ活性抑制作用的小分子化合物组成训练集（化学结构见图1）^［40-42］，对训练集中的小分子进行比对、叠合，得出10个得分最高的药效团模型。

用Discovery Studio中的Ligand Profiler模块对药效团进行评价，选取训练集中的化合物以及ZINC数据库中未见CaMK Ⅱ活性报道的非活性化合物组成测试集，对药效团进行评估。

2.3 分子模拟对接研究

用Discovery Studio中的Flexible Docking模块分析用药效团筛选到的成分与CaMK Ⅱ靶标的相互作用。以RELLOS P等^［43］解析的CaMK Ⅱ结构（PDB ID：2V7O）作为靶蛋白分析药效团匹配到的“远志-酸枣仁”活性成分与CaMK Ⅱ的相互作用。结合原配体在2V7O中的作用位点（x=-17.473 979，y=-27.239 472，z=-11.022 220）生成对接口袋。基于原配体与蛋白的相互作用，将2V7O蛋白对接口袋中的关键残基LEU 20、VAL 28、ALA 41、LYS 43、VAL 74、ASP 91、VAL 93、ALA 156定义为构象可旋转的柔性残基进行分子对接，以CDOKER interaction energy作为指标初步评价小分子配体与受体的结合情况。

2.4 对药“远志-酸枣仁”中单体抗癫痫活性评价及对CaMK Ⅱ蛋白表达的影响

2.4.1 动物行为学评价

参照文献^［44-45］实验方法，用旷场模型评价PTZ对癫痫模型小鼠自发探索行为及紧张状态的影响及“远志-酸枣仁”活性单体的改善效果，记录5 min内小鼠的活动情况，包括总移动距离、中央区进入次数、中央区停留时间和粪便数量。用高架十字迷宫评价PTZ对小鼠焦虑抑郁样行为的影响及“远志-酸枣仁”活性单体的改善效果，记录小鼠15 min内分别进入开臂的次数和停留时间。

用悬尾模型及强迫游泳模型观察小鼠绝望情绪。在小鼠尾根2 cm处系上无弹性的细绳，细绳的另一端挂于支架上，使小鼠头部向下，距离台面15 cm。采集小鼠5 min内的不动时间。将小鼠置于水温为25 ℃，水深为20 cm的透明容器（高20 cm，直径10 cm）中，记录小鼠5 min内的不动时间。

2.4.2 尼氏染色

将用0.04 g·mL^-1多聚甲醛固定后的鼠脑经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后制成厚4 μm的石蜡切片，按照常规尼氏染色步骤进行染色^［20］，中性树脂封片后，采集图像并进行分析。

2.4.3 Western blotting及免疫荧光实验

行为学实验结束后，参照文献^［44］中的方法处死实验动物并取脑海马组织，加入CaMK Ⅱ一抗（1∶500），以GAPDH作为内参（1∶10 000），洗膜，显影。免疫荧光实验方法参照文献［46］，取分离出的完整脑组织置于多聚甲醛中固定2 h，包埋后切片，加入抗体（1∶200兔抗CaMK Ⅱ及nAChR4）4 °C孵育过夜，PBS洗3次，加入荧光二抗室温孵育1 h，PBS洗3次，DAPI中孵育30 min，加防荧光淬灭剂，封片后观察。

2.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行处理。所有数据以（\overline{x}\pm s）表示。潜伏时间的比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对药“远志-酸枣仁”化合物库的构建

通过收集与整理文献，共得到对药“远志-酸枣仁”中的成分109种，其中包含远志成分72种，酸枣仁成分37种。其中包含了远志的主要成分三萜皂苷类、糖酯类及口山酮类成分及酸枣仁中的主要成分生物碱及皂苷类成分。

3.2 药效团的构建与评价

共产生了10个药效团模型，其结果参数见表2。

以训练集分子与药效团模型的匹配度作为标准进行评分，生成的药效团评分均超过了40分，表明测试集所选分子的共同特征较为明显。

药效团对测试集分子的验证热图见图2。由图2可见，药效团03对于测试集中活性化合物的响应度较高，而对于非活性化合物的响应值较低，符合本研究对于药效团的要求，故选择药效团03作为对象进行后续研究。优选药效团主要由1个氢键受体，1个芳环中心和2个疏水中心构成，见图3。优选药效团2个疏水中心之间的距离为9.737 Å，氢键受体与2个疏水中心之间的距离分别为11.474、7.532 Å。

3.3 优选药效团对“远志-酸枣仁”中CaMK Ⅱ调控活性成分的虚拟筛选

将优选药效团03与“远志-酸枣仁”成分库匹配后，在FAST模式的构象约束条件下，可以匹配到15种成分，将其按照匹配度fit value由高到低排列，用分子模拟对接手段对筛选得到的化合物与CaMK Ⅱ的相互作用进行了评估。共匹配到6种化合物，其中远志中4种（45、19、39、23），酸枣仁中2种（108、107），按照匹配度得分从高到低排列，分别为化合物polygalatenosides B（45）、远志山酮Ⅳ polygalaxanthone Ⅳ（19）、细叶远志苷A tenuifoliside A（39）、6'''-sinapoylspinosin（108）、1-hydroxy-3、7-dimethoxyxanthone（23）、六驳碱litsoeine（107）。其fit value值从3.23依次降低至2.69（图4）。分析可知，远志与酸枣仁中能与CaMK Ⅱ药效团匹配的结构类型较为多样，包括糖酯类、糖苷类、山酮类及生物碱类化合物，而远志与酸枣仁中分布较多的五环三萜皂苷类成分则由于缺乏芳环而无法与药效团匹配。所有匹配得到的化合物中，疏水中心均被至少1个甲氧基占据，氢键受体则为氧原子，其富电子的特性使得其易于与蛋白结合口袋中的残基氢原子形成分子间氢键，从而更好地与CaMK Ⅱ发生作用。

根据药效团的匹配结果，将匹配度较高的6种化合物与CaMK Ⅱ蛋白进行分子模拟对接，见图5。根据PDB数据库中CaMK Ⅱ蛋白与药物的共晶信息，6种药效团匹配到的化合物均能与靶点关键残基产生一定作用，初步验证了对接的合理性，根据对接结合能评价配体与蛋白的作用情况，与药效团匹配度顺序略有差异，药效团匹配度从高到低依次为：45>19>39>108>23>107，对接结果得分顺序为：45（-74.236 4 kcal·mol^-1）>108（-71.958 3 kcal·mol^-1）>39（-68.377 4 kcal·mol^-1）>19（-64.659 0 kcal·mol^-1）>23（-40.553 9 kcal·mol^-1）>107（-39.845 6 kcal·mol^-1），氢键数量及关键口袋残基作用情况与打分排序相近。综合药效团匹配及分子对接结果可以看出，糖苷类结构片段相较于苷元，能为配体提供更多的潜在相互作用，故针对CaMK Ⅱ靶点，开发糖苷类化合物可能是未来的研究方向。而在实际的活性测定过程中，上述化合物均未被报道具有CaMK Ⅱ蛋白调控作用，神经系统相关活性方面，化合物polygalatenosides B（45）具有潜在抗抑郁活性，可以通过阻断去甲肾上腺素的转运，起到去甲肾上腺素再摄取抑制剂的作用（IC₅₀：6.04 μmo·mol^-1）^［47］；化合物19与23均具有1-羟基-3，7-二甲氧基氧杂蒽酮母核结构，该类化合物从远志中分离得到后被报道具有一定的小胶质细胞BV2保护活性，具体机制尚不清楚^［48-49］；细叶远志苷A（39）被认为是远志中的代表性成分之一，目前被报道的神经系统活性包括以下方面^［50-53］：可以通过ERK途径抑制由皮质酮诱导的大鼠胶质瘤细胞神经毒性，通过调控JNK/MAPK/NF-κB通路抑制神经炎症，通过调控PI3K/AKT及MEK/ERK/CREB通路促进PC12细胞的轴突生长等。酸枣仁中的黄酮类化合物6'''-sinapoylspinosin（45）被认为具有一定的抗炎活性，其可能通过调控NF-κB/p65通路发挥作用^［54］。生物碱类成分litsoeine（107）则被发现具有胆碱酯酶抑制活性^［56-58］。

3.4 抗癫痫活性的评价

结合药效团，分子对接结果及单体商品化情况，选取远志中的活性单体细叶远志苷A（39）进行进一步的活性评价，见图6。85 mg·kg^-1剂量的皮下PTZ实验结果表明（图7），中、高剂量下，相较于对照组（NS），化合物39能有效延长PTZ致小鼠癫痫发作的潜伏时间（P<0.05），表现出较好的抗癫痫活性。

3.5 行为学实验的结果

用旷场、高架十字迷宫、悬尾及强迫游泳模型评价PTZ诱导的癫痫小鼠的焦虑抑郁样行为，见图6。旷场结果表明，与对照组比较，PTZ诱导的癫痫模型的小鼠总移动距离、中央区停留时间百分比和粪便数量均有显著差异（P<0.05），细叶远志苷A（39）对上述指标均有显著改善作用（P<0.05）。高架十字结果表明，PTZ诱导的癫痫模型小鼠进入开臂的次数和时间显著少于对照组（P<0.05），表明PTZ干预会使小鼠在该模型下产生焦虑抑郁样行为，用细叶远志苷A（39）干预后，小鼠进入开臂的次数和时间均有所增加（P<0.05）。悬尾及强迫游泳结果表明，PTZ使小鼠不动时间显著延长（P<0.05），产生绝望情绪，而用细叶远志苷A（39）干预后不动时间显著缩短（P<0.05），表明细叶远志苷A可以改善PTZ诱导的小鼠焦虑抑郁样行为。

3.6 尼式染色的结果

细叶远志苷A（39）干预PTZ致癫痫小鼠尼式染色的结果见图8。由图8可见，对照组小鼠海马CA1、CA3区域及颞叶皮层区（TeA）神经细胞形态正常，排列规则，PTZ诱导癫痫发作后，小鼠海马CA1、CA3区域及颞叶皮层区神经元胞质内尼氏体数量减少，细胞核边聚、固缩、核仁消失，细叶远志苷A（39）干预后胞质内尼氏体丢失得到显著改善。

3.7 Western blotting及免疫荧光实验的结果

Western blotting结果表明，PTZ组小鼠CaMK Ⅱ表达明显低于对照组（P<0.01），而给予不同剂量细叶远志苷A（39）干预后，CaMK Ⅱ的表达均明显下降（P<0.05），表明细叶远志苷A能够抑制PTZ所致的癫痫动物模型脑海马区内的CaMK Ⅱ表达下降，见图9。

免疫荧光实验结果见图10。由图10可见，与对照组比较，PTZ诱导的癫痫模型动物海马CA1、CA3区及颞叶皮层区（TeA）CaMK Ⅱ免疫阳性细胞数量明显减少，而nAChR4免疫阳性细胞数量明显增加，给予高剂量细叶远志苷A干预后，CaMK Ⅱ免疫阳性细胞数量显著上升，而nAChR4免疫阳性细胞数量明显减少。

4 讨论

癫痫是由多种未知的分子和细胞机制引起神经元过度兴奋而导致的一种慢性神经系统疾病。研究表明^［58-59］，癫痫发病过程会损伤CaMK Ⅱ的功能，影响突触重塑性，对长时程增强（long-term potentiation，LTP）参与的学习记忆过程有一定影响，动物模型研究结果显示，CaMK Ⅱ功能受损会使小鼠无法正常完成LTP过程并出现严重学习障碍，故探究中药中调控CaMK Ⅱ的成分对治疗由癫痫导致的认知障碍具有重要意义。癫痫发作后，CaMK Ⅱ的表达水平降低，磷酸化程度升高，使得细胞内Ca²⁺浓度增加，造成钙超载^［60］，对神经元形成兴奋性毒性，降低神经元诱导cAMP应答元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）表达并提升其磷酸化程度。

研究表明^［61］，CaMK Ⅱ与nAChR在肌肉神经接点的突触位点存在共定位，对CaMK Ⅱ活性的阻断会显著影响nAChR受体的运输和突触后受体的稳定。用短发夹RNA降低CaMK Ⅱ编码蛋白肌肉特异性非激酶锚定蛋白的表达会改变nAChR的稳定性并诱导突触后肌肉神经接点的分解。该过程主要发生在乳突肌等周围神经中，在脑内CaMK Ⅱ与nAChR的关系尚未得到全面揭示，而本研究结果初步表明nAChR4受体与CaMK Ⅱ在脑海马中存在共定位。海马是癫痫发病时病变最为显著的脑区之一，海马硬化及神经元脱失是难治性癫痫的主要病理特征^［62］，因此观察“远志-酸枣仁”对于海马脑区的组织病理情况的改善及相关免疫阳性细胞数量变化情况对于评价该药对对于癫痫的治疗效果具有重要意义。

通过包括药效团及分子模拟对接手段寻找对药“远志-酸枣仁”中具有调控CaMK Ⅱ活性的成分，可为中药手段治疗癫痫提供新思路。本研究通过调研已出版的文献，建立了对药“远志-酸枣仁”中所含成分的化合物库，基于已报道的CaMK Ⅱ抑制剂构建了HipHop药效团模型^［63-64］，并对药效团匹配到的“远志-酸枣仁”成分进行了与CaMK Ⅱ靶点的分子模拟对接，发现了6种潜在活性化合物。进一步选取细叶远志苷A（39，TenA）进行抗癫痫活性及机制研究，与药效团匹配得分最高的化合物polygalatenosides B（45）相似，细叶远志苷A由二糖片段与2个芳香酯片段构成，其3，4，5-三甲氧基肉桂酸（3，4，5-trimethoxycinnamic acid，TMCA）片段可能与CaMK Ⅱ发生结合口袋中的谷氨酸残基GLU 97发生pi-π电子共轭作用，而细叶远志苷A可以在体内经代谢转化为TMCA^［65-66］，TMCA亦可以通过调控GABA能系统治疗癫痫，课题组前期研究已证实该化合物具有较好的抗癫痫候选药物开发价值。

采用PTZ诱导的癫痫动物模型评价了细叶远志苷A的抗癫痫活性及对癫痫状态下CaMK Ⅱ的调控作用。结果表明，细叶远志苷A能够有效延长PTZ诱导癫痫发作的潜伏时间，减少PTZ对癫痫小鼠空间记忆和情绪反应的影响，上调海马区PTZ诱导的CaMK Ⅱ表达下降，对海马烟碱型乙酰胆碱受体产生调控作用进而起到抗癫痫作用。本研究通过建立基于配体特征的药效团从而筛选出具有新颖母核的对药“远志-酸枣仁”中CaMK Ⅱ调控成分，后续将结合分子互作等手段直接验证成分-靶点作用，论证本研究“给靶找药”的思路，为从中药药对中开发治疗癫痫的新药提供基础。

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