多指标综合评分法结合响应曲面法筛选蜜炙款冬花的最佳炮制工艺

Optimization of the processing technology of honey baked FarfaraeFlos by response surface methodology experimental design with multi-index

摘要

目的 基于响应曲面法，从多指标综合评价的角度建立蜜炙款冬花的最佳炮制工艺。 方法 用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析，以款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁含量的综合评分值为考察指标，以加蜜量、炒制温度、炒制时间为单因素，用响应曲面法优选出蜜款冬花的最优炮制工艺并进行验证实验。 结果 优选的蜜炙款冬花最佳炮制工艺为加蜜量为4倍药材量，炒制温度为195 ℃，炒制时间为12 min。验证实验中3批样品提取后的综合评分值（94.16％）与预测值（95.92％）相比，相对误差为0.93％。 结论 该实验的方法学考察结果准确、重复性好，用响应曲面法优选的蜜炙款冬花的最佳炮制方案可行，为制定蜜炙款冬花的质量标准提供了理论依据。

Abstract

Objective Based on response surface methodology， the optimal processing technology of honey baked FarfaraeFlos was established from the point of multi-index evaluation. Methods High performance liquid chromatography（HPLC）was used for quantitative analysis， and the content of tussilagone， chlorogenic acid， isochlorogenic acid A and rutin was used as inspection indexes. Response surface methodology was used to investigate the effects of the adding amount of honey， frying temperature and frying time on the processing technology of honey baked FarfaraeFlos， and to optimize the processing technology of honey baked FarfaraeFlos. Results The optimal processing process of honey baked FarfaraeFlos was as follows： the amount of honey was 4 times the amount of medicinal materials， frying pan bottom temperature was 195 ℃， and frying time was 12 minutes. In validation test， the relative deviation of comprehensive scoring value（94.16%） to predicted value （95.92%）was 0.93% for 3 batches of samples （n=3）. Conclusion The results of this experiment are accurate and repeatable， and the optimal processing scheme of honey baked FarfaraeFlos is feasible， providing a theoretical basis for formulating quality standards for honey baked FarfaraeFlos.

Graphical abstract

关键词

蜜款冬花 / 高效液相色谱法 / 炮制工艺 / 响应曲面法 / 款冬酮 / 绿原酸 / 异绿原酸A / 芦丁

Key words

honey baked FarfaraeFlos / HPLC / processing technology / response surface methodology / tussilagone / chlorogenic acid / isochlorogenic acid A / rutin

款冬花为“古今方用温肺治嗽之最”的常用中药材，现收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版一部，来源于菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，具有润肺下气、止咳化痰的功效，用于新久咳嗽、喘咳痰多等症的治疗^［1］。早在南北朝用甘草水炮制款冬花，后采用净制、切制和炮炙（蜜炙、甘草炙）多样方式炮制款冬花^［2-3］，现行标准中款冬花项下仅有蜜炙一种炮制品种，临床常用蜜炙款冬花，以增强润肺止咳、益气补脾及矫味的作用^［4］。

响应曲面法（response surface methodology，RSM）是通过实验测得响应值，采用多元回归方程构建响应面模型，使用定量数据评估优化可变目标参数和相互作用的方法，其能有效地减少实验次数，已广泛应用于医药领域^［5-6］。蜜款冬花参照《中国药典》2020年版蜜炙法通则0213方法炮制，但蜜炙工艺的具体参数并未明确。相关文献报道蜜炙款冬花研究较多的是多种有效成分同时测定^［7-8］，有学者曾采用正交实验优选款冬花的蜜炙工艺^［9］，但仅研究了1个成分，难以整体评价蜜款冬花的炮制参数，故本研究以加蜜量、炒制温度和炒制时间为考察因素，采用RSM考察蜜炙款冬花的最佳炮制工艺，且考察指标涉及倍半萜类的款冬酮及咖啡酰基奎宁酸类的绿原酸、异绿原酸A和黄酮类的芦丁4种成分，实验结果更具说服力，为蜜炙款冬花的炮制提供理论数据支撑。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；CPA225D电子天平（d=0.01 mg，德国赛多利斯有限公司）；KQ5500V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品：款冬酮（批号111884-202105，质量分数为99.5%）、绿原酸（批号110753-202119，质量分数为96.7%）、芦丁（批号100080-202112，质量分数为92.7%）均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A（批号MUST-2105021，质量分数为96.5%）购自成都德瑞可生物科技有限公司。乙腈、甲醇均为色谱纯，购自Sigma公司；分析纯磷酸（西陇科学股份有限公司）；水为娃哈哈纯净水。

款冬花购自亳州中强药业有限公司，由福州市中医院裴香萍中药房主任鉴定来源于菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。

2 方法与结果

2.1 多指标含量测定方法的建立及综合评价指标的确定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ECOSIL-C₁₈（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-甲醇- 2 mL·L^-1磷酸溶液，梯度洗脱^［10-11］：0~25 min，体积分数为15%的甲醇，体积分数为20%的乙腈；25~50 min，体积分数为15%~55%的甲醇，体积分数为20%的乙腈。检测波长为240 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min^-1；进样量为10 μL。见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为0.375 8、0.416 8、0.300 2、0.309 4 mg·mL^-1的混合对照品储备液，精密吸取该储备液5.0 mL置于50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

将蜜款冬花粉碎，过3号筛，取约2.0 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为85%的甲醇100 mL，密塞并放置过夜，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察

精密吸取2.1.2项下制备的混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置于50 mL量瓶中，用甲醇定量，即得系列混合对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，以各成分质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），进行回归计算。结果款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁的回归方程分别为：y₁=126.03x₁+52.04（r=0.999 6）、y₂=221.57x₂+17.39（r=0.999 8）、y₃=109.85x₃+31.82（r=0.999 5）、y₄=204.05x₄+20.21（r=0.999 7），4个成分分别在1.50~37.58、1.67~41.68、1.20~30.02、1.24~30.94 μg·mL^-1范围内与其峰面积线性关系良好。

2.1.5 精密度实验

取混合对照品溶液，连续进样6次，结果显示，款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁峰面积的RSD值分别为0.73%、0.65%、0.59%、0.48%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性实验

取供试品溶液，分别于制备后0、4、10、18、24、48 h进行测定。计算得款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁峰面积的RSD值分别为1.29%、1.36%、1.47%、1.08%，表明样品溶液在48 h内稳定。

2.1.7 重复性实验

取蜜款冬花6份，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积值，计算得款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁含量的平均值分别为1.465、1.879、1.003、1.158 μg·mL^-1，RSD值分别为1.19%、1.35%、1.26%、1.07%，表明方法的重复性良好。

2.1.8 回收率实验

取已测定含量的蜜款冬花6份，每份约0.5 g，精密称定，分别按供试品中款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁含量的100%精密加入相应对照品，按照2.1.3项下方法制备，按照2.1.1项下色谱条件测定，计算回收率。计算得款冬酮的平均回收率为99.14%，RSD值为0.97%；绿原酸的平均回收率为99.89%，RSD值为1.24%；异绿原酸A的平均回收率为98.67%，RSD值为1.31%；芦丁的平均回收率为98.95%，RSD值为1.09%，表明该方法具有良好的准确度。

2.1.9 综合评价指标计算

精密称取单因素及RSM实验的样品，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，按照外标法分别计算款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁的含量。参考文献方法^［12］，设满分为100分，用多指标-RSM进行综合评价，综合得分（Y）=款冬酮×25%＋绿原酸×25%＋异绿原酸A×25%＋芦丁×25%。

2.2 蜜款冬花影响因素的单因素实验

2.2.1 加蜜量的考察

精密称取净款冬花5份，每份20 g，分别取药材量1、2、4、6、8倍的炼蜜，用沸水浸泡焖润30 min，置于容器中于220 ℃炒至深黄色，取出，烘干放至室温，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，计算样品中4种成分的含量，并进行综合评分，结果见图2。由图2可知，当加蜜量达到4倍药材量时蜜款冬花的综合评分最高。

2.2.2 炒制温度

精密称取净款冬花5份，每份20 g，各加4倍药材量炼蜜，用沸水浸泡焖润30 min，将其放入炒制容器内，将温度分别设置为100、120、150、200、220、250 ℃，炒至深黄色后取出，烘干，放至室温，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，计算4种成分的含量，并进行综合评分，结果见图3。由图3可知，炒制温度为200 ℃时，蜜款冬花的综合评分最高。

2.2.3 炒制时间

精密称取净款冬花5份，每份20 g，各加4倍药材量炼蜜，用沸水浸泡焖润30 min，将其放入炒制容器内，各以200 ℃分别炒制4、8、12、16、20 min，取出，烘干放至室温，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，计算4种成分的含量，并进行综合评分，见图4。由图4可知，炒制时间为8 min时，蜜款冬花的综合评分最高。

2.3 RSM优化炮制工艺

2.3.1 实验设计与结果

用Design-Expert 8.0.5软件，以加蜜量（A）、炒制温度（B）、炒制时间（C）为考察因素，以款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁含量综合评分值Y（%）为响应值，设计3因素3水平Box-Behnken的响应面分析模型，优化蜜炙款冬花的炮制工艺。因素水平表及实验结果见表1。

2.3.2 方差分析

用Design-Expert 8.0.5软件对实验数据拟合，得二次多项式方程Y=74.87+3.65A－0.83B+2.41C－1.36AB＋0.69AC＋3.11BC－1.08A²－4.33B²－2.25C²，R²=0.898 2；失拟项P=0.070 2>0.05，表明模型可用于分析和预测蜜款冬花炮制工艺。模型的一次项A、B呈极显著影响，因素C的影响不显著（P>0.05），影响顺序为B>A>C；BC交互项影响极显著，AB对模型有显著影响。见表2。

2.3.3 响应曲面分析

通过Design-Expert 8.0.5软件，得到3D响应曲面图，见图5。由图5可知，炒制温度（B）与炒制时间（C）、加蜜倍数（A）与炒制温度（B）交互影响对款冬花蜜炙综合评分均影响显著，且炒制温度与炒制时间影响更大。

2.3.4 最佳炮制工艺确定及验证实验

利用软件对所建模型求解，得出最优蜜炙款冬花中加蜜量为3.8倍药材量，炒制温度190.17 ℃，炒制时间11.65 min，综合得分的理论值为95.92。考虑生产实际情况，最终确定工艺为100 kg，净款冬花加入炼蜜25 kg，闷润30 min，炒制温度195 ℃，炒制12 min。取同一批净款冬花，按上述最佳炮制工艺制备，平行操作3次，得到蜜款冬花工艺验证综合评分平均为94.16%，与预测值的相对误差为0.93%，表明优化后的蜜款冬花工艺具有实操价值。

3 讨论

款冬花中主要含倍半萜、黄酮、咖啡酰基奎宁酸类等化学成分^［13］。倍半萜类化合物款冬酮为其质量控制的专属性指标成分，具有抗炎、镇咳等药理作用^［14］。芦丁属于黄酮类，具有镇咳、祛痰的作用。绿原酸、异绿原酸A为咖啡酰基奎宁酸类化合物，具有祛痰、抗炎作用^［15］。另据文献报道^［16］，蜜款冬花蜜炙后款冬酮及芦丁含量增大，进一步增强了蜜款冬花的抗菌消炎和润肺止咳作用。故本实验用HPLC法，以款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁4种成分作为评价指标筛选蜜款冬花的炮制工艺。

本研究以款冬酮、绿原酸、异绿原酸A和芦丁含量进行综合评分，根据蜜炙工艺，在前期单因素实验基础上，了解每个因素对蜜款冬花中各成分的影响情况，再用RSM优选蜜款冬花的最佳炮制工艺条件。实验结果显示，加蜜倍数和炒制温度是显著影响因素，该结果与交互作用结果一致，这也从侧面反映了实验的可实施性。虽炒制时间对响应值影响不明显，但交互项中显示作用非常明显，也需重视其对实验结果的影响。

综上所述，本研究以加蜜倍数、炒制温度和炒制时间为因素，用Design-Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken设计响应面实验，确定蜜款冬花炮制工艺，为后续蜜款冬花炮制规范的制定提供实验数据，并为蜜款冬花的综合利用提供理论依据。

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