UPLC-MS/MS法测定毛蕊花糖苷干预不育症模型大鼠的睾酮水平

Determination of the testosterone levels in infertile rats treated with acteoside by UPLC-MS/MS

摘要

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法（ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测毛蕊花糖苷干预不育症模型大鼠血浆睾酮的含量，测定不育症模型大鼠血浆24 h睾酮含量，并借助药动学理论定量评价干预效果。 方法 大鼠含药血浆以睾酮-C3为内标，用液液萃取法，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，5 μL进样分析。以Acquity UPLCⅢ BEH C₁₈（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱；以甲醇为流动相A、5 mL·L^-1甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序：流速为0.2 mL∙min^-1；柱温为35 ℃；样品室温度为4 ℃；运行时间为10 min；质量检测器使用ESI离子源，正模式检测，睾酮及内标睾酮-C3用于定量的母→子离子对分别为m/z 289.2→97.0、m/z 291.4→101.1。借助药动学软件分析，获取空白组和毛蕊花糖苷干预组大鼠体内24 h睾酮曲线下面积（area under the curve，AUC）数据。 结果 睾酮质量浓度在1~1 000 ng·mL^-1范围内呈良好的线性关系。该方法日内、日间精密度RSD值均<10.84%，日内、日间准确度RE均<10.03%，样品提取回收率为95.82%~99.17%，置于进样器于4 ℃冰箱及长期冷冻稳定性RSD值均<10.63%。测定结果显示，毛蕊花糖苷干预组药峰浓度（peak concentration，C_max）为7.92 ng·mL^-1，空白组C_max为10.26 ng·mL^-1。与空白组比较，毛蕊花糖苷干预组大鼠体内睾酮24 h总AUC相对平稳。 结论 建立了UPLC-MS/MS测定不育症模型大鼠血浆睾酮含量的方法。从PK/PD角度比较分析推测出，给予毛蕊花糖苷干预后，不育症模型大鼠的24 h总体睾酮可基本恢复正常水平，从而发挥改善大鼠雄性生殖功能的作用。

Abstract

Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography -tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the detection of plasma testosterone level in infertility model rats treated with acteoside （ACT）， to determine the 24-hour plasma testosterone level of infertility model rats， and to evaluate the intervention effect quantitatively by pharmacokinetic theory. Methods Testosterone C3 as the internal standard， the plasma was centrifuged at 12 000 r·min^-1 for 10 minutes by liquid-liquid extraction method. The supernatant was taken and 5 μL was injected for analysis. The determination was performed on an Acquity UPLⅢBeh C₁₈ （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） column. Gradient elution was performed with methanol as mobile phase A and 5 mL·L^-1 formic acid solution as mobile phase B. The flow rate was 0.2 mL·min^-1， the column temperature was 35 ℃， and the sample room temperature was 4 ℃. The running time was 10 min with ESI ion source in positive mode. The quantitative precursor to fragment ion pairs of testosterone and internal standard testosterone -C3 were m/z 289.2→97.0 and m/z 291.4→101.1， respectively. By means of pharmacokinetic software analysis， the 24-hour testosterone AUC data of rats in blank group and ACT intervention group were obtained. Results The mass concentration of testosterone showed a good linear relationship in the range of 1—1 000 ng∙mL^-1. The method precision RSDs of intra-day and inter-day were <10.84%， and the method accuracy REs of intra-day and inter-day were<10.03%. The recoveries of sample extraction were 95.82—99.17%. The RSDs of long-term freezing stability were <10.63% when the samples were stored in the 4 ℃ refrigerator. The results showed that in the intervention group， the C_max was 7.92 ng·mL^-1. The C_max of the blank group was 10.26 ng·mL^-1. Compared with the blank group， the 24-hour total AUC of testosterone in the ACT intervention group was unchanged. Conclusion A method for the determination of plasma testosterone in infertile rats by UPLC-MS /MS was established. From the perspective of PK/PD comparative analysis， it was inferred that after the intervention of acteoside， the 24 hour total testosterone of the infertility model rats could basically return to normal level， so as to improve the male reproductive function.

Graphical abstract

关键词

毛蕊花糖苷 / 不育症 / 睾酮 / 评价 / 超高效液相色谱-质谱联用法

Key words

acteoside / infertility / testosterone / evaluation / UPLC-MS/MS

肉苁蓉作为历代中医典籍中治疗不育症的补肾要药，具有补肾阳、益精血之功效^［1］。现代药理学研究结果表明，肉苁蓉醇提取物中的苯乙醇苷类化合物可使大鼠血清睾酮水平显著升高^［2］。毛蕊花糖苷（acteoside，ACT）是列当科肉苁蓉属Cistanches肉苁蓉活性成分中含量最高的苯乙醇苷类化合物^［3］。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）收载毛蕊花糖苷为控制肉苁蓉药材质量的指标成分^［4］。课题组最新体外研究结果显示，毛蕊花糖苷对CYP3A4酶存在抑制作用^［5］。而睾酮主要通过CYP3A4酶代谢，由此推测，毛蕊花糖苷可能会通过干扰CYP3A4酶的代谢从而抑制睾酮代谢。为进一步验证毛蕊花糖苷是否能抑制体内睾酮代谢，发挥调控睾酮水平的作用，本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法（ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），对不育症模型大鼠血浆24 h睾酮含量进行测定，并借助药动学理论定量评价干预效果，以期为毛蕊花糖苷在不育症治疗领域的临床前研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity型UPLC-三重四极杆质谱联用仪（美国Waters公司）；Thermo Sorvall ST 16R型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DW-HL678型超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；雷磁PHSJ-3F型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；氮吹仪（上海力辰科技有限公司）；ME215S型分析天平（北京赛多利斯有限公司）；MS3微型旋涡混合仪（德国Ika公司）；PURELAB Chorus 1 Complete型超纯水仪（英国Elga公司）等。

1.2 试药

对照品：睾酮（批号202006，质量分数≥98%）、睾酮-2，3，4-13C3（睾酮-C3，批号20J001，质量分数≥98%）均购自美国Sigma公司。活性炭吸附无基质血清（上海达特希尔生物有限公司）；正己烷、乙酸乙酯、乙酸钠、碳酸钠均购自上海麦克林生化科技有限公司；甲醇和甲酸均为色谱纯，均购自购自美国Thermo Fisher Scientific公司；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

2.1.1 色谱条件

以Acquity UPLCⅢ BEH C₁₈（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱；以甲醇为流动相A、5 mL·L^－1甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序：0~1 min，25%A；1~6 min，25%A~95%A；6~8 min，95%A；8~8.1 min，95%A~25%A；8.1~10 min，25%A。流速为0.2 mL·min^-1；柱温为35 ℃；样品室温度为4 ℃；运行时间为10 min；进样量为5 μL。

2.1.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离源，离子源温度为150 ℃；毛细管电压为0.5 kV；脱溶剂气温度为350 ℃；锥孔气流量为1 L·h^-1；脱溶剂气流量（氮气）为650 L·h^-1；碰撞气为氩气；扫描模式为多反应监测模式；扫描方式为正离子；数据采集范围为m/z 10~1 000，质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站，通过调谐优化质谱参数，最终确定睾酮和内标的质谱条件，见表1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标本来源

血清标本：不育症模型SD大鼠（n=8）给药（毛蕊花糖苷）与空白组（n=4）血浆各2 mL，加入肝素抗凝，4 ℃静置2 h后以3 000 r·min^-1离心10 min，分离得到血浆，置于-80 ℃备用；基质血清：用活性炭吸附无激素血清。

2.2.2 标准品与内标溶液

睾酮对照品以甲醇稀释，配制成质量浓度为1 mg·mL^-1的标准储备液。将睾酮-C3以甲醇稀释，配制成质量浓度为1 000 ng·mL^-1的内标液，冷藏。

2.3 生物样品前处理

因为血清基质效应会对UPLC-MS/MS测定产生干扰，表现为离子抑制和离子增强，所以需通过前处理分离血清睾酮。血清样本前处理用液-液萃取法。具体操作^［6］：将血清样品从冰箱取出，置于冰上融化，与内标混合，用酸性缓冲液（磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液）平衡，依次加入正己烷、乙酸乙酯进行液-液萃取，离心后，取上清液在氮吹仪中干燥，然后用碱性缓冲液（磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液）重新溶解，用正己烷液-液萃取，用旋涡仪旋转，离心得到上清液。在氮吹仪中再次干燥，样品提取物用甲醇重新溶解，以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，进样5 μL，用UPLC-MS/MS进行分析。

2.4 调控效果定量评价

用药动学Kinetica 5.1和Graphpad 8.0软件，利用空白组和实验组睾酮含量数据分别构建大鼠睾酮体内24 h曲线下面积（area under the curve，AUC）曲线并获得C_max和总AUC值，进行定量评价。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察

取大鼠空白血浆，按照2.3项下方法处理样品，进样量为5 μL，并截取离子对色谱图，见图1A、1B。取空白血浆，加入定量下限（lower limit of quantification， LLOQ）溶液和内标，其余按照2.3项下方法进行操作，进样量为5 μL，截取离子对色谱图，见图1C、1D。取血浆样品，按照2.3项下方法进行操作，进样量为5 μL，截取离子对色谱图，见图1E、1F。由图1可见，均未观察到分析物和内标的干扰峰。

2.5.2 标准曲线及线性范围考察

以碳吸附无激素血清为基质，取质量浓度为1 mg·mL^-1的睾酮标准储备液，用甲醇稀释，分别得到质量浓度为1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1 000 ng·mL^-1的系列标准工作液，将标准曲线按以上10个点设定，建立线性方程。结果显示，线性方程为y=0.004 4x+0.097 1，r²=0.998 6，线性范围为1~1 000 ng·mL^-1，定量下限为1 ng·mL^-1。

2.5.3 精密度与准确度考察

按照2.2.2项下方法配制睾酮定量下限和低、中、高质量浓度（5、50、500 ng·mL^-1）工作溶液，每个质量浓度平行6份，按照2.3项下方法处理，按照2.1项下色谱、质谱条件进样测定，记录峰面积，计算批内精密度RSD和批内准确度［准确度=（测得值/真实值）×100％，下同］；连续测定3 d，计算批间精密度RSD值和批间准确度，结果见表2。如表2所示，睾酮各质量浓度水平质控样品的相对误差（RE）均在4.95%~10.03%之间，批内、批间精密度（RSD）均<10.84%。

2.5.4 基质效应与提取回收率

取6个大鼠空白血浆，按照2.2.2项下方法配制睾酮定量下限和低、中、高质量浓度工作溶液，每个质量浓度平行6份，按照2.3项下方法处理，按照2.1项下色谱、质谱条件进样测定，记录并测定其峰面积，与未经过提取的相同质量浓度水平的基质样品峰面积进行比较。

用超纯水代替空白血浆，按照2.3项下的操作方法处理，进样分析后记录杂质A与内标物的峰面积比，以未经过提取的基质样品峰面积与相同质量浓度水平的纯溶液样品峰面积的比值来评价。提取回收率选取低、中、高3个质控质量浓度进行考察，每个质量浓度水平平行6份。结果见表3。

2.5.5 稳定性

取低、中、高质量浓度的睾酮质控溶液，加入大鼠空白血浆，配成各浓度标准质控血浆样品。分别对进样器放置24 h、冰箱4 ℃放置8 h、-80 ℃冻存30 d冻融条件下的稳定性进行考察，每考察项为每质量浓度3份平行样本。结果见表4。

2.6 睾酮含量测定

2.6.1 实验过程

取不育症模型SD大鼠8只，空白组大鼠4只，实验组灌胃受试药（毛蕊花糖苷对照品（100 mg·kg^-1），于给药前及给药后0、5、10、15、30 min，1、2、3、4、6、8、12、24 h分别从大鼠眼眶静脉插管取血约2 mL，加入肝素抗凝，4 ℃静置2 h后以3 000 r·min^-1离心10 min，分离得到血浆，置于-80 ℃备用。

2.6.2 测定结果

样品测定前从冰箱取出，室温融化，按照2.3项下方法处理，取上清液，进样5 μL，UPLC-MS/MS上机测定。采用内标法定量计算，根据当日标准曲线计算血清中睾酮的质量浓度，结果见表5。

2.7 睾酮质量浓度时间AUC

根据已知数据参数，用Graphpad 8.0构建空白组和毛蕊花糖苷干预组大鼠睾酮AUC曲线，用Kinetica 5.1计算睾酮质量浓度AUC，结果见图2、表6。结果显示，毛蕊花糖苷干预组24 h睾酮水平C_max为7.92 ng·mL^-1，空白组C_max为10.06 ng∙mL^-1。与空白组比较，毛蕊花糖苷干预组大鼠睾酮24 h总AUC相对平稳。

3 讨论

3.1 睾酮测定方法的选择

目前对睾酮水平检测的方法主要有3种，分别是酶联免疫吸附试验、放射免疫法和液质联用法，所有这些方法都存在一定的技术限制^［7］。酶联免疫吸附试验操作简便，它将化学发光技术与免疫反应结合起来，由于血清含杂质多，而且标准曲线是根据睾酮水平建立的，再加上病理性低睾酮水平在标准曲线以外，因此检测灵敏度不高；放射免疫法不能同时分离测定多种激素，交叉污染发生率较高^［8］。液质联用分析法则因特异性强而被认为是睾酮水平定量的“金标准”^［9］。

在临床检验部门，睾酮水平的测定通常是通过酶联免疫吸附试验或放射免疫法的自动进样分析设备进行的。尽管这些方法因快速、方便而广泛使用，但是在睾酮基础水平较低的情况下，该方法测定结果并不准确^［10］。有研究结果显示，不同检测方法的个体样品偏倚模式不同，雅培（Abbott）测定的睾酮质量浓度较高，罗氏（Roche）、IMMULITE和贝克曼（Beckman）测定的睾酮质量浓度较低^［11］。国外有实验研究表明，采用前列腺癌睾酮抑制治疗的患者接受不同测定方法得到的睾酮水平报告存在差异，会对临床疗效的评估产生偏倚^［12］。而液质联用分析法有进样量少、灵敏度高的优势。本实验血清样品按照24 h药动学取血方式，取样量少，同时不育症模型大鼠睾酮水平偏低，基于此，为保证本实验分析结果的准确性与可靠性，选择液相质谱联用法。

3.2 基质效应的消除

基质效应，是指生物试样中被解析物质之外的组成部分，对待测物的分析过程产生的干扰和负面影响，是由共流出的待测物与基质的竞争和离子化效率所造成的^［13］。为了减少基质效应对测定结果的干扰^［14］，本实验采用了样品前处理考察、同位素内标法和基质标准溶液校正的方法进行优化。

样本前处理技术主要有蛋白沉降法（precipitation of protein， PP），液液萃取法（liquid-liquid extraction， LLE）和固相萃取（solid phase extraction， SPE）等^［15］。鉴于每种前处理方法都是瑕瑜互见，在保持减少基质效应与提高回收率相对平衡的基础上，充分考虑到待测物质的理化性质、基质特性、方法建立的简单性和稳定性、样品预处理所需的时间、可靠性和成本^［16］，应优化并消除可能导致基质效应的因素。不同前处理方法提取回收率及基质效应存在较大差异，有对比研究结果显示，基质效应：固相法>蛋白沉淀法>液液萃取法^［17］。考虑到该文献的研究对象是糖皮质激素而非睾酮，故在正式实验前考察了蛋白沉淀法与液液萃取法的提取回收率及基质效应。由于蛋白沉淀法对基质的盐类和脂类消除效果不佳，因而基质效应相对大；而液液萃取法虽基质效应小，但提取回收率因操作步骤多，样本量小，结果不如蛋白沉淀法。固相萃取法因成本高，不便后期批量处理，故未做考察。考虑到液质联用时不同内源性磷脂的血清中存在基质效应^［18］，同时结合各前处理方法的特性，最终选择液液萃取法，在正式实验测定时，为了避免液液萃取对回收率的影响，除了通过合理调整萃取剂的比例，降低稀释倍数，还使用内插管进样，减少初始流动相的稀释次数。

睾酮的同位素内标是睾酮-C3，它与睾酮具有相同的保留时间和化学性质，因而在液相质谱联用测定时，可以有效地降低基质效应带来的影响。但同时应当注意的是，应设定充分的平衡时间^［19］，保证所加入的同位素睾酮-C3在血清中与已存在的睾酮达到稳定、均一的状态。睾酮是内源性激素，在空白血浆中也有较高的本底。在制作标准曲线时，由于血浆中内源性睾酮对测定易产生干扰^［20］，故不建议使用空白组血浆，可选用去除激素的血浆作为建立方法学的基质。

4 结论

本实验以不育症模型大鼠睾酮含量测定作为研究对象，并对其进行了方法学考察，所建立的UPLC-MS/MS方法为快速有效地检测体内睾酮水平提供参考依据；同时，通过药动学软件分析评价，空白组和毛蕊花糖苷干预组大鼠睾酮总AUC保持一致，从PK/PD角度比较分析推测出，给予毛蕊花糖苷干预后，不育症模型大鼠的24 h总睾酮可基本恢复正常水平，从而发挥生殖调节的作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82160772)

新疆维吾尔自治区科技厅科技创新领军人物后备人选项目(2019XS14)

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2022D01C260)