HPLC法测定愈创甘油醚有关物质

Determination of related substances in guaifenesin by HPLC

摘要

目的 建立测定愈创甘油醚原料药有关物质的高效液相色谱法。 方法 色谱柱为Agilent ZORBAX SB C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为水-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为273 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。 结果 愈创甘油醚峰与其杂质峰均能良好分离。杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的各质量浓度与峰面积的线性关系良好（r≥0.999 7），平均加样回收率分别为98.29%、101.35%、101.81%、101.05%，RSD值分别为1.02%、0.65%、2.83%、0.90%（n=9）。 结论 该方法专属性强、准确度高，可用于愈创甘油醚原料药有关物质的测定，为国内愈创甘油醚原料药质量的提升提供技术支撑。

Abstract

Objective To establish an HPLC method for the determination of related substances in guaifenesin active pharmaceutical ingredient （API）. Methods The chromatographic column was Agilent ZORBAX SB C₁₈ （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， and the mobile phase was water-acetonitrile （gradient elution）. The flow rate was 1.0 mL·min^-1， the detection wavelength was 273 nm， the column temperature was 30 ℃， and the injection volume was 10 μL. Results The peaks of guaifenesin and its impurities were well separated. The linear relationships between the mass concentrations and peak areas of impurities A， B， C， and D were good （r≥0.999 7）， and the average recoveries （n=9） were 98.29%， 101.35%， 101.81% and 101.05%， and the RSDs were 1.02%， 0.65%， 2.83% and 0.90%， respectively. Conclusion The method is specific and accurate， and could be used for the determination of related substances in guaifenesin API， providing technical support for the improvement of the quality of guaifenesin API in China.

Graphical abstract

关键词

愈创甘油醚 / 有关物质 / 质量控制 / 高效液相色谱法

Key words

guaifenesin / related substances / quality control / HPLC

愈创甘油醚又称愈创木酚甘油醚，作为药物一般用于祛痰，其能刺激胃黏膜，反射性引起支气管黏膜腺体分泌增加，降低痰液黏性，使黏痰易于咳出^［1-7］。其质量标准收载于《卫生部药品标准》化学药品及制剂第一册WS₁-139-83-89、国家食品药品监督管理局标准YBH24572005、《欧洲药典》（EP）10版、《美国药典》（USP）43版和《日本药局方》（JP）17版^［8-12］。其中，WS₁-139-83-89未控制有关物质项，仅用比色法控制游离愈创木酚，专属性差；JP17版用薄层色谱法控制有关物质项，灵敏度低，无法准确测定；其余标准均采用HPLC法控制有关物质项，但存在杂质峰未分离、溶剂效应、系统适用性要求低和限度较宽松等问题。

目前，国内有关于愈创甘油醚的质量研究多为制剂含量测定，未见愈创甘油醚原料药中有关物质检查的文献报导^［13-21］，为严格控制其质量，本研究对EP10和USP43的愈创甘油醚有关物质的检查方法进行了优化，建立了专属性强、准确度高的测定方法，为愈创甘油醚原料药质量标准的提高提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（含二极管阵列检测器，沃特世公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（含二极管阵列检测器，安捷伦公司）；Thermo Ultimate 3000型高效液相色谱仪（含二极管阵列检测器，赛默飞世尔公司）；XS205DU电子天平（十万分之一，梅特勒公司）；Milli-Q Reference纯水器（默克公司）。

1.2 试药

对照品：愈创甘油醚（批号100528-201303，含量为99.6%），杂质A（愈创木酚，批号111510-201804，含量为100.0%）均购自中国食品药品检定研究院；杂质B（批号1964-083A3，含量为98.6%），杂质C（批号1530-054A6，含量为94.4%），杂质D（批号1461-043A3，含量为98.7%）均购自加拿大TLC公司，各对照品的化学结构式见图1。乙腈为色谱纯；水为超纯水。

愈创甘油醚原料药（批号：GGER-1610005、GGER-1908001、GGER-1908002，A公司；批号：19GF12995、19GF12997、19GF12998，B公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0~10 min， 78%A；10~25 min，78%A→20%A；25~30 min，20%A→78%A；30~35 min， 78%A）。流速为1.0 mL·min^-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长为273 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液

精密称取本品0.1 g，置于50 mL量瓶中，加入体积分数为22%的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液

精密量取2.2.1项下制备的供试品溶液1 mL，置于200 mL量瓶中，加入体积分数为22%的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 灵敏度溶液

精密量取2.2.2项下制备的对照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为22%的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 系统适用性溶液

取愈创甘油醚对照品20 mg，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为22%的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 混合对照品溶液

精密称取各对照品适量，分别置于量瓶中，加入体积分数为22%的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（愈创甘油醚、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的质量浓度分别为0.198 5、0.121 0、0.205 5、0.037 48、0.037 96 mg·mL^-1）。精密量取各组分对照品储备液各5 mL，置于同一50 mL量瓶中，加入体积分数为22%的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性实验

取2.2项下制备的各溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果系统适用性溶液中，愈创甘油醚峰与相对保留时间为0.93的杂质峰的分离度为2.2；灵敏度溶液中，愈创甘油醚峰峰高的信噪比为12；混合对照品溶液中，各色谱峰间的分离度均大于5.0，表明该方法的系统适用性良好。色谱图见图2。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性实验

取愈创甘油醚原料药，在加热、强酸、强碱、氧化、光照条件下进行强制降解实验，结果表明，愈创甘油醚原料药在酸和光照条件下较为稳定，在碱破坏、氧化破坏和加热破坏条件下，有少量降解杂质产生，各降解杂质与愈创甘油醚峰间以及各杂质之间均有良好的分离度。色谱图见图3。

2.4.2 校正因子和线性关系实验

取2.2.5项下制备的对照品储备液，配制各质量浓度的系列溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以各成分质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，并以主成分线性方程斜率与各杂质线性方程斜率的比值计算各杂质的相对校正因子，结果见表1。由表1可见，杂质B和杂质C的校正因子分别为1.1、0.9，当校正因子在0.9~1.1范围内时，可不加校正因子计算。杂质A和杂质D的校正因子分别为0.6、0.7，均需加校正因子计算。

2.4.3 精密度实验

量取2.2.5项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件重复进样测定5次，记录各色谱峰面积。计算得愈创甘油醚、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D峰面积的RSD值分别为0.37%、0.92%、0.53%、2.24%、1.26%，结果表明仪器的精密度良好。

2.4.4 回收率实验

取已知杂质含量的愈创甘油醚原料药（批号GGER-1908001），根据拟定限度分别加入各杂质，制备杂质限度80%、100%、120%的加标溶液，每个质量浓度制备3份，按照2.1项下色谱条件测定，记录各色谱峰面积，计算回收率，计算得杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的回收率分别为98.29%、101.35%、101.81%、101.05%，RSD值分别为1.02%、0.65%、2.83%、0.90%。结果表明方法的准确度良好。

2.4.5 重复性实验

取愈创甘油醚原料药（批号GGER-1908001）6份，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件测定，结果均检出5个杂质峰，其中，杂质A均未检出，杂质B含量为0.07%（RSD值为3.05%），杂质C和杂质D的含量均小于定量限，相对保留时间为0.89，未知杂质的含量小于定量限；相对保留时间为0.93，未知杂质的含量为0.065%（RSD值为2.94%）。结果表明方法的重复性良好。

2.4.6 检测限及定量限实验

量取2.2.5项下制备的混合对照品溶液，加入体积分数为22%的乙腈溶液逐级稀释，作为检测限和定量限溶液，按照2.1项下色谱条件测定，记录各色谱图，以信噪比为3∶1时的响应质量浓度作为检测限，以信噪比为10∶1时的响应质量浓度作为定量限，结果显示，愈创甘油醚、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的检测限分别为0.15、0.13、0.13、0.06、0.05 μg·mL^-1，定量限分别为0.48、0.50、0.48、0.25、0.20 μg·mL^-1。

2.4.7 耐用性实验

取2.2.4项下制备的系统适用性溶液，按照2.1项下色谱条件，取不同批次的Agilent ZORBAX SB C₁₈色谱柱，在沃特世、安捷伦、赛默飞世尔等不同品牌的液相色谱仪上进行测定，结果愈创甘油醚峰与相对保留时间0.93的杂质峰分离良好，分离度均≥1.6，各已知杂质的相对保留时间一致，表明方法的耐用性良好。

2.4.8 稳定性实验

取2.2.1项下的供试品溶液，置于15 ℃保存，分别在0、24、36、48 h，按照2.1项下色谱条件进行测定，结果供试品溶液的杂质数量及杂质含量基本一致，表明供试品溶液在15 ℃条件下48 h内稳定性良好。

2.4.9 样品测定

取6批愈创甘油醚原料药，按照2.2项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，再按照2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按加校正因子的主成分自身对照法计算样品中的有关物质含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 流动相系统的考察

实验考察EP10和USP43的体积分数为1%的冰醋酸溶液-乙腈流动相体系，结果主峰和已知杂质的分离情况一致。另考察水-乙腈和三氟乙酸溶液-乙腈等流动相体系，结果分离效果与体积分数为1%的冰醋酸-乙腈流动相体系基本一致。实验发现，在EP10和USP43的流动相体系下，主峰内包含了一个未知杂质峰，未能有效分离。故对色谱系统进行优化，优化后，在拟定色谱条件下，主峰内包含的未知杂质峰得到了分离，其相对保留时间为0.93，与主峰间的分离度为2.2；其已知杂质A、杂质B、杂质C和杂质D也能得到良好的分离和测定。

3.2 测定波长的选择

用二极管阵列检测器，考察混合对照品溶液和供试品溶液在200~400 nm波长范围内的紫外吸收。结果显示，各已知杂质峰和愈创甘油醚峰的最大吸收波长约为273 nm，其271~275 nm为宽幅吸收，故拟确定测定波长为273 nm。

3.3 溶剂的考察

实验考察EP10和USP43的色谱方法，EP10以水为溶剂，USP43以乙腈为溶剂，结果显示，以乙腈为溶剂时，愈创甘油醚峰前延，峰形差；以水为溶剂时，愈创甘油醚峰形较佳，但杂质C和杂质D在水中的溶解度差。考察使用梯度洗脱的初始流动相即体积分数为22%的乙腈溶液，结果显示愈创甘油醚峰形良好，且杂质C和杂质D在体积分数为22%的乙腈溶液中能较好的溶解，故将溶剂拟定为体积分数为22%的乙腈溶液。

3.4 系统适用性实验的考察

在EP10和USP43的有关物质项下，系统适用性实验均采用愈创甘油醚和愈创木酚（杂质A）的分离度来控制系统分离度，实验结果显示，愈创甘油醚峰和杂质A峰间的分离度达到17.3，远大于规定的3.0，但主峰内仍有未分离的杂质峰，可见该系统适用性实验无法体现主峰与各杂质间的分离效能。

通过2.4.1项下强制降解实验结果可知，主峰前相邻的杂质（相对保留时间为0.93）不随强制降解而增大，推测为工艺杂质。而中国食品药品检定研究院供应的愈创甘油醚对照品（批号为100528-201303）含有该杂质，故拟以愈创甘油醚对照品配制质量浓度为2 mg·mL^-1的溶液，作为系统适用性实验溶液，并以主峰与相对保留时间约为0.93的杂质峰的分离度应大于1.5作为系统适用性实验要求。

3.5 已知杂质的控制

比较EP10和USP43对于已知杂质的控制，均用相对保留时间定位已知杂质峰，并以加校正因子的主成分自身对照法进行定量，考虑到杂质B、杂质C、杂质D较难获得，故参考EP和USP的方法对已知杂质进行控制，其中，杂质B和杂质C无需使用校正因子，杂质A和杂质D的峰面积分别乘以校正因子0.6、0.7进行计算。

4 结论

本文建立了愈创甘油醚有关物质检测方法，该方法能有效分离和测定愈创甘油醚中4个已知杂质及其他未知杂质的含量，且操作简单、专属性强、准确度高，可用于愈创甘油醚原料药的质量控制，为产品质量的提升提供了检验依据。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典临床用药须知：化学药和生物制品卷：2015年版 ［S］.北京：中国医药科技出版社，2017：311.

[2] 谢波.疏风止嗽汤治疗慢性咳嗽的临床疗效［J］. 中国现代医生，2022，60（2）：131-133，137.

[3] 柯月娇，张勇，蔡斌，等.医院制剂复方甘草口服溶液质量回顾分析［J］. 安徽医药，2022，26（1）：205-208.

[4] 陈昌略，王必伟.复合固体碱催化一锅法合成愈创木酚甘油醚研究［J］. 化工生产与技术，2021，27（6）：9-11，8.

[5] 曹桂红，黄春青，许波.HPLC法测定复方愈酚麻黄糖浆中愈创甘油醚和马来酸氯苯那敏［J］. 中国药品标准，2018，19 （2）：120-125.

[6] 马辉，金丹，赵频，等.儿童祛痰类化学药风险干预研究［J］. 中国新药杂志，2014，23（4）：489-492.

[7] 陶玉菡.西药类抗感冒药成分分析及其使用建议［J］. 临床医药文献电子杂志，2017，4（22）：4344-4345.

[8] 中华人民共和国卫生部. 卫生部药品标准：化学药品及制剂.第一册 ［S］. 1989：158-159．

[9] 国家食品药品监督管理局. 国家药品标准：YBH24572005 ［S］. 2005.

[10] 欧洲药典委员会. 欧洲药典10.0 ［S］. 2020：2791-2792.

[11] 美国药典委员会. 美国药典43 ［S］. 2020：2169-2170.

[12] 日本药典委员会. 日本药局方.第17版 ［S］. 2016：1002.

[13] 蔡锦雄，庞赛，刘敏，等.顶空气相色谱法测定愈创甘油醚中残留溶剂［J］. 黑龙江医药，2022，35（2）：313-315.

[14] 柴洪帆，郑扬，曹霞.愈创木酚甘油醚和右美沙芬复方制剂中杂质同时测定的方法研究［J］.中国药业，2017，26（16）：18-23.

[15] 张丹，王小旭，谢贺贺.UPLC法同时测定感冒解痛散中10种成分的含量［J］. 西北药学杂志，2021，36（4）：555-559.

[16] 翟明翚，韩爽，王颖，等.高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分愈创甘油醚对映体［J］. 分析科学学报，2020，36（1）：139-142.

[17] 马辉，金丹，赵频，等.儿童祛痰类化学药风险干预研究［J］.中国新药杂志，2014，23（4）：489-492.

[18] 梁爱仙，庞发根，刘敏，等.高效液相色谱法同时测定氨咖愈敏溶液中4种成分含量［J］. 中国药业，2019，28（16）：29-31.

[19] 韩松涛，王维华，王佳楠.美愈伪麻口服溶液3种有效成分含量测定方法的建立［J］. 临床医药文献电子杂志，2016，3（46）：9100-9101.

[20] 路楠，田晶晶，胜芙蓉，等.愈创木酚甘油醚缓释片的制备及其体外释放度的考察［J］. 辽宁医学院学报，2015，36（5）：1-4，111.

[21] 曹桂红，黄春青，许波.HPLC法测定复方愈酚麻黄糖浆中愈创甘油醚和马来酸氯苯那敏［J］.中国药品标准，2018，19（2）：120-125. （修订日期：2023-11-20）

基金资助

国家药典委员会国家药品标准提高项目(药典综［2019］35号)