硬尖神香草提取物对哮喘幼鼠气道重塑的作用机制

Mechanism of airway remodeling effect of the extract of Hyssopus cuspidatus Boriss in asthmatic young rats

摘要

目的 探讨硬尖神香草提取物通过转化生长因子-β₁（transforming growth factor-β₁，TGF-β₁）/母亲信号蛋白同源物（Mothers against decapentaplegic homologs，Smads）通路调控上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）对哮喘幼鼠气道重塑的作用。 方法 将幼鼠随机分为模型组、硬尖神香草（提取物）低剂量组（25 mg·kg^-1）和硬尖神香草高剂量组（50 mg·kg^-1）及阳性药物组（二羟丙茶碱，20 mg·kg^-1），各20只，另设对照组。比较支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）各类炎症细胞数及细胞因子白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，HE染色观察肺组织病变，比较肺组织气道壁、平滑肌厚度，对比E钙黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β₁、母亲信号蛋白同源物2（Mothers against decapentaplegic homolog 2，Smad2）以及母亲信号蛋白同源物3（Smad3）mRNA与蛋白的表达水平。 结果 与对照组比较，模型组嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）、中性粒细胞（neutrophil，NEU）、淋巴细胞（lymphocyte，LYM）细胞数、支气管气道壁、平滑肌厚度、IL-4、TNF-α、MMP-9水平以及α-SMA、TGF-β₁ mRNA与α-SMA、TGF-β₁、p-Smad2和p-Smad3蛋白水平均升高，E-cadherin mRNA与蛋白水平降低（P<0.05）；与模型组比较，硬尖神香草低剂量组和高剂量组、阳性药物组的EOS、NEU、LYM细胞数、支气管气道壁、平滑肌厚度、IL-4、TNF-α、MMP-9以及E-cadherin mRNA和蛋白水平均升高，α-SMA、TGF-β₁ mRNA、α-SMA、TGF-β₁、p-Smad2与p-Smad3蛋白水平均降低（P<0.05）；且各指标水平变化规律是阳性药物组最明显，硬尖神香草高剂量组次之，硬尖神香草低剂量组最弱（P<0.05）；HE结果显示，硬尖神香草低剂量和高剂量组、阳性药物组肺组织支气管气道损伤较模型组出现不同程度改善，硬尖神香草高剂量组和阳性药物组改善明显。 结论 硬尖神香草提取物能有效抑制哮喘幼鼠气道重塑，可能通过调控TGF-β₁/Smads通路调控相关mRNA和蛋白的表达，抑制EMT发挥作用。

Abstract

Objective To investigate the effect of the extract of Hyssopus cuspidatus Boriss （EHC） on airway remodeling in asthmatic infant rats by regulating epithelial-mesenchymal transition （EMT） through transforming growth factor-β₁ （TGF-β₁）/Mothers against decapentaplegic homologs （Smads） pathway. Methods The young rats were randomly divided into model group， low-dose EHC group （10 mg·kg^-1）， high-dose EHC group （40 mg·kg^-1） and positive drug group （dihydroxypropylline， 20 mg·kg^-1）， and control group， with 20 rats in each group. The number of inflammatory cells and the levels of cytokines interleukin-4 （IL-4）， matrix metalloproteinase 9 （MMP-9） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were compared. The lung tissue lesions were observed by HE staining， and the thickness of airway wall and smooth muscle of lung tissue， the mRNA and protein expression of E-cadherin， α‍-smooth muscle actin（α‍-SMA）， TGF-‍β₁， Mothers against decapentaplegic homolog 2 （Smad2）， Mothers against decapentaplegic homolog 3 （Smad3） were compared. Results Compared with the control group， the number of eosinophil （EOS）， neutrophil （NEU） and lymphocyte （LYM） cells， bronchial airway wall and smooth muscle thickness， IL-4， TNF-α and MMP-9 levels， the mRNA and protein levels of α‍-SMA， TGF-‍β₁ and α‍-SMA， TGF-β₁， p-Smad2 and p-Smad3 were increased， while the mRNA and protein levels of E-cadherin were decreased in model group （P<0.05）. Compared with the model group， the number of EOS， NEU and LYM cells， bronchial airway wall and smooth muscle thickness， IL-4， TNF-α and MMP-9 levels， the mRNA and protein levels of E-cadherin increased， while the α‍-SMA， TGF-‍β₁ mRNA and α‍-SMA， TGF-‍β₁， p-Smad2， p-Smad3 protein levels decreased in the low and high dose EHC groups and positive drug group （P<0.05）； Moreover， the changes in the levels of various indices were the most obvious in the positive drug group， followed by the high dose EHC groups， and the lowest was the low dose EHC groups （P<0.05）. HE results showed that， compared with the model group， the injury was improved to different degrees， and the improvement was obvious in the high-dose group and the positive drug group. Conclusion EHC can effectively inhibit airway remodeling in asthmatic young mice， possibly by regulating TGF-‍β₁/Smads pathway to regulate related mRNA and protein expression and inhibit EMT.

Graphical abstract

关键词

硬尖神香草提取物 / 哮喘 / 上皮-间质转化 / 气道重塑 / 转化生长因子-β₁ / 母亲信号蛋白同源物

Key words

extract of Hyssopus cuspidatus Boriss （EHC） / asthma / epithelial-mesenchymal transformation / airway remodeling / transforming growth factor-β₁ / mothers against decapentaplegic homolog

哮喘是一种以慢性气道炎症为典型症状的异质性疾病^［1］，由于长期慢性炎症引发气道结构改变，气道壁、平滑肌厚度增加，导致气道重塑^［2-3］。由气道重塑引发的损伤是哮喘发病机制中的重要环节之一，即上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）^［4］。母亲信号蛋白同源物（Mothers against decapentaplegic homologs，Smads）和转化生长因子-β₁（transforming growth factor β₁，TGF-β₁）构成TGF-β‍₁/Smads通路，经TGF-β₁和受体磷酸化调节Smads相关靶基因表达水平，促进EMT发生及相关分子表达^［5］。硬尖神香草是唇形科植物硬尖神香草的全草，具有清热解毒、消炎等作用，常用于治疗感冒、发烧及咳嗽等，硬尖神香草提取物具有抗哮喘、抑菌、抗氧化及降血糖等药理作用^［6］。本研究通过构建幼鼠哮喘模型，探讨硬尖神香草提取物对气道重塑的影响及可能的作用机制，为临床治疗哮喘提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CX43生物显微镜（日本Olympus公司）；CFX96实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；双垂直电泳仪、电泳槽均购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 试药

硬尖神香草提取物（10∶1，规格为25 kg，杨凌慈缘生物技术有限公司）；二羟丙茶碱（规格为25 g，上海吉至生化科技有限公司）；白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP-9）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α， TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自美国R&D公司；卵蛋白（ovalbumin，OVA）、3，3'-二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均购自美国Sigma公司；兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多抗（美国Proteintech Group公司）；兔抗E-钙黏蛋白（E-cadherin）单抗、兔抗母亲蛋白同源同源物3（Mothers against decapentaplegic homolog 3，Smad3）单抗以及磷酸化Smad3（phospho Smad3，p-Smad3）单抗均购自美国Bioworld公司；兔抗TGF-β₁多抗、兔抗母亲蛋白同源物2（Mothers against decapentaplegic homolog 2，Smad2）单抗、磷酸化Smad2（phospho Smad2，p-Smad2）单抗以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司。

1.3 动物

SPF级雄性SD幼鼠100只，体质量为80~100 g，4周龄，购自四川省中医药科学院，生产许可证号为SCXK（川）2018-19。购入后保持室内温度在（24±1） ºC，空气相对湿度为（60%±10%），光照昼夜交替循环12 h，室温饲养1周。

2 方法

2.1 建模与分组

随机取80只幼鼠，用卵白蛋白（OVA）-致敏法^［7］建立哮喘模型：幼鼠腹腔内注射1 mL现配致敏溶液（100 mg OVA+100 mg氢氧化铝），分别在第1天、第8天致敏，15 d后置于雾化箱中，添加10 g·L^-1 OVA生理盐水溶液，并通过超声雾化20 min激发哮喘，隔日1次，共4周，当幼鼠出现点头、站立不稳、呼吸加快和腹肌痉挛等现象，即为建模成功。取建模成功的80只幼鼠，随机均分为模型组、硬尖神香草提取物低剂量（简称硬尖神香草低剂量）组、硬尖神香草高剂量组和阳性药物组，各20只，余下20只为对照组。

2.2 干预方法

对照组分别在第1、8天腹腔注射生理盐水1 mL，15 d后添加蒸馏水进行超声雾化。硬尖神香草低剂量组、硬尖神香草高剂量组和阳性药物组在超声雾化激发前30 min，分别灌胃25、50 mg·kg^-1［8］硬尖神香草提取物溶液和20 mg·kg^-1二羟丙茶碱。

2.3 样品采集

末次给药24 h后，处死幼鼠，采用“Y”形管插管，加入无菌生理盐水2 mL，灌洗肺泡，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），离心提纯，置于-80 ºC存储备用；剥离幼鼠两侧肺组织，取右侧肺组织置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定，左侧肺组织置于-80 ºC存储备用。

2.4 BALF中炎症细胞数量

取-80 ºC存储备用的BALF，在室温下自然解冻，混匀后以1 500 r·min^-1离心5 min，离心半径为10 cm，制备细胞涂片，用迪夫快速染色液Ⅰ染色10 s，取出吸水纸吸取多余液体，迪夫快速染色液Ⅱ染色20 s，取出吸水纸吸取多余液体，自然干燥，用光学显微镜观察并用Single软件自动识别与计算细胞嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）、中性粒细胞（neutrophil，NEU）和淋巴细胞（lymphocyte，LYM）的数量。

2.5 BALF细胞因子的检测

取-80 ºC存储备用的BALF，以1 000 r·min^-1离心5 min，离心半径为10 cm，取上清液，抗体包被过夜（0.1 mL，37 ℃）、洗涤，加入待测样品（0.1 mL，37 ℃，1 h）、洗涤，加入酶标抗体（0.1 mL，37 ℃，1 h）、洗涤，加TMB底物液显色（0.1 mL，37 ℃，30 min），添加2 mol·L^－1硫酸终止反应（0.05 mL），用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算IL-4、TNF-α和MMP-9的含量。

2.6 肺组织的病理学变化

取用40 g·L^-1多聚甲醛固定备用的肺组织，用石蜡包埋，切片（5 μm），加热脱蜡，用苏木精染色3~5 min，清洗，置于体积分数为1%的过氧化氢中浸泡10~30 s，用水洗，用伊红染色20 min，用水洗，脱水10 min，透化（二甲苯，10 min），用中性树脂封固，在光学显微镜下观察。

2.7 肺组织气道形态学参数的比较

取用40 g·L^-1多聚甲醛固定备用的肺组织，选择具有完整支气管横断面的镜检染色切片，用BI2000分析系统测量支气管基底膜周径（bronchial basement membrane perimeter，Pbm）、支气管总面积（airway total wall area 1，WAt₁）、管腔面积（airway total wall area 2，WAt₂）、平滑肌外缘内气管面积（airway smooth muscle area 1，WAM₁）和平滑肌内缘内气管面积（airway smooth muscle area 2，Wam₂），通过计算幼鼠肺组织支气管壁、平滑肌厚度，判断其气道重塑程度。计算公式^［9］：气道壁厚度=（WAt₁-WAt₂）/Pbm，平滑肌厚度=（WAM₁-Wam₂）/Pbm。

2.8 E-cadherin、α-SMA、TGF-β₁、Smad2和Smad3 mRNA水平的检测

取-80 ºC存储备用的肺组织，匀浆，用Trizol法提取总RNA，测量纯度、质量浓度，逆转录得cDNA，进行实时荧光定量PCR。反应体系：Taq聚合酶1 μL、上下游引物各1 μL、模板cDNA 5 μL和双蒸水16 μL。扩增条件：预变性（94 ºC，30 s），变性（94 ºC，5 s），退火（59 ºC，30 s），共40个循环。以β-actin为内参基因，数据分析采用2^-△△Ct法，重复多次，取Ct平均值。引物序列见表1。

2.9 诸项指标蛋白水平的检测

取-80 ºC储存备用的肺组织，加RIPA裂解液裂解，离心后取上清液，蛋白BCA试剂盒确定总蛋白质量浓度，待测蛋白样品进行电泳分离（100 V，80 min），转至聚偏二氟乙烯膜（250 mA恒流），置于含50 g·L^-1脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液中封闭2 h，将样品与E-cadherin（1∶200）、α‍-SMA（1∶500）、TGF-β₁（1∶500）、Smad2（1∶1 000）、p-Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）及β‍-actin（1∶800）一抗在4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，再加二抗（1∶1 000）孵育（25 ºC，2 h），反复洗膜、曝光后显影。用Image J软件检测样品条带和β-actin条带灰度值，计算目标蛋白的相对表达水平。目标蛋白相对表达水平=目标条带灰度值/β-actin条带灰度值。

2.10 统计学方法

用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（\overline{x}±s）表示，多样本计量资料比较用单因素方差分析，组间比较进行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 BALF中炎症细胞数量的比较

与对照组比较，模型组EOS、NEU和LYM细胞数量增加（P<0.05）；与模型组比较，硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组EOS、NEU和LYM细胞数量均减少（P<0.05）；与硬尖神香草低剂量组比较，硬尖神香草高剂量组、阳性药物组EOS、NEU和LYM细胞数量均减少（P<0.05）；硬尖神香草高剂量组与阳性药物组细胞数量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3.2 BALF中细胞因子的比较

与对照组比较，模型组IL-4、TNF-α和MMP-9水平升高（P<0.05）；与模型组比较，硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组IL-4、TNF-α和MMP-9水平均降低（P<0.05）；与硬尖神香草低剂量组比较，高剂量组、阳性药物组IL-4、TNF-α和MMP-9水平均降低（P<0.05）；高剂量组与阳性药物组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3.3 肺组织病理变化的比较

HE结果显示，对照组幼鼠肺组织结构清晰，支气管黏膜上皮厚度均匀、排列整齐，管腔无收缩，气道周围未见炎症细胞浸润；模型组黏膜上皮细胞排列紊乱，管腔收缩，支气管壁、平滑肌层及基底膜变厚，气道周围出现大量炎症细胞浸润；硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组幼鼠支气管气道损伤较模型组均出现明显改善；硬尖神香草高剂量组、阳性药物组改善显著，支气管管腔扩大，支气管壁、平滑肌层以及基底膜增厚现象减轻，气道周围炎症细胞浸润减少。见图1。

3.4 肺组织气道壁、平滑肌厚度的比较

与对照组比较，模型组气道壁、平滑肌厚度增加（P<0.05）；与模型组比较，硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组气道壁、平滑肌厚度均降低（P<0.05）；与硬尖神香草低剂量组比较，硬尖神香草高剂量组、阳性药物组气道壁、平滑肌厚度均降低（P<0.05）；硬尖神香草高剂量组和阳性药物组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3.5 肺组织诸项指标水平的比较

与对照组比较，模型组α-SMA、TGF-β₁ mRNA水平升高，E-cadherin mRNA水平降低（P<0.05）；与模型组比较，硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组E-cadherin mRNA水平升高，α-SMA、TGF-β₁ mRNA水平降低（P<0.05）；与硬尖神香草低剂量组比较，高剂量组和阳性药物组变化明显（P<0.05），且阳性药物组变化最显著（P<0.05）。见表5。

3.6 肺组织诸项蛋白水平的比较

与对照组比较，模型组α-SMA、TGF-β₁、p-Smad2和p-Smad3蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低（P<0.05）；与模型组比较，硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组E-cadherin蛋白水平升高，α-SMA、TGF-β₁、p-Smad2和p-Smad3蛋白水平降低（P<0.05）；与硬尖神香草低剂量组比较，硬尖神香草高剂量组和阳性药物组变化显著（P<0.05），且阳性药物组变化最显著（P<0.05）。见表6、图2。

4 讨论

气道慢性炎症和气道重塑是哮喘气道改变的主要病理症状，也是引发AHR和气流阻塞的主要机制，其本质特点是气道EOS炎症^［10］。气道重塑是由多种细胞因子、炎性介质参与，并经一系列病理生理学效应导致的气道壁结构不可逆的变化过程。气道重塑不只存在于哮喘晚期，在轻度哮喘或哮喘早期已出现^［11］。

在支气管气道上皮细胞受损或促炎因子反应修复期间，因支气管上皮极性、紧密连接等特点丧失，游走、侵袭能力加强，间充质细胞标志物表达水平增加，出现EMT，导致气道壁、平滑肌增厚，且上皮细胞转化约1/3来自间质细胞，揭示了其在气道重塑中EMT的重要作用^［12］。炎性反应在哮喘发展进程中发挥重要作用，同时也被认为是哮喘发作的机制之一，即使与哮喘相关的临床症状已消失，但气道炎症和AHR仍存在，导致相关症状反复，最终造成气道重塑及不可逆的肺功能损伤^［13-14］。已有研究结果表明，神香草提取物能减少促炎因子分泌和炎症细胞浸润，减轻哮喘症状^［15］。

本研究结果显示，经硬尖神香草提取物干预后，BALF内EOS、NEU和LYM细胞数量，支气管气道壁、平滑肌厚度，IL-4、TNF-α和MMP-9等促炎因子水平降低，炎性反应得以改善，且硬尖神香草高剂量组改善效果与阳性药物组相当；HE结果显示，硬尖神香草2个剂量组和阳性药物组肺组织支气管、气道损伤均较模型组出现不同程度地改善，而且硬尖神香草高剂量组和阳性药物组改善效果明显。表明硬尖神香草提取物能有效减轻哮喘幼鼠支气管慢性呼吸道炎性反应及肺组织损伤，抑制气道重塑。

TGF-β₁是致使气道重塑的主要介质，同时也被作为EMT关键诱导因子之一^［16］。TGF-β₁能通过调节促炎因子、支气管气道壁以及平滑肌层增厚等方式参与哮喘发病过程，其质量浓度与气道炎症、ARH呈正相关，且TGF-β₁大量分泌、释放，诱导气道重塑发生，最终导致哮喘症状加重^［17］。Smads蛋白家族作为TGF-β信号转导系统的重要成员，能直接从细胞膜至细胞核传递信号，调控细胞增殖、分化与凋亡，Smad2与Smad3可直接参与信号转导，具有正反馈调节作用，促进纤维母细胞向纤维细胞转化及气道肌成纤维细胞增殖^［18］。EMT是在特定条件刺激下气道上皮细胞转化为具有间质表型特征细胞的生物学过程，体现在可调节细胞气道上皮标志物E-cadherin及等间质化标志物α-SMA的表达^［19］。FISCHER K D等^［20］研究发现，哮喘小鼠在支气管气道壁厚度增加的同时，气道上皮相关E-cadherin蛋白水平降低，表明气道壁厚度增加与EMT具有相关性。

本研究结果表明，硬尖神香草提取物能降低α-SMA、TGF-‍β₁ mRNA与α‍-SMA、TGF-‍β₁、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达，且阳性药物组低于硬尖神香草高剂量组，表明OVA-致敏法诱导哮喘幼鼠出现由EMT介导的气道重塑，表明硬尖神香草提取物能抑制EMT过程，减缓哮喘幼鼠气道炎症和损伤，可能基于TGF-β₁/Smads信号通路，通过调节E-cadherin、α-SMA蛋白表达进而调控EMT，抑制气道重塑，从而发挥治疗哮喘的作用。

综上所述，哮喘幼鼠存在气道重塑，而硬尖神香草提取物可能通过调控TGF-β₁/Smads信号通路相关mRNA和蛋白的表达，抑制EMT。

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基金资助

2018年河南省医学科技攻关计划项目(2018020599)