基于网络药理学研究沉香在睡眠障碍及焦虑疾病中的作用机制

Study on the action mechanism of Aquilariae lignum Resinatum in sleep disorders and anxiety diseases based on network pharmacology

摘要

目的 用网络药理学探讨沉香在睡眠障碍及焦虑疾病中的作用机制。 方法 在Tcmsp和Herb数据库中搜索并下载沉香对应的小分子化合物的数据，然后从Herb数据库中搜索并下载小分子化合物对应的靶基因及睡眠障碍和焦虑（sleep disorders and anxiety）对应的靶基因，并用Cytoscape构建药物-成分-靶点-疾病网络。基于Gene Ontology（GO）数据库、KEGG Pathway Database生物化学通路的数据库，对候选基因进行功能富集分析，用STRING进行蛋白质之间交互作用关系（protein-protein interaction，PPI）分析。 结果 筛选得到沉香的小分子化合物112个，获得其相对应的靶点，自Herb数据库中搜索得到睡眠障碍及焦虑对应点基因831个，得到成分与疾病关键靶点82个。其中zoomaric acid，6，7-dimethoxy-2-（27-phenylethyl）chromone，acetic acid可能是沉香治疗睡眠障碍及焦虑的重要成分；SRC、CTNNB1、TNF、PPARG、FOS等基因可能是沉香治疗睡眠障碍及焦虑的重要潜在靶点。GO富集分析结果显示，靶点涉及1 279个生物过程条目、97个细胞成分条目、123个分子功能条目。KEGG共富集到116条通路，主要涉及癌症通路、多巴胺能突触、脂质与动脉粥样硬化、乳腺癌等关键通路。 结论 沉香中的zoomaric acid，6，7-dimethoxy-2-（27-phenylethyl）chromone，acetic acid可能是治疗焦虑及睡眠障碍的成分，活性成分可能通过作用于SRC、CTNNB1、TNF、PPARG、FOS靶点发挥治疗焦虑及睡眠障碍的作用。

Abstract

Objective To explore the action mechanism of Aquilariae lignum Resinatum in sleep disorders and anxiety disorders by using network pharmacology. Methods The data of small molecule compounds corresponding to Aquilariae lignum Resinatum were searched and downloaded through Tcmsp and Herb databases， then the target genes corresponding to small molecule compounds and sleep disorders and anxiety were searched from Herb databases， and a drug-component-target-disease network was constructed with Cytoscape. Based on Gene Ontology and KEGG Pathway Database of biochemical pathways， the candidate genes were analyzed for function enrichment， and the protein-protein interaction （PPI） was analyzed by using STRING. Results 112 small molecule compounds of Aquilariae lignum Resinatum were screened， and their corresponding targets were obtained. 831 corresponding genes of sleep disorder and anxiety were searched in Herb database， and 82 key targets of components and diseases were obtained.Among them， zoomaric acid， 6，7-dimethoxy-2-（27-phenylethyl） chromone and acetic acid may be the important components of Aquilariae lignum Resinatum in the treatment of sleep disorders and anxiety； SRC， CTNNB1， TNF， PPARG， FOS and other genes may be important potential targets of Aquilariae lignum Resinatum in the treatment of sleep disorders and anxiety. GO analysis showed the target involved 1 279 biological process items， 97 cell component items and 123 molecular function items. 116 pathways was enriched by using KEGG， mainly involving cancer pathway， dopaminergic synapse， lipid and atherosclerosis， breast cancer and other key pathways. Conclusion Zoomaric acid， 6，7-dimethoxy-2-（27 phenylethyl） chromone， acetic acid may be the components for the treatment of anxiety and sleep disorders， and the active components may play a role in the treatment of anxiety and sleep disorders by acting on SRC， CTNNB1， TNF， PPARG， and FOS.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 沉香 / 睡眠障碍 / 焦虑

Key words

network pharmacology / Aquilariae lignum Resinatum / sleep disorders / anxiety

沉香为瑞香科植物白木香 Aquilaria Lam.和拟沉香属 Gyrinops Gaertn.植物含有树脂的木材，是我国名贵南药，为四大名香之首。自然生长的沉香树是无法生成沉香的，只有当它受到外部伤害（如雷劈、虫蛀或砍伤等）后，沉香树启动防御反应，在其伤口处分泌形成黑褐色的树脂，含有这些树脂的木材便称为沉香^［1-2］。《中华人民共和国药典》中及文献记载沉香有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效^［3-4］。自古沉香以熏香使用，沉香香气的主要成分为色酮及其衍生物、萜烯类和芳香族类化合物，能调节人体生理和心理功能，使人产生愉悦、舒适的感觉，对缓解睡眠障碍及焦虑有效^［5］。自新型冠状病毒肺炎大流行以来，在世界几个国家进行的调查分析表明^［6-8］，普通人群中失眠（20%~35%）、焦虑（20%~45%）的发病率非常高，而医务人员和新型冠状病毒肺炎患者的发病率更高^［9-11］。失眠的治疗方法有非药物疗法和药物疗法，其中作为非药物疗法的刺激控制疗法、放松疗法和认知疗法较为有效，然而因与睡眠限制、睡眠卫生管理相矛盾使其并不能发挥预期效果^［12］。苯二氮䓬类催眠药（如唑吡坦、右佐匹克隆等）是一线治疗药物。行为疗法和药物疗法相结合被认为是治疗标准^［12］。中医常用沉香治疗失眠^［13］。本文运用网络药理学探究沉香治疗睡眠障碍及焦虑的有效成分及作用靶点，为下一步机制研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 整体思路

沉香在睡眠障碍及焦虑中作用机制的网络药理学分析流程见图1。

1.2 沉香活性小分子化合物的搜索

首先从Tcmsp和Herb数据库中搜索并下载沉香对应的小分子化合物数据并取2个数据库的交集，以生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为标准进行筛选。

1.3 药物靶点的预测

根据上述得到的小分子化合物交集获得其在Herb数据库中的小分子化合物-靶基因关系对。

1.4 疾病靶点的预测

用Herb数据库检索睡眠障碍及焦虑对应的靶点基因，将检索到的靶点去除重复值。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

首先将获得的成分靶点和疾病靶点分别导入Venny平台，对疾病靶基因与小分子化合物靶基因取交集。然后将上述靶点和相对应的成分信息文件导入Cytoscape，构建网络，从而获得药物-活性成分-靶基因-疾病网络图。左侧节点（node）代表药物及成分，右侧节点代表靶点及疾病，二者之间的关系用边（edge）表示，度值（degree）代表节点大小，度值越大表示事物功能越多，该成分越重要。

1.6 基因功能富集分析

基于Gene Ontology（GO）数据库及KEGG Pathway database生物化学通路数据库，对候选基因进行功能富集分析。用统计学Fisher’s exact test找出功能条目联系单最大的基因，与每个功能条目对应的统计值（P值）表示显著性，P值越大，显著性越大，表示基因富集可能性越大，表明基因大部分对应该条目的功能。

1.7 PPI网络的构建

用STRING在线工具对选中的基因进行蛋白质之间交互作用关系（protein-protein interaction，PPI）分析。将获得的PPI关系导入Cytoscape软件，对PPI网络的拓扑结构进行分析。用网络统计学中的连接度（Connectivity Degree）分析，以Required Confidence（combined score>0.7）为蛋白质之间相互作用的筛选条件，得到PPI网络中参与蛋白相互作用的关键蛋白。

2 结果

2.1 数据检索

2.1.1 活性成分检索

首先从Tcmsp和Herb数据库中搜索并下载沉香对应的小分子化合物的数据，然后取2个数据库的交集。见图2。

2.1.2 药物靶点的预测

根据上述得到的所有小分子化合物交集，用Herb数据库预测各成分的靶点，获得其小分子化合物-靶基因关系对。见表1。

2.1.3 疾病靶点的预测

以“Sleep disorders and anxiet”为关键词，得到Herb数据库中睡眠障碍及焦虑对应的靶点基因，共831个。

2.1.4 成分-疾病交叉靶点的筛选

将获得的成分靶点和疾病靶点分别导入Venny平台，见图3。由图3可见，成分与疾病共有关键靶点82个。其中zoomaric acid，6，‍7-dimethoxy-2-‍（27-phenylethyl）chromone，acetic acid可能是治疗焦虑及睡眠障碍的成分。

2.2 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

2.2.1 网络构建

首先对疾病靶基因与小分子化合物靶基因取交集，用Cytoscape软件构建活性药物-活性成分-靶基因-疾病网络，网络中有边（edge）376条、节点（node）140个。节点（node）表示靶点，分别代表沉香、药物活性成分、关键靶基因以及睡眠障碍及焦虑疾病的靶点。边（edge）代表沉香与对应活性成分、活性成分与靶基因、疾病与靶基因的相互作用关系。见图4。

2.2.2 网络基因GO、KEGG富集分析

将上述药物网络中的基因导入Metascape数据库，按照P<0.01筛选进行GO分析，基因按照功能分为3类：biological process （BP），molecular function （MF）和cellular component （CC）。通过KEGG通路密集分析，并用R语言绘制气泡图。

BP共有1 279个条目，主要涉及激素反应、药物代谢、对有机环状化合物的反应、细胞对有机物的反应、对脂质的反应及蛋白质磷酸化的正调控等。CC共有97个条目，主要涉及质膜完整成分、质膜固有成分、神经元投射质膜、膜结合细胞投射、质膜和质膜结合细胞投等。MF共有123个条目，主要涉及各种酶的活性（如蛋白激酶活性、激酶活性和磷酸转移酶活性）等。KEGG共富集到116条通路，主要涉及癌症通路、多巴胺能突触、脂质与动脉粥样硬化和乳腺癌等。见图5。

2.2.3 药物网络基因的PPI网络分析

根据上述药物网络中的基因，用STRING在线工具进行PPI网络分析（combined score>0.7）。然后根据各基因的连接度（与该基因直接相连的基因数），挑选出hub基因。以节点degree为评价参数，节点越高表明该基因在网络中越重要。网络中包含65个功能蛋白，134种相互作用关系，平均degree为4，degree排名前5的核心靶点为SRC、CTNNB1、TNF、PPARG和FOS。见图6。

3 讨论

沉香焚香的使用历史悠久，随着近年来研究的不断深入，沉香的使用范围越来越广。在李时珍的《本草纲目》中系统总结了沉香的品种、主治和附方，同时拓宽了沉香的应用范围“治上热下寒，气逆喘急，大肠虚闭，小便气淋，男子精冷”。现代药理研究结果表明，沉香的香味和药理活性组分主要来源于挥发油，其中倍半萜化合物、2-（2-苯乙基）色酮类化合物和芳香族化合物是组成沉香挥发油的主要成分^［14-16］。2-（2-苯乙基）色酮类衍生物迄今仅从沉香等少量植物中分离得到，其中高度氧化的5，6，7，8-四氢-2-（2-苯乙基）色酮目前仅在沉香中检测到，因此可作为沉香质量鉴别的重要化合物。研究结果表明，沉香在神经系统、消化系统、呼吸系统、心脑血管系统等疾病的治疗中均有显著疗效，此外在抗肿瘤、抗风湿病等方面也有较好的疗效。

本研究结果表明zoomaric acid，6，7-dimethoxy-2-（27-phenylethyl）chromone，acetic acid可能是沉香治疗睡眠障碍及焦虑的关键成分，从KEGG富集到的116条通路中发现与睡眠障碍及焦虑相关的通路为多巴胺能神经通路。有研究观察沉香提取物对失眠大鼠脑组织神经递质的影响，发现沉香挥发油和沉香醇提取物可提高失眠大鼠脑组织中5-HT、GABA的含量，促进GABA的合成和释放，提高GABA受体表达水平，降低DA、NE、Glu含量，改善睡眠^［17］。2-（2-苯乙基）色酮类成分也是沉香的主要活性成分，6，7-dimethoxy-2-（27-phenylethyl）chromone是其中的一种类型。研究结果显示，2-（2-苯乙基）色酮类化合物具有很高的生物药理活性，具有不同程度的抗过敏和神经保护方面的作用^［18］。实验研究结果表明，用沉香香粉熏香可显著抗焦虑/抑郁，其作用机制可能与调控Glu、GABA、5-HT分泌及其受体和转运蛋白的表达有关^［19］。王帅等^［20］研究发现，采用通体结香技术生产的沉香，其醇提取物和挥发油能显著提高小鼠的入睡率，并延长小鼠睡眠时间。zoomaric acid和acetic acid是沉香挥发油中脂肪酸类化合物的成分，所占比例较小，是引起精油腐败的物质^［21］，因此常被当做是挥发油中的“杂质”成分。本文根据药物成分靶点预测得出上述成分可能与治疗睡眠障碍及焦虑有关，推测脂肪酸类物质可能参与沉香干预睡眠障碍及焦虑的神经通路，后续还需进一步进行实验验证。

参考文献

[1] TAN C S， ISA N M， ISMAIL I， et al. Agarwood induction： Current developments and future perspectives‍［J］. Front Plant Sci， 2019， 10： 122.

[2] LIU Y Y， CHEN H Q， YANG Y， et al. Whole-tree agarwood-inducing technique： An efficient novel technique for producing high-quality agarwood in cultivated Aquilariasinensis trees‍［J］. Molecules， 2013， 18（3）： 3086-3106.

[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2020年版：一部 ［S］.北京：中国医药科技出版社，2020： 192.

[4] 李正文.半夏沉香旋覆代赭汤治疗咽异感症2600例疗效观察［J］.西北药学杂志，2010，25（6）：453-454.

[5] 王灿红，陈细钦，弓宝，等.沉香薰香吸入给药镇静促睡眠作用及机制研究‍［J］.中国药学杂志，2022，57（19）：1628-1635.

[6] JAHRAMIJ H， BAHAMMAM A S， BRAGAZZI N L， et al.Sleep problems during the COVID-19 pandemic by population： A systematic review and Meta-analysis‍［J］. J Clin Sleep Med， 2021，17（2）：299-313.

[7] ALIMORADI Z， BROSTROM A， TSANG H W H， et al.Sleep problems during COVID-19 pandemic and its’association to psychological distress： A systematic review and meta-analysis‍［J］. E Clinical Medicine， 2021，36：100916.

[8] HAO Q， WANG D， XIE M， et al.Prevalence and risk factors of mental health problems among healthcare workers during the COVID-19 pandemic： A systematic review and Meta-analysis‍［J］. Front Psychiatr， 2021，12：567381.

[9] PAPPA S， NTELLA V， GIANNAKAS T， et al. Prevalence of depression， anxiety， and insomnia among healthcare workers during the COVID-19 pandemic： A systematic review and Meta-analysis‍［J］. Brain Behav Immun， 2020，88：901-907.

[10] ZHANG C， YANG L， LIU S， et al. Survey of insomnia and related social psychological factors among medical staff involved in the 2019 novel coronavirus disease outbreak［J］.Front Psychiatry， 2020，11：306.

[11] BECK F， LEGER D， FRESSARD L， et al. Covid-19 health crisis and lockdown associated with high level of sleep complaints and hypnotic uptake at the population level［J］. J Sleep Res， 2021，30（1）：e13119.

[12] SADDICHHA S.Diagnosis and treatment of chronic insomnia‍［J］. Ann Indian Acad Neurol‍， 2010，13（2）：94-102.

[13] SRIVASTAVA J K， SHANKAR E， GUPTA S. Chamomile： A herbal medicine of the past with bright future［J］. Mol Med Rep， 2010，3（6）：895-901.

[14] 王灿红，王帅，彭德乾，等.沉香挥发油成分-靶点预测研究［J］.中国药学杂志，2019，54（23）：1958-1964.

[15] 杨德兰，梅文莉，杨锦玲，等.GC-MS分析４种奇楠沉香中致香的倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类成分‍［J］．热带作物学报，2014，35（6）：1235-1243.

[16] 马永青，袁丽华，刘永利 ．沉香化学成分与分析方法研宄进展［J］．沈阳药科大学学报，2017，34（2）：181-192.

[17] 王浩楠. 沉香挥发油对氧化损伤经元GABA及GABA_A受体基因表达的影响‍［D］.广州：广州中医药大学，2020.

[18] 张林杰，吴泽青，林励，等 ．生物诱导法所产生沉香不同部位中3种色酮的含量测定‍［J］.广东药学院学报，2016，32（1）：41-45.

[19] 王灿红，弓宝，吴玉兰，等.沉香香粉熏香调节多神经递质途径的抗焦虑/抑郁作用研究‍［J］.中国医院药学杂志，2023，43（6）：657-662，710.

[20] 王帅，周岳，马富超，等. 通体沉香对小鼠催眠和自主活动抑制作用‍［J］. 国际药学研究杂志，2016，43（6）：1082-1087.

[21] 弓宝，杨云，黄立标.沉香精油化学成分和药理学研究关系的探讨［J］.香料香精化妆品，2012，（5）：45-48. （修订日期：2023-11-15）

基金资助

海南省重点研发计划项目(ZDYF2020162)

国家中医药管理局高水平中医药重点学科中医老年病学建设项目(琼卫中医函［2023］3号)