黄芪甲苷对脑缺血-再灌注损伤大鼠神经的影响及作用机制

Effect and mechanism of astragaloside Ⅳ on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

摘要

目的 探讨黄芪甲苷（astragaloloside Ⅳ，AS-Ⅳ）对脑缺血-再灌注（cerebral ischemia-reperfusion injury，CI-RI）大鼠脑损伤的影响及可能的作用机制。 方法 选取65只大鼠采用大脑中动脉阻塞线栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立CI-RI模型，将造模成功大鼠随机分为模型组、AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组，另设对照组，各12只。AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组分别灌胃20、40、80 mg·kg^-1 AS-Ⅳ混悬液（蒸馏水配制），对照组及模型组给予等量蒸馏水。评价大鼠神经功能缺损情况；用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）和超氧化物岐化酶（superoxide dismutase， SOD）水平；HE染色观察各组大鼠脑组织病理变化；用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和蛋白印迹法（Western blotting）分别检测大鼠脑组织中过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator receptor γ coactivator，PGC-1α）、核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2） mRNA和蛋白的表达情况。 结果 与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠各时间神经功能学Garcia JH评分、GSH-Px、SOD、PGC-1α、Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均升高，TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平均降低（P<0.05）。与AS-Ⅳ低剂量组比较，AS-Ⅳ中剂量、AS-Ⅳ高剂量组诸项指数水平的改变更明显，且AS-Ⅳ高剂量组的变化更显著（P<0.05）。 结论 AS-Ⅳ能够改善MCAO大鼠神经功能损伤，降低氧化应激水平，改善神经炎症，可能是通过激活PGC-1α/Nrf2信号通路发挥作用的。

Abstract

Objective To investigate the effect of astragaloside Ⅳ （AS-Ⅳ） on brain injury in cerebral ischemia-reperfusion （CI-RI） rats and its possible mechanism. Methods 65 rats were selected to establish cerebral ischemia-reperfusion model by middle cerebral artery occlusion thread occlusion （MCAO）. The successful rats were randomly divided into model group， low， medium and high doses of AS-Ⅳ group， and another control group， with 12 rats in each group. The low， medium and high doses of AS-Ⅳ groups were gavaged with 20， 40 and 80 mg·kg^-1 AS-Ⅳ suspension （prepared with distilled water）， respectively， and the control and model group were given the same amount of distilled water. The neurological deficit of rats was evaluated. The levels of serum tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， malondialdehyde （MDA）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and superoxide dismutase （SOD） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The pathological changes of rat hippocampal were observed by HE staining. The mRNA and protein expressions of peroxisome proliferator receptor γ coactivator 1 α （PGC-1α） and nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2） in rats hippocampus were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） and western blotting. Results Compared with the model group， the levels of neurological Garcia JH score at each time， GSH-Px， SOD， PGC-1 and Nrf2 mRNA and protein expression were increased， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and MDA were decreased in low， medium and high doses of AS-Ⅳ groups （P<0.05）. Compared with low dose of AS-Ⅳ group， the index levels medium and high doses of AS-Ⅳ groups changed significantly， especially in high doses of AS-Ⅳ group （P<0.05）. Conclusion AS-Ⅳ can improve the neurological injury， reduce the level of oxidative stress and improve neuroinflammation in MCAO rats， possibly by activating PGC-1α/Nrf2 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

黄芪甲苷 / 脑缺血-再灌注损伤 / 神经保护 / 过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α / 核因子E2相关因子2

Key words

astragaloside Ⅳ / cerebral ischemia-reperfusion injury / neuroprotection / peroxisome proliferator receptor γ coactivator 1 α / nuclear factor E2 related factor 2

脑卒中是常见的急性脑血管疾病之一，其中缺血性脑卒中占脑卒中的75%~80%^［1］。临床治疗采用早期溶栓使缺血区域恢复供血，但当脑组织再灌注时，极易再次造成脑缺血-再灌注（cerebral ischemia-reperfusion injury， CI-RI）损伤，引发神经元损伤凋亡、脑水肿等其他并发症，从而加重病情^［2］。黄芪的主要成分包括黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）、黄芪苷、异黄芪苷、三萜皂苷、黄酮及多糖等^［3］。现代药理学研究发现，AS-Ⅳ作为其主要活性成分，具有改善心肌功能、抗氧化、抗病毒、调节免疫功能等作用^［4］。本研究建立大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）大鼠模型，探讨AS-Ⅳ对CI-RI大鼠神经的保护作用及可能的作用机制，为AS-Ⅳ的应用及脑卒中临床治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

动物呼吸机（HX-300型，成都泰盟科技有限公司）；石蜡组织切片机（RM2265，德国Leica公司）。

1.2 试药

黄芪甲苷（国药准字：H20058138，悦康药业股份有限公司）；肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自深圳科润达生物工程有限公司；丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）和超氧化物岐化酶（superoxide dismutase， SOD）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠β-actin多克隆抗体、兔抗大鼠过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator receptor γ coactivator， PGC-1α）、核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2， Nrf2）多克隆抗体和山羊抗兔二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）均购自京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 动物

80只SPF级雄性SD大鼠，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为SCXK（浙）2019-0001，体质量为220~250 g。于温度（22±2） ℃，相对湿度（50%±10%）、自然昼夜节律光照、通风良好、干净舒适的环境中适应性饲养7 d，可自由获取食物和水，每日更换垫料。

2 方法

2.1 MCAO大鼠模型的建立

随机选取65只大鼠以改良Longa线栓法建立MCAO模型。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，于右侧颈部做纵向切口，钝性分离组织，暴露颈总动脉后继续向下分离找到颈外及颈内动脉，结扎颈外动脉远心端，用动脉夹夹闭颈内动脉，于颈外动脉做切口，将无菌尼龙线插入，至线栓到达分叉处取下动脉夹，2 h后缓慢拔出线栓，缝合消毒，待大鼠苏醒。术后大鼠应用Zea-Longa 5级评分法对神经功能学缺损程度进行评分，0~3分判定为建模成功^［5］。术中将死亡大鼠剔除，选取相似体型大鼠继续建模。

2.2 分组与给药

将48只造模成功的大鼠随机分为模型组、AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组，各12只；另设对照组12只。参照文献^［6-7］，AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组分别灌胃20、40、80 mg·kg^-1 AS-Ⅳ混悬液（用蒸馏水配制），对照组及模型组于相同时间给予等量蒸馏水。每日给药1次，连续给药7 d。

2.3 标本采集

末次给药24 h后，所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，翻正反射消失后，打开腹腔。腹主动脉采集血液，于4 ℃下以3 000 r·min^-1离心15 min，分离血清，-20 ℃保存。断头法处死大鼠，冰上完整取出大鼠脑组织，用预冷的生理盐水冲洗脑组织表面血液，取部分脑组织浸入多聚甲醛液中固定24 h备用，其余组织于-80 ℃保存备用。

2.4 神经功能评分

造模7 d后，用更加详细的Garcia JH神经功能评分法从自主运动、前肢伸展运动、四肢活动对称性、身体本体感觉、触须反射和攀爬等方面评定大鼠神经功能损伤程度，得分范围为3~18分，各部分得分相加为最终得分。

2.5 炎症因子水平的检测

血清和试剂盒室温静置20 min后，用双抗体夹心法检测血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。配制所需洗涤剂、梯度质量浓度的标准品，将96微孔设置为标准孔、检测孔和对照孔。相应加入梯度浓度标准品稀释液、待测血清样品和稀释液50 μL，37 ℃温育60 min，洗涤液清洗拍干，加入酶工作液，37 ℃温育90 min，洗涤液清洗拍干，加入显色液和终止液，用酶标测定仪在450 nm波长处检测各孔吸光度（A）值，绘制标准曲线，计算样品质量浓度。

2.6 氧化应激因子水平的检测

用微量法按照MDA、GSH-Px和SOD试剂盒说明书操作，主要步骤为：每个样品设置3个平行孔，于待测样品孔中加入血清100 μL，各标准品孔加入标准液，再设置2个阴性对照孔仅加入稀释液。将酶标板置于4 ℃包被孵育，吸干反应液，洗涤液浸泡2 min，弃去拍干，重复3次。标准孔和样品孔再加入抗体工作液，37 ℃培养箱静置60 min，洗板。每孔加入TMB显色液，轻轻混匀10 s，37 ℃避光反应20 min，加入终止液。用酶标测定仪于450、630 nm波长处检测A值，计算样品质量浓度。

2.7 脑组织HE染色观察

取出置于多聚甲醛中固定24 h后的脑组织，做冠状切块，将含有脑皮质梗死区的脑组织块浸泡于梯度乙醇脱水，再浸泡于二甲苯中透明，用石蜡包埋，将组织蜡块切成厚度为5 μm的切片。置于60 ℃烘箱4 h烘干，取出切片后浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各15 min，再浸入无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中各15 min，梯度乙醇脱水，取出切片架浸入苏木素5 min，用蒸馏水浸泡2 min，用盐酸乙醇分化3 s，用伊红染色3 min，常规脱水透明，滴加中性树胶，盖上载玻片，封片，晾干。观察脑组织病理学变化。

2.8 反转录∙聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测mRNA的表达水平

取脑组织置于TRIzol Reagent 1 mL中进行匀浆，依次加入氯仿、异丙醇，在4 ℃下以12 000 r·min^-1离心15 min，取沉淀物。逆转录得到cDNA，配制PCR反应混合液20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH₂O 6 μL、模板cDNA 2 μL。各引物及其序列：PGC-1α-F：5’-AAGTGGTGTAGCGACCAATCG-3’、PGC-1α-R：5’-AATGAGGGCAATCCGTCTTCA-3’；Nrf2-F：5’-CTTTAGTCAGCGACAGAAGGAC-3’、Nrf2-R：5’-AGGCATCTTGTTTGGGAATGTG-3’；β-actin-F：5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’、β-actin-R：5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。按照95 ℃预变性60 s，95 ℃变性20 s，60 ℃退火60 s的程序，进行40个循环，用2^-△△CT计算PGC-1α和Nrf2的相对表达量。

2.9 蛋白印迹法（Western blotting）检测蛋白的表达水平

取出备用的脑组织，将配制好的裂解液完全浸没裂解样本，在4 ℃下以12 000 r·min^-1离心10 min，提取上清液，加入PBS缓冲液混匀，加入BCA工作液，读取并记录相应数据，计算蛋白质量浓度。配制浓缩胶与分离胶，注入电泳液后，加入上样液20 μL和Marker 5 μL，恒压80 V电泳2 h，转至PVDF膜，加入脱脂奶粉封闭1 h。再加入1∶1 000稀释PGC-1α、Nrf2抗体工作液，4 ℃摇床过夜，TBST洗膜5 min，重复4次，加入1∶5 000稀释标记二抗，37 ℃摇床孵育45 min，TBST洗膜5 min，重复4次，暗室内滴加ECL发光液曝光。用Image J软件分析条带灰度值，记录目的蛋白PGC-1α和Nrf2的表达量。

2.10 统计学方法

用SPSS23.0统计学软件分析数据。计量数据以（\overline{x}\pm s）表示，用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多组间比较，用LSD-t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 神经功能评分的比较

对照组、模型组、AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组大鼠神经功能Garcia JH评分分别为（17.75±0.64）、（7.41±0.52）、（12.04±1.09）、（13.76±1.15）、（15.12±1.19） 分，评分组间比较差异有统计学意义（F=193.970，P<0.05）。与对照组比较，模型组Garcia JH评分降低（t=43.437，P<0.05）。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量3组Garcia JH评分均升高（t=13.281、17.429、20.566，P<0.05）。与AS-Ⅳ低剂量组比较，AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组Garcia JH评分均升高（t=3.760、6.612，P<0.05），且AS-Ⅳ高剂量组最高。

3.2 炎性因子水平比较

与对照组比较，模型组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6水平均升高（P<0.05）。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量3组TNF-α、IL-1β和IL-6水平均降低（P<0.05）。与AS-Ⅳ低剂量组比较，AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组3项水平均降低（P<0.05），AS-Ⅳ高剂量组降低最多（P<0.05）。见表1。

3.3 氧化应激因子水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠血清MDA水平升高，GSH-Px和SOD水平降低（P<0.05）。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量3组血清MDA水平降低，GSH-Px和SOD水平升高（P<0.05）。与AS-Ⅳ低剂量组比较，AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组变化显著（P<0.05），且AS-Ⅳ高剂量组变化最显著（P<0.05）。见表2。

3.4 脑组织HE染色结果的比较

对照组大鼠脑组织结构完整，神经细胞排列规则紧密，神经元数量较多，细胞核形态正常，未见细胞肿胀现象，染色均匀。模型组大鼠脑组织水肿，神经细胞排列松散紊乱，神经元数量减少，细胞核固缩，可见大量炎性细胞浸润。与对照组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量3组大鼠脑组织结构层次逐渐清晰，神经元整体结构完整，核仁清晰，细胞数量逐渐增多，排列紧密有序，未见特殊病变，染色均匀。见图1。

3.5 PGC-1α和Nrf2 mRNA水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠脑组织PGC-1α和Nrf2 mRNA表达水平均下降（P<0.05）。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量3组大鼠脑组织PGC-1α和Nrf2 mRNA表达水平均升高（P<0.05），其中AS-Ⅳ高剂量组的变化最显著，AS-Ⅳ中剂量组次之，AS-Ⅳ低剂量组的变化最小（P<0.05）。见表3。

3.6 PGC-1α和Nrf2蛋白水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠脑组织PGC-1α和Nrf2蛋白表达水平均下降（P<0.05）。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量3组大鼠脑组织PGC-1α和Nrf2蛋白表达水平均升高（P<0.05）。其中AS-Ⅳ高剂量组的变化最显著，AS-Ⅳ中剂量组次之，AS-Ⅳ低剂量组的变化最小（P<0.05）。见表4和图2。

4 讨论

缺血性脑血管疾病是由脑部血流受阻或血管病变后，导致脑组织缺血、缺氧，造成部分脑组织坏死及神经功能损伤^［8］。在治疗中，缺血区域恢复灌注，导致部分患者未能恢复神经功能，反而加重脑结构的破坏，影响神经功能恢复^［9］。在CI-RI损伤中，大量炎性细胞浸润神经细胞，引起神经炎症，导致细胞形态异常，丧失正常功能^［10］。除免疫炎症外，氧化应激在中枢神经系统疾病中也发挥着重要作用^［11］。氧化应激在多个环节中参与神经递质的释放与反馈调节，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加可破坏血脑屏障^［12］。此外，ROS是一种信号分子，可以调控免疫炎症相关介质的表达，进而引起炎性因子大量释放^［13］。因此神经功能损伤是多因素共同作用的结果，但氧化应激与炎症反应在其中发挥着重要作用^［14］。

多项研究结果表明，AS-Ⅳ在治疗缺血再灌注方面具有良好效果^［15］。李媛等^［16］研究发现，神经损伤大鼠通过AS-Ⅳ治疗后，脑梗死体积减少，细胞形态得到改善。另有研究结果表明，AS-Ⅳ可降低大鼠神经细胞凋亡率，改善线粒体形态，表明AS-Ⅳ对脑损伤大鼠具有神经保护作用^［17］。本研究通过建立MCAO大鼠模型，从分子机制上探讨AS-Ⅳ对神经损伤大鼠的神经保护作用并探究其可能的作用机制。结果显示，模型组大鼠神经功能Garcia JH评分、GSH-Px和SOD水平均降低，TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平均升高，表明模型组大鼠神经功能受到损伤，模型建立成功，且体内伴有大量氧化应激反应和炎症反应。在给予AS-Ⅳ干预后均表现神经功能学Garcia JH评分、GSH-Px和SOD水平升高，TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平降低。可见经AS-Ⅳ处理后，MCAO大鼠神经功能得到改善，体内氧化应激反应和炎症反应得到改善，脑组织水肿减轻。观察大鼠脑组织切片时也发现，AS-Ⅳ在一定程度上能改善神经功能损伤，大鼠脑组织神经细胞数量增多，且细胞水肿现象得到改善。

PGC-1α是核基因受体的转录共激活因子，被认为是中枢神经系统疾病的重要调节剂，负责调节神经细胞许多病理过程，例如神经炎症反应中的细胞凋亡、基因转录和能量代谢等^［18］。PGC-1α作为分子开关，可调控下游靶基因表达启动抗氧化系统减少脑组织损伤，Nrf2作为下游活力最强的转录调节因子，正常生理条件下与Keap1偶联在胞质内，并与肌动蛋白相结合，受到氧化应激产物与炎症介质刺激时，Nrf2会迅速解偶联并进入细胞核，启动抗氧化应激蛋白的转录与表达，深入参与氧化磷酸化过程^［19］。在本研究中，与模型组比较，AS-Ⅳ各剂量组大鼠脑组织中PGC-1α和Nrf2 mRNA的蛋白表达水平均升高。表明AS-Ⅳ可以通过提高NF-κB表达，从而促进Nrf2激活，AS-Ⅳ的神经保护作用与抗氧化、抗炎作用息息相关。有研究表明，AS-Ⅳ可显著抑制脑组织内炎性因子表达，在抑制神经炎症方面有着良好效果^［20］，本研究结果与其一致，均表明AS-Ⅳ具有明显抗炎作用。

综上所述，AS-Ⅳ能够改善MCAO大鼠神经功能损伤，减少氧化应激因子的表达，改善神经炎症，可能是通过激活PGC-1α/Nrf2信号通路发挥作用的，可为临床治疗CI-RI损伤提供实验依据。

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基金资助

河北省2021年度医学科学研究课题计划项目(20211810)