白藜芦醇诱导NOD样受体蛋白结构域相关蛋白3炎性体轴致胰腺腺泡细胞凋亡的机制

Study on the mechanism of resveratrol on pancreatic acinus apoptosis in rats with severe acute pancreatitis based on NOD like receptor pyrin domain containing 3 inflammatory body axis

摘要

目的 探讨白藜芦醇对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响及对NOD样受体蛋白结构域相关蛋白3（NOD like receptor pyrin domain containing 3， NLRP3）炎性体轴的调节作用。 方法 将50只大鼠随机分为假手术组、模型组和白藜芦醇低、高剂量组及地塞米松组，每组10只，除假手术组大鼠外，其余组大鼠通过牛黄胆酸钠逆行胰胆管注射制备SAP模型。手术结束5 min后，白藜芦醇低、高剂量组分别腹腔注射白藜芦醇30、60 mg·kg^-1，地塞米松组大鼠腹腔注射地塞米松2 mg·kg^-1，每日1次，连续给药3 d，假手术组和模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水。检测大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶活性，白细胞介素（IL）-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）含量，检测胰腺组织病理损伤并进行病理评分，胰腺腺泡细胞凋亡指数以及NLRP3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）的蛋白相对表达量。 结果 假手术组大鼠胰腺组织结构正常，无水肿、充血或坏死；模型组胰腺间质水肿，肺泡间隔变宽，可见大量炎性细胞浸润，实质出现点状或片状出血或坏死；白藜芦醇低、高剂量组和地塞米松组胰腺组织病变程度均减轻。与假手术组比较，模型组淀粉酶和脂肪酶活性，IL-1β、IL-18和TNF-α含量，组织病理评分，细胞凋亡指数及NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量均升高，Bcl-2蛋白相对表达量降低（P<0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低、高剂量组和地塞米松组淀粉酶和脂肪酶活性，IL-1β、IL-18和TNF-α含量，组织病理评分，细胞凋亡指数及NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量均降低，Bcl-2蛋白相对表达量升高（P<0.05）；与白藜芦醇低剂量组比较，高剂量组和地塞米松组淀粉酶和脂肪酶活性，IL-1β、IL-18和TNF-α含量，组织病理评分，细胞凋亡指数及NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量均降低，Bcl-2蛋白相对表达量升高（P<0.05）；与白藜芦醇高剂量组比较，地塞米松组淀粉酶和脂肪酶活性，IL-1β、IL-18和TNF-α含量，组织病理评分，细胞凋亡指数及NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量均降低，Bcl-2蛋白相对表达量升高（P<0.05）。 结论 白藜芦醇可减轻SAP大鼠胰腺损伤，抑制胰腺腺泡细胞凋亡，其可能是通过阻碍NLRP3炎性体轴激活发挥作用的。

Abstract

Objective To investigate the effect of resveratrol on apoptosis of pancreatic acinar cells in rats with severe acute pancreatitis （SAP） and modulating the inflammatory body axis of NOD like receptor pyrin domain containing 3 （NLRP3）. Methods 50 rats were randomly divided into sham operation group， model group， low-dose resveratrol group， high-dose resveratrol group and dexamethasone group， with 10 rats in each group. Except for the sham operation group， the SAP model was prepared by retrograde injection of sodium bezoar cholate in other groups. 5 minutes after the operation， the low-dose and high-dose resveratrol groups were intraperitoneally injected with 30 and 60 mg·kg^-1 resveratrol， the dexamethasone group was intraperitoneally injected with 2 mg·kg^-1 dexamethasone， once a day for consecutive 3 days， and the sham operation group and model group were intraperitoneally injected with the same amount of normal saline. The contents of amylase， lipase， interleukin（IL）-1β， IL-18 and tumor necrosis factor α （TNF-α） in serum of rats were detected， The pathological damage of pancreatic tissue was detected and recorded in histopathological score， and the apoptosis index of pancreatic acinar cells was detected. The protein relative expression levels of NLRP3， aspartic acid specific cysteine protease 1 （caspase-1）， B-cell lymphoma -2 （Bcl-2） and Bcl-2 associated X protein（Bax） were also detected. Results In sham operation group， the pancreas tissue structure was normal without edema， hyperemia or necrosis. In model group， pancreatic interstitial edema was observed， alveolar septum widened， a large number of inflammatory cell infiltration， and punctate or lamellar hemorrhage or necrosis occurred in the parenchyma. The degree of pancreatic tissue lesion was reduced in the low-dose， high-dose resveratrol groups and dexamethasone group. Compared with sham operation group， the contents of amylase and lipase， IL-1β， IL-18 and TNF-α， histopathological score， apoptosis index and the relative expression levels of NLRP3， caspase-1 and Bax proteins in model group were increased， while the relative expression level of Bcl-2 protein was decreased （P<0.05）. Compared with model group， the contents of amylase and lipase， IL-1β， IL-18 and TNF-α， histopathological score， apoptosis index and the relative expression levels of NLRP3， caspase-1 and Bax proteins in resveratrol low-dose， high-dose groups and dexamethasone group were decreased， while the relative expression level of Bcl-2 protein was increased （P<0.05）. Compared with the low-dose resveratrol group， the contents of amylase and lipase， the contents of IL-1β， IL-18 and TNF-α， histopathological score， apoptosis index and the relative expression levels of NLRP3， caspase-1 and Bax proteins in the high-dose resveratrol group and dexamethasone group were decreased， while the relative expression level of Bcl-2 protein was increased （P<0.05）. Compared with resveratrol high-dose group， the contents of amylase and lipase， IL-1β， IL-18 and TNF-α， histopathological score， apoptosis index and the relative expression levels of NLRP3， caspase-1 and Bax proteins in dexamethasone group were decreased， while the relative expression level of Bcl-2 protein was increased （P<0.05）. Conclusion Resveratrol can reduce pancreatic injury and inhibit pancreatic acinocyte apoptosis in SAP rats， possibly by blocking the activation of NLRP3 inflammatory body axis.

Graphical abstract

关键词

白藜芦醇 / 重症急性胰腺炎 / 凋亡 / NOD样受体蛋白结构域相关蛋白3

Key words

resveratrol / severe acute pancreatitis / apoptosis / NOD like receptor pyrin domain containing 3

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种常见的急腹症，发病急、死亡率高且并发症多^［1］。胰腺腺泡细胞凋亡在SAP中普遍存在，而细胞凋亡引起多种炎症因子释放，导致全身炎症反应^［2］。白藜芦醇是从植物中提取的一种多酚类抗毒素，具有抗炎、抗氧化及调节免疫平衡等多种生物活性，对SAP具有一定的治疗效果，可有效修复胰腺血管损伤^［3］。NOD样受体蛋白结构域相关蛋白3（NOD like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症小体是一种细胞内蛋白复合体，通过调节机体免疫反应，维持细胞自身稳态，NLRP3在SAP胰腺组织中呈高表达^［4］。因此，本研究建立SAP大鼠模型，探讨白藜芦醇对SAP大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响及对NLRP3炎性体轴的调节作用。

1 仪器和材料

1.1 仪器

蛋白凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；倒置显微镜（日本Olypus公司）。

1.2 试药

白藜芦醇（质量分数>98%）和牛黄胆酸钠均购自美国Sigma公司；地塞米松注射液（广西万德药业股份有限公司）；HE试剂盒和TUNEL染色试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；淀粉酶和脂肪酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自美国R&D公司；兔抗鼠GAPDH、NLRP3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associad X，Bax）和B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.3 动物

健康清洁级雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量为200~220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2017-0011。大鼠在自然光照下饲养，室温维持在（24±1） ℃，室内相对湿度为50%，大鼠自由饮食、饮水。

2 方法

2.1 模型的制备

将50只大鼠随机分为假手术组、模型组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组，每组10只。除假手术组大鼠外，其余组大鼠建立SAP模型，具体操作如下：大鼠麻醉后，打开腹腔，找到胆总管与胰管汇入十二指肠的位置，自十二指肠乳头向胆总管近端方向进针，直至进入胆总管，用自动微量泵按照1 mL·kg^-1的剂量推注牛黄胆酸钠，肉眼可见牛黄胆酸钠溶液充盈胰腺组织为造模成功，逐层依次缝合关腹。假手术组大鼠仅打开腹腔，翻动肠壁，不推注牛黄胆酸钠^［5］。模型制备完成5 min后，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组大鼠分别腹腔注射白藜芦醇30、60 mg·kg^-1，地塞米松组大鼠腹腔注射地塞米松2 mg·kg^-1，假手术组和模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水；各组均为每日1次，连续处理3 d。

2.2 血清淀粉酶和脂肪酶含量的检测

末次给药结束2 h后，用颈椎脱臼法处死所有大鼠，打开腹腔，腹主动脉采血，室温静置30 min，以3 000 r·min^-1离心10 min（离心半径为8 cm），吸取上清液，一部分用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶和脂肪酶的含量，另一部分存于-20 ℃用于炎症因的子检测。

2.3 ELISA检测血清IL-1β、IL-18和TNF-α的含量

取出上述存于-20 ℃的血清，作为待测样品，酶标包被后的96孔板分别设置空白孔、标准孔和待测样品孔。根据说明书将稀释液进行梯度稀释，待测样品孔中加入稀释后的稀释液40 μL，再加入待测样品10 μL，充分混匀后，封板，37 ℃孵育30 min，洗涤液洗涤5次，拍干板子。除空白孔外，其余孔加入酶标试剂50 μL，封板后37 ℃孵育30 min，洗涤5次，拍干，加入显色剂A液和B液，各50 μL，37 ℃避光显色15 min，加入终止液50 μL，37 ℃避光显色15 min。在450 nm波长处测定吸光度（A）值，根据标准品A值绘制标准曲线，根据标准曲线，计算IL-1β、IL-18和TNF-α的质量浓度。

2.4 HE染色观察胰腺组织的病理损伤情况

采血完成后，剥离胰腺组织，取部分胰腺组织置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋、切片和烘片后，进行HE染色。中性树胶封片后，置于显微镜下观察并拍照，从组织水肿、炎症、出血和坏死4个方面进行病理学评分。评分标准^［6］：无炎性细胞、出血、水肿、坏死记为0分；坏死面积达到1%~10%，出血、水肿达到0~25%记为1分；坏死面积达到>10%~20%，出血、水肿达到>25%~50%记为2分；坏死面积达到>20%~30%，出血、水肿达到>50%~75%记为3分；坏死面积>30%，出血、水肿>75%记为4分。病理评分=坏死分数+出血分数+水肿分数+炎症分数。

2.5 TUNEL染色检测胰腺腺泡细胞凋亡指数

取石蜡切片，60 ℃烘片2 h，经二甲苯和梯度乙醇处理后，滴加20 μg·mL^-1蛋白酶K，室温孵育30 min，PBS清洗，滴加内源性过氧化物酶封闭液孵育20 min，用PBS清洗，滴加TUNEL工作液50 μL，37 ℃避光孵育1 h，用PBS清洗，滴加反应终止液0.3 mL，孵育10 min。滴加链霉素-辣根过氧化物酶工作液50 μL，孵育30 min。用PBS清洗，滴加DAB显色液500 μL，避光孵育30 min。用PBS清洗，滴加苏木素染液染色2 min，用PBS清洗，脱水透明，中心树胶封片，在显微镜下观察，拍照。Image Proplus 6.0分析细胞凋亡指数，胞核成棕褐色为凋亡细胞。细胞凋亡指数（%）=（凋亡细胞数量/总细胞数量）×100%。

2.6 检测胰腺组织中各蛋白的相对表达量

取100 mg胰腺组织，置于液氮中研磨，加入裂解液裂解，在4 ℃下以12 000 r·min^-1离心10 min（离心半径为10 cm），吸取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白质量浓度，加入5倍量上样缓冲液煮沸。每孔加样20 μL，80 V电泳20 min，120 V电泳1.5 h，0.3 A湿转2 h，TBST洗膜，室温封闭1 h，GAPDH、NLRP3、caspase-1、Bax和Bcl-2一抗（1：1 000）在4 ℃孵育过夜，TBST洗膜。二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL液显色，Image J分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2.7 统计学方法

用SPSS 22.0软件处理数据。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血清淀粉酶和脂肪酶检测结果

淀粉酶和脂肪酶活性组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组淀粉酶和脂肪酶活性升高（P<0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低、高剂量组和地塞米松组的淀粉酶和脂肪酶活性降低（P<0.05）；与白藜芦醇低剂量组比较，白藜芦醇高剂量组和地塞米松组的淀粉酶和脂肪酶活性降低（P<0.05）；与白藜芦醇高剂量组比较，地塞米松组的淀粉酶和脂肪酶活性降低（P<0.05）。见表1。

3.2 血清中IL-1β、IL-18和TNF-α的含量

IL-1β、IL-18和TNF-α含量组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组IL-1β、IL-18和TNF-α的含量升高（P<0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组的IL-1β、IL-18和TNF-α的含量降低（P<0.05）；与白藜芦醇低剂量组比较，白藜芦醇高剂量组和地塞米松组的IL-1β、IL-18和TNF-α含量降低（P<0.05）；与白藜芦醇高剂量组比较，地塞米松组的IL-1β、IL-18和TNF-α含量降低（P<0.05）。见表2。

3.3 胰腺组织病理损伤检测结果

假手术组大鼠胰腺组织结构正常，无水肿、充血或坏死；模型组大鼠胰腺间质水肿，肺泡间隔变宽，可见大量炎性细胞浸润，实质出现点状或片状出血或坏死；白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组大鼠胰腺组织病变程度均减轻，白藜芦醇高剂量组和地塞米松组损伤程度减轻更明显。见图1。

病理评分组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组的病理评分升高（P<0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组病理评分均降低（P<0.05）；与白藜芦醇低剂量组比较，白藜芦醇高剂量组和地塞米松组的病理评分均降低（P<0.05）；与白藜芦醇高剂量组比较，地塞米松组的病理评分降低（P<0.05）。见表2。

3.4 胰腺腺泡细胞凋亡指数的检测结果

细胞凋亡指数组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组细胞凋亡指数升高（P<0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组细胞凋亡指数降低（P<0.05）；与白藜芦醇低剂量组比较，白藜芦醇高剂量组和地塞米松组细胞凋亡指数降低（P<0.05）；与白藜芦醇高剂量组比较，地塞米松组细胞凋亡指数降低（P<0.05）。见图2、表4。

3.5 蛋白印迹法检测结果

NLRP3、caspase-1、Bax和Bcl-2蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量升高，Bcl-2蛋白的相对表达量降低（P<0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量降低，Bcl-2蛋白的相对表达量升高（P<0.05）；与白藜芦醇低剂量组比较，白藜芦醇高剂量组和地塞米松组NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量降低，Bcl-2蛋白的相对表达量升高（P<0.05）；与白藜芦醇高剂量组比较，地塞米松组NLRP3、caspase-1和Bax蛋白的相对表达量降低，Bcl-2蛋白的相对表达量升高（P<0.05）。见图3、表5。

4 讨论

目前被认可的胰腺炎发病机制为“胰腺胰酶自身消化学说”^［7］，胰腺组织自身消化是一种炎症反应性疾病，主要临床表现为腹部疼痛、腹壁紧张、腹部肿胀及体温升高，常出现胰腺水肿、出血及坏死等改变，甚者导致继发性感染、休克、全身炎症反应及多器官功能衰竭等不良后果^［8］，严重威胁患者的生命健康，因此寻找治疗SAP的药物刻不容缓。白藜芦醇可通过调节小鼠牙周炎模型中的炎症来促进骨形成^［9］。XIAO B等^［10］研究发现，白藜芦醇通过抑制炎症反应预防高尿酸性肾病。WANG N等^［11］研究发现，白藜芦醇可改善急性坏死性胰腺炎胰腺组织损伤。此外，白藜芦醇可通过调节凋亡相关蛋白抑制丙二醛诱导的内皮细胞凋亡，减轻细胞毒性^［12］。因此，本研究探讨白藜芦醇对SAP的影响及对胰腺腺泡细胞凋亡的影响。

牛黄胆酸钠可使胰腺组织出血坏死，从而诱发胰腺炎，因此本研究用牛黄胆酸钠逆行胰胆管注射制备SAP模型。淀粉酶主要来源于胰腺和唾液腺，发生SAP后，胰淀粉酶分泌异常，并释放入血，导致血清中淀粉酶含量急剧升高^［13］。脂肪酶主要来源于胰腺，发生SAP时，胰腺功能紊乱，脂肪酶反流、溢出，进入血液循环，导致血液中脂肪酶的含量升高^［14］，淀粉酶和脂肪酶是诊断SAP的重要指标。研究发现，SAP患者血清淀粉酶和脂肪酶水平升高^［15］。地塞米松是一种免疫抑制剂，临床上常用于自身免疫性疾病及过敏性疾病的治疗，因此本研究用地塞米松作为阳性药。本研究结果显示，模型组大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶活性明显升高，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶活性降低。此外，HE染色结果显示，模型组大鼠胰腺间质水肿，肺泡间隔变宽，可见大量炎性细胞浸润，实质出现点状或片状出血或坏死；白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组病变改善，病理评分结果显示，模型组大鼠的病理评分明显升高，白藜芦醇和地塞米松治疗后病理评分降低。表明白藜芦醇可减轻胰腺炎，改善胰腺组织病理损伤。

发生SAP时，胰腺腺泡细胞损伤坏死，大量炎性因子分泌，而炎性因子进一步加重胰腺损伤，因此炎症级联反应被放大，导致全身炎症反应^［16］。TNF-α是SAP中最早升高的多效细胞因子，可促进白细胞聚集于炎症局部并活化，促进其他炎症因子及黏附分子合成和释放。IL-1β可激活淋巴细胞和单核细胞，诱导IL-6和IL-18生成。此外，IL-1β直接促进胰酶生成、储存和释放，加剧胰腺腺泡细胞病理损伤^［17］。临床研究结果表明，SAP患者炎症因子显著升高^［18］。本研究结果显示，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α水平明显高于假手术组，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α水平明显低于模型组。结果表明白藜芦醇可降低SAP大鼠全身炎症反应。

NLRP3炎症小体在炎症反应及细胞凋亡中发挥重要调控作用，在某些因子（病原微生物、病原体及其产物等）刺激下激活下游炎症信号通路，触发炎症级联反应，NLRP3活化后通过自身切割产生具有活性的caspase-1，从而促进IL-1β、IL-18等炎症因子的释放^［19］。研究发现，NLRP3过表达会加重脂多糖诱导的胰腺腺泡细胞损伤^［20］。细胞凋亡受多种因子的严密调控，Bcl-2家族中调节细胞凋亡的关键因子Bcl-2和Bax在细胞凋亡中发挥“分子开关”的作用，Bax接收到凋亡信号后，从细胞质转位至线粒体膜上，导致线粒体膜上分子通道开放，使促凋亡因子大量释放。而Bcl-2则发挥抗凋亡作用，通过稳定线粒体膜电位，降低促凋亡因子释放^［21］。本研究中模型组大鼠胰腺组织中NLRP3、caspase-1和Bax蛋白表达量较假手术组升高，而Bcl-2较假手术组降低，白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和地塞米松组大鼠胰腺组织中NLRP3、caspase-1和Bax蛋白表达量较模型组降低，而Bcl-2较模型组升高。结果表明白藜芦醇可降低SAP大鼠胰腺组织中NLRP3炎症小体表达水平，同时发挥调节凋亡相关蛋白表达的作用。

综上所述，白藜芦醇可减轻SAP大鼠胰腺损伤，抑制胰腺腺泡细胞凋亡，减轻炎症反应，其可能是通过调节NLRP3炎性体轴发挥作用，为临床治疗SAP提供新的思路。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20210977)