黄连素治疗大鼠种植体周围炎的机制

Mechanism of berberine in treating peri-implant inflammation in rats

摘要

目的 探讨黄连素治疗大鼠种植体周围炎的作用以及对Toll样受体4 （Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路的影响。 方法 建立SD大鼠种植体周围炎大鼠模型，随机分为模型组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组，另设阴性对照组。黄连素低、高剂量组予以100、200 mg·kg^-1黄连素，抗生素组予以200 mg·kg^-1阿莫西林胶囊和100 mg·kg^-1甲硝唑片，模型组和阴性对照组予以等体积生理盐水，连续干预4周。观察各组大鼠种植体一般情况，用牙周探针测量大鼠种植体探诊深度（probing depth，PD）和牙龈指数（gingival index，GI）；计算机断层扫描（computed tomography，CT）测量大鼠种植体周围骨高度与骨密度；用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测大鼠种植体周围牙龈组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量；蛋白印迹法（Western blotting）检测大鼠种植体周围牙龈组织中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况。 结果 模型组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组、抗生素组及阴性对照组大鼠PD和GI指数逐渐降低，种植体周围骨高度、骨密度逐渐升高，牙龈组织中TNF-α、IL-1β水平逐渐降低，种植体龈沟液中Ⅱ型胶原（collagen-Ⅱ，COL-Ⅱ）和基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）活性逐渐升高（P<0.05）。模型组、黄连素低剂量组和黄连素高剂量组及阴性对照组，大鼠种植体周围牙龈组织中TLR4、MyD88和p-NF-κB-65蛋白的相对表达量逐渐降低（P<0.05）。 结论 黄连素对大鼠种植体周围炎有一定治疗作用，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of berberine in the treatment of peri-implantitis in rats and its effect on Toll-like receptor 4 （TLR4）/nuclear factor κB （NF-κB） signaling pathway. Methods SD rats were used to build the peri-implantitis model， and randomly divided into model group， low-dose and high-dose berberine groups and antibiotic group， and a negative control group was set up. The low-dose and high-dose berberine groups were given 100 and 200 mg·kg^-1 berberine， the antibiotic group was given 200 mg·kg^-1 Amoxicillin Capsules and 100 mg·kg^-1 Metronidazole Tablets， the model group and the negative control group were given equal volume of normal saline， continuous intervention for 4 weeks. The general conditions of the implants in each group were observed， the probing depth （PD） and gingival index （GI） of the implants were measured with a periodontal probe. The bone height and bone mineral density around the implants were measured by computed tomography（CT）. The contents of tumor necrosis factor-α （TNF- α） and interleukin-6 （IL-6） in peri-implant gingival tissue were detected by enzyme linked immunosorbent assy （ELISA）. The TLR4/NF-κB signaling pathway-related protein expression in peri-implant gingival tissue of rats were detected by Western blotting. Results In the model， low-dose berberine， high-dose berberine， antibiotic and negative control groups， the PD and GI indexes of the rats gradually decreased， the bone height and bone density around the implant gradually increased， and the levels of TNF-α and IL-1β in the gingival tissue gradually decreased， and the activities of collagen-Ⅱ（COL-Ⅱ） and matrix metalloproteinase-13 （MMP-13） in the gingival crevicular fluid of the implant gradually increased （P<0.05）. In the model， the low-dose berberine， high-dose berberine and negative control group， the relative expressions of TLR4， MyD88 and p-NF-κB-65 proteins in the gingival tissue around the implants of the rats gradually decreased （P<0.05）. Conclusion Berberine has a certain therapeutic effect on peri-implantitis in rats， and its mechanism may be related to the inhibition of TLR4/NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

黄连素 / 种植体周围炎 / Toll样受体4/核因子κB信号通路

Key words

berberine / peri-implantitis / Toll-like receptor 4/nuclear factor κB signaling pathway

种植体周围炎为慢性进行性种植体周围组织炎症过程，是种植义齿修复后常见的并发症之一，流行病学研究发现其5年内发生率高达43.9%^［1］。种植体周围炎与慢性成人牙周炎特异性感染相似，在局部、全身因素影响下出现支持骨丧失情况，形成种植体周袋，导致牙槽骨吸收，从而使种植义齿松动、脱落，是导致种植义齿修复后使用寿命缩短及失败的主要原因^［2］。近年来，中草药因毒性低、经济实惠等原因逐渐被用于口腔疾病的防治中，ZHOU R等^［3］研究报道，黄连素在与细菌感染相关的种植体周围炎药物治疗中具有潜在作用。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路是一条经典的炎症通路，孙博宁等^［4］经动物实验研究发现，牙龈炎治疗效果受牙周组织TLR4/NF-κB信号通路调控的影响。本实验探讨黄连素治疗种植体周围炎与TLR4/NF-κB信号通路的关系，以期为研发种植体周围炎高效治疗药物提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Williams牙周探针（上海齿科医械厂）；Somatom Emotion Duo微计算机断层扫描系统（德国西门子股份公司）；165-8001电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

黄连素（质量分数为99%，相对分子质量为336.360 7，分子式为C₂₀H₁₈NO₄，河北嘉隆生物科技有限公司）；阿莫西林胶囊（规格为0.25 g，哈药集团制药总厂）；甲硝唑片（规格为0.2 g，河北爱尔海泰制药有限公司）。

大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）、Ⅱ型胶原（collagen-Ⅱ，COL-Ⅱ）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购自上海广锐生物科技有限公司；兔抗大鼠TLR4、髓样分化蛋白88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）65、p-NF-κB-65和GPADH一抗（Abcam）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 动物

SPF级雄性SD大鼠，50只，7周龄，体质量为260~270 g，购自河北省实验动物中心，生产许可证号为SCXK（冀）2018-004。实验开展前适应性饲养1周，分笼饲养，动物房温度为22~26 ℃，相对湿度为40%~60%，自然光照，自由摄食和饮水，动物处理符合3R原则。

2 方法

2.1 分组、造模和干预

取40只大鼠随机分为模型组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组，将其全身麻醉，在无菌条件下使用显微组织镊拔出大鼠右侧上颌第一磨牙，同期拔出右侧下颌第一磨牙，以免愈合期间出现牙合创伤，再使用定制式驱动器将纯钛螺旋型种植体即刻植入拔牙后留下的远中腭根窝洞内。术后用软质饮食、无菌水喂养4周，使种植体进行骨结合。4周后，用结扎诱导法建立种植体周围炎动物模型^［5］：取5-0丝线环绕种植体牙龈下颈部牢固缠绕2圈，在腭侧打结，结扎期间用200 g·L^-1糖水代替饮用水。剩余10只大鼠设为阴性对照组，即单纯植入种植体，操作同上，但不做结扎处理，正常饮水。建模后灌胃给药：黄连素低、高剂量组分别予以100、200 mg·kg^-1黄连素^［6］，抗生素组予以200 mg·kg^-1阿莫西林胶囊和100 mg·kg^-1甲硝唑片^［7］，模型组和阴性对照组予以等体积生理盐水，每日1次，连续干预4周，观察大鼠的一般情况。造模和给药期间意外死亡的大鼠后期补齐。

2.2 牙周探针测量大鼠种植体炎症指标

用牙周探针以25 N的力轻划种植体修复义齿面，以视诊结合探诊的方式对大鼠种植体近颊侧部位进行测量，记录种植体深度（probing depth，PD），即龈缘到龈沟底的距离。计算牙龈指数（gingival index，GI），按牙龈健康、轻度炎症（牙龈颜色轻度改变、探诊无出血）、中度炎症（牙龈颜色红，伴水肿光亮，探诊出血）和重度炎症（牙龈明显红肿、溃疡，自动出血）进行评分，评分范围为0~3分。结束后采集龈沟液，即用棉花卷隔湿，轻吹大鼠牙龈，用Whatman 3号滤纸条置入取样种植体的颊侧终止周龈袋内，避免被唾液和血液污染，1 min后取出，剪去干燥滤纸条，置于EP管于-70 ℃保存待检。

2.3 CT测量大鼠种植体周围骨高度与骨密度

处死大鼠后取其上颌骨，置于旋转台，用Micro-CT扫描系统X射线进行扫描，曝光300 ms，并用Mimics Research 20.0 软件对种植体周围骨质进行定量三维测量与影像收集，种植体周围骨高度即测量种植体尖端与附着在种植体颊侧边缘骨最大冠状位之间的距离，单位是μm。在每个种植体周围选取相同感兴趣体积（volume of interest，VOI），定义为种植体周围直径1 mm、高1.7 mm的圆柱体，用Scanco micro-CTμ100 Evaluation Program v6.6软件分析VOI内骨密度，单位是mgHA·ccm^-1。

2.4 ELISA检测种植体周围牙龈组织中诸项指标

收集大鼠种植体周围牙龈组织，取一部分制做组织匀浆，另一部分在高温灭菌研钵中，液氮冷冻下研磨成粉末保存在EP管内，待蛋白印迹法（Western blotting）实验检测用。取2.2项下的龈沟液，按照TNF-α、IL-1β、MMP-13和COL-‍Ⅱ ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算牙龈组织中TNF-α、IL-1β的含量以及龈沟液中MMP-13、COL-Ⅱ的质量浓度。

2.5 Western blotting检测牙龈组织中相关蛋白表达情况

取2.4项下的样品EP管，加入等体积RIPA裂解液，冰上裂解5 min后取上清液，在4 ℃下以12 000 r·min^-1离心20 min，取上清液。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白质量浓度，加1/4体积的loading buffer混匀上样，沸水浴5 min，进行SDS-PAGE电泳，电转PVDF膜，用50 g·L^-1脱脂牛奶封闭1 h，取出孵育兔抗大鼠一抗（1∶1 000）过夜，次日加入二抗（1∶2 000）孵育，ECL曝光显影，以GAPDH蛋白灰度值为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法

用SPSS 22.0统计软件分析本次实验数据。计量资料符合正态分布，以（\overline{x}±s）表示，进行单因素方差分析与LSD-t比较。检验标准α=0.05。

3 结果

3.1 大鼠种植体的一般情况

阴性对照组大鼠种植体周围牙龈无肉眼可见的炎症征象。与阴性对照组比较，造模大鼠种植体周围牙龈组织可见明显质地变软、发红、水肿和渗出，探诊极容易出血，表示其造模成功。干预4周后，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组种植体周围牙龈组织上述症状均明显改善，且优于模型组，阴性对照组无变化。

3.2 大鼠牙周指标参数

与阴性对照组比较，模型组大鼠PD和GI指数较高（P<0.05）；与模型组比较，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组PD和GI指数较低（P<0.05）；与黄连素低剂量组比较，黄连素高剂量组和抗生素组PD和GI指数较低（P<0.05）；抗生素组最低（P<0.05）。见表1。

3.3 大鼠种植体周围骨高度与骨密度

与阴性对照组比较，模型组大鼠种植体周围骨高度、骨密度较低（P<0.05）；与模型组比较，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组种植体周围骨高度、骨密度较高（P<0.05）；与黄连素低剂量组比较，黄连素高剂量组和抗生素组种植体周围骨高度、骨密度较高（P<0.05）；与其他组比较，抗生素组种植体周围骨高度、骨密度最高（P<0.05）。见表2。

3.4 大鼠种植体周围牙龈组织中炎症指标

与阴性对照组比较，模型组大鼠牙龈组织中TNF-α、IL-1β水平较高（P<0.05）；与模型组比较，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组牙龈组织中TNF-α、IL-1β的水平较低（P<0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和抗生素组牙龈组织中TNF-α、IL-1β的水平较低（P<0.05）；与其他组相比较，抗生素组牙龈组织中TNF-α、IL-1β水平最低（P<0.05）。见表3。

3.5 大鼠种植体龈沟液中酶活性

与阴性对照组比较，模型组大鼠种植体龈沟液中COL-Ⅱ和MMP-13的活性较高（P<0.05）；与模型组比较，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组和抗生素组种植体龈沟液中COL-Ⅱ和MMP-13的活性较低（P<0.05）；与黄连素低剂量组比较，黄连素高剂量组和抗生素组种植体龈沟液中COL-Ⅱ和MMP-13活性较低（P<0.05）；与其他组比较，抗生素组种植体龈沟液中COL-Ⅱ与MMP-13活性最低（P<0.05）。见表4。

3.6 种植体周围牙龈组织相关蛋白的表达量

与阴性对照组比较，模型组大鼠种植体周围牙龈组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB-65蛋白的相对表达量较高（P<0.05）；与模型组比较，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB-65蛋白的相对表达量较低（P<0.05）；与其他组比较，黄连素高剂量组大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB-65蛋白的相对表达量最低（P<0.05）。见表5、图1。

4 讨论

种植体周围炎的发生机制是种植体牙龈组织受细菌感染，导致种植体袖口软组织封闭状态被破坏而致病，故抗炎是治疗的关键。用于治疗种植体周围炎的抗生素极其有限，且多数抗生素仅能在一定时期内发挥抗炎作用。黄连素已显示了其在抗真菌感染、细菌和病毒感染方面的一些活性，关于其抗菌性与机制的研究日益增加^［8］。MOHAMMADIAN HAFTCHESHMEH S等^［9］研究认为，黄连素在控制或治疗多种炎症疾病方面具有潜在的抗炎特性，其介导的抗炎作用可抑制牙周组织和牙槽骨破坏并控制体内疾病，故本实验探讨分析黄连素在种植体周围炎治疗中的作用及可能机制。

种植体周围炎的早期症状为种植体周围牙龈组织炎症，表现为牙龈红肿、出血等，若炎症继续发展，可能出现骨吸收等不良后果，导致种植失败。正常种植体周围组织的PD一般在2~4 mm之间，若发生炎症，PD会随炎症延长而加深，这是因为牙龈红肿导致PD增加，但PD增加并不能说明出现骨吸收，仅能证明种植体周围发生了炎症。GI指数反映了牙龈炎症程度以及健康状态，结果显示，与阴性对照组比较，模型组大鼠PD和GI指数均较高，表示造模成功；与模型组比较，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组大鼠PD和GI指数均较低，初步表明黄连素对种植体周围炎大鼠有抗炎疗效。组织学上，TNF-α、IL-1β是在种植体周围炎中普遍存在的促炎因子^［10-11］，可激活细胞因子、趋化因子以及转录因子参与炎症过程。研究结果显示，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组大鼠牙龈组织中TNF-α、IL-1β含量低于模型组，表明黄连素可抑制种植体周围组织的炎症。若种植体周围长期受细菌感染，其周围软硬组织将出现无法逆转的损伤，其中支持骨丧失的关键环节是细胞外基质损坏^［12］。生物标志物作为生物状态指标，可在分泌物中检测，比如种植体周围龈沟液，其中宿主源酶活性可作为观察种植体周围状态的重要指标。MMP-13是中性粒细胞的主要成分，可协调细胞外基质大分子分解，维持细胞外基质动态平衡，检测其水平有助于分析种植体周围炎症进程以及垂直骨吸收情况^［13］。COL-Ⅱ由浸润的白细胞所分泌，其最高活性往往出现于牙齿与种植体感染最严重的部位，一般情况下活性很低，一旦升高表示种植体周围炎症加重，同时也是破坏种植体周围组织、使其松动脱落的重要步骤^［14］。结果显示，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组大鼠龈沟液中MMP-13和COL-Ⅱ含量低于模型组，种植体周围骨高度、骨密度高于模型组，表明黄连素对种植体周围炎有拮抗作用，并能保护种植体，避免损伤其骨组织形态和骨密度。

NF-κB是调节细胞转录的因子，已被证实在炎症的发生、发展中发挥重要作用^［15］。TLR4作为最早被发现的Toll样受体，在粒细胞、单核巨噬细胞等参与宿主防御功能的细胞中表达^［16］。TLR4不仅能特异性识别外源性病原体相关的分子模式，还可识别内源性损伤相关的分子模式，其细胞外富含亮氨酸的重复序列，识别相应的内源性损伤分子模式后，与MyD88相结合，而MyD88活化后可募集肿瘤坏死因子受体相关因子，激活NF-κB信号通路，促进该通路下游炎性细胞因子TNF-α、IL-1β等的转录和释放^［17］。WU X等^［18］报道抑制TLR4/NF-κB可预防种植体周围炎。TNF-α可诱导基质细胞、牙周膜细胞等表达NF-κB受体活化因子配体，IL-1β作为体外骨吸收较活跃的细胞因子，参与骨组织代谢，并协同多种炎症介质共同加速骨吸收，临床上往往通过测量龈沟液中TNF-α、IL-1β含量了解种植体周围炎症的发展程度^［19-20］。Western blotting检测结果显示，黄连素低剂量组、黄连素高剂量组大鼠种植体周围牙龈组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB-65蛋白的相对表达量低于模型组，表明黄连素可能通过下调TLR4/NF-κB信号通路治疗种植体周围炎。

综上所述，黄连素治疗种植体周围炎的作用机制可能与下调TLR4/NF-κB信号通路有关。本研究取得了预期结果，但尚存在不足，如未开展种植体承载牙合力的相关实验，亦未进行种植体骨组织切片观察，后续还需进行进一步补充研究，为研发黄连素在种植体周围炎中的应用提供更多实验依据。

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基金资助

2020 年度中医药类科研计划课题(2020423)