黄连素对糖尿病大鼠血脂代谢及胰岛素抵抗的作用

Effects of berberine on blood lipid metabolism and insulin resistance in diabetic rats

摘要

目的 探讨黄连素对糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠血脂代谢及胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的作用。 方法 取10只正常大鼠作为正常对照组（Con）。将DM建模成功大鼠随机分为模型组（M）、阳性对照组（Pon）、黄连素低剂量组（L-Ber）和黄连素高剂量组（H-Ber），分别为9、9、9、8只，将剩余8只非DM模型大鼠纳入非DM组（N-DM）。经相应干预后，测定各组大鼠体质量、饮水量、摄食量、血糖、血脂指标和IR；HE染色观察胰腺组织形态学变化；蛋白印迹法（Western blotting）检测磷酸化胰岛素受体底物1（phosphorylated insulin receptor substrate 1，p-IRS-1）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）和葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）蛋白的表达水平。 结果 与Con组比较，M组的饮水量、摄食量、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹胰岛素（fasting insulin，FIns）、胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）、糖耐量和空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）均升高，体质量、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、p-IRS-1、p-PI3K和GLUT-4蛋白相对表达量均降低（P<0.05）。与M组比较，L-Ber组、H-Ber组和Pon组的饮水量、摄食量、TC、TG、LDL-C、FIns、HOMA-IR、糖耐量和FBG均降低，胰腺组织形态学异常减轻，体质量、HDL-C、p-IRS-1、p-PI3K和GLUT-4蛋白相对表达量均升高（P<0.05）。 结论 黄连素可改善DM大鼠血脂代谢及IR，作用机制可能与调节IRS-1/PI3K/GLUT4通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of berberine on blood lipid metabolism and insulin resistance （IR） in diabetes mellitus （DM） rats. Methods Ten normal rats were taken as the normal control group （Con）. The rats with successful DM modeling were randomly divided into DM model group （M）， positive control group （Pon）， berberine low （L-Ber） and high-dose groups （H-Ber）， which were 9， 9， 9 and 8 respectively. The other 8 non-DM rats were included in the non-DM group （N-DM）. After the corresponding intervention， the body weight， drinking water， food intake， blood glucose， blood lipid and IR were measured. The histomorphological changes of pancreas were observed by HE staining. The protein expressions of phosphorylated insulin receptor substrate 1 （p-IRS-1）， the protein expression of phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase （p-PI3K） and glucose transporter-4 （GLUT-4） were detected by Western blotting. Results Compared with the Con group， the water intake， food intake， total cholesterol（TC）， triglyceride（TG）， low density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， fasting insulin， （FIns）， homeostasis model assessment of insulin resistance， （HOMA-IR）， glucose tolerance， fasting blood glucose （FBG） increased， the body weight， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and the relative expression of p-IRS-1， p-PI3K and GLUT-4 protein decreased （P<0.05）. Compared with the M group， the water intake， food intake， TC， TG， LDL-C， FIns， HOMA-IR， glucose tolerance， and FBG in the L-Ber group， H-ber group， and Pon group decreased in sequence， the abnormal morphology of the pancreas were reduced， the body weight， HDL-C and the relative expression of p-IRS-1， p-PI3K and GLUT-4 protein increased successively （P<0.05）. Conclusion Berberine can improve blood lipid metabolism and IR in DM rats. The mechanism may be related to the regulation of IRS-1/PI3K/GLUT4 pathway.

Graphical abstract

关键词

黄连素 / 糖尿病 / 血脂代谢 / 胰岛素抵抗

Key words

berberine / diabetes mellitus / lipid metabolism / insulin resistance

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种常见慢性疾病，2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）占全部DM人数的90%左右，可引发全身多器官病变，且易发生血脂代谢紊乱^［1-2］。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）主要表现为肝脏、脂肪组织和骨骼肌等外周组织对胰岛素敏感性降低，研究发现其发生机制可能为胰岛素信号转导通路失活，同时胰岛素抵抗是引发T2DM的主要病因^［3-4］。黄连素可抗胃肠道感染，且具有降糖、调脂和提升胰岛素敏感性等药理作用^［5］。本研究开展动物实验，分析黄连素对T2DM大鼠血脂代谢、IR的影响，并探讨其作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-1700紫外分光光度计（日本岛津株式会社）；ACCU-CHEK ACTIVE 罗氏血糖仪（德国Roche Diagnostics GmbH公司）；IX71-F22FLPH型倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯医疗株式会社）；Alcyon 300全自动生化分析仪（美国Abbott公司）。

1.2 试药

黄连素［黑龙江百泰药业有限公司，以含5 g·L^-1羟甲基纤维素钠的PBS液（pH 7.4）配制成含黄连素9.375 g·L^-1的混悬液］；盐酸二甲双胍片（北京京丰制药集团有限公司，经水磨法，用含5 g·L^-1羟甲基纤维素钠的PBS液配制成含二甲双胍12 g·L^-1的混悬液）；链脲佐菌素（美国Sigma公司）；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）检测试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司；兔抗大鼠胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）、p-IRS-1、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、p-PI3K和葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）一抗及山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）二抗均购自美国Santa cruz公司；苏木精-伊红染色（HE）试剂盒（北京中杉金桥生物科技公司）。

1.3 动物

58只SPF级SD大鼠，雄性，7周龄，体质量为250~270 g，购自北京科兴生物制品有限公司，许可证号为SYXK（京）2019-0053。实验前适应性喂养1周，环境温度为（22±2） ℃，湿度为50%，每日12 h光亮/黑暗条件，自由获得饮水、饲料。本研究经动物伦理委员会批准，动物处置符合“3R”原则。

2 方法

2.1 模型制备及分组

58只大鼠中随机取10只作为正常对照组（Con），以常规饲料（成分包括鸡蛋、玉米、小麦、维生素、氨基酸和鱼粉）喂养8周。剩余大鼠中随机取40只建立T2DM大鼠模型^［6］：先以高脂高糖饲料（成分质量分数：1.5%胆固醇，83.25%常规饲料，0.25%胆酸钠，10%猪油，5%蔗糖）喂养4周，随后一次性以30 mg·kg^-1剂量注射链脲佐菌素，再继续喂养高脂高糖饲料4周。T2DM大鼠模型建模成功的标准：建模后72 h，大鼠禁食12 h，尾部采血，以血糖仪检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）>11.8 mmol·L^-1为建模成功。共成功建模35只，成功率为87.50%。将35只建模成功大鼠随机分为DM模型组（M）、阳性对照组（Pon）、黄连素低剂量组（L-Ber）和黄连素高剂量组（H-Ber），分别为9、9、9、8只。剩余8只仅以高脂高糖饲料喂养8周，建立非DM大鼠模型。非DM大鼠模型建模成功的标准：大鼠体质量超过Con组20%，且FBG<11.8 mmol·L^-1。8只大鼠均建模成功，纳入非DM组（N-DM）。

2.2 给药方法

建模成功后3 d开始给药。Pon组以200 mg·kg^-1·d^-1剂量灌胃二甲双胍混悬液，L-Ber组以93.75 mg·kg^-1·d^-1剂量灌胃黄连素混悬液，H-Ber组以187.50 mg·kg^-1·d^-1剂量灌胃黄连素混悬液，Con组、M组和N-DM组以含等量5 g·L^-1羟甲基纤维素的PBS液灌胃，均每日1次，连续处理5周。

2.3 动物取材及处理

观察各组大鼠自治疗开始到治疗5周时每日饮水量、每周体质量的变化，记录数据，取平均值。完成观察后采血，采血前禁食不禁水12 h，先取3 mL尾静脉血，以备检测FBG；腹腔注射麻醉，取10 mL腹主动脉血，置于真空采血管中储存，以备检测血脂指标、空腹胰岛素（fasting insulin，FIns）及胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance， HOMA-IR）。随后断头处死，取整个胰腺组织，分为2份。1份置于液氮中保存，以备检测蛋白的相对表达量；另1份置于40 g·L^-1多聚甲醛中固定，以备观察胰腺组织的病理变化。

2.4 血脂指标及FIns、HOMA-IR的检测

取10 mL腹主动脉血，在4 ℃下以3 000 r·min^-1离心15 min，离心半径为8 cm，分离血清。通过全自动生化分析仪，采用酶比色法检测血脂指标，包括TC、TG、HDL-C和LDL-C，具体操作步骤按照仪器及试剂盒使用说明书进行。以放射免疫分析法检测FIns，严格按照说明书进行操作。计算HOMA-IR。HOMA-IR=FBG×Fins/22.5。

2.5 血糖指标的检测

取3 mL尾静脉血，用罗氏血糖仪检测FBG，严格按照仪器及配套试纸使用说明书进行操作。完成FBG检测后，大鼠以5 g·kg^-1体质量葡萄糖溶液灌胃，分别在灌胃后0.0、0.5、2.0 h取尾静脉血，用葡萄糖氧化酶法检测血糖值，以评估糖耐量。

2.6 胰腺组织病理形态特征的检测

用HE染色法观察。取用多聚甲醛固定的胰腺组织，甩干残留甲醛水溶液。用梯度乙醇脱蜡，二甲苯透明，石蜡包埋。切片（厚度4 µm），切片置于烤片机烤干。用二甲苯透明，梯度乙醇脱蜡，水洗。用苏木精染色5 min，用12.4 mol·L^-1盐酸乙醇分化，流水冲洗30 min。用伊红染色3 min，用流水冲洗。用梯度乙醇脱蜡，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察胰腺组织形态学变化。

2.7 蛋白印迹法（Western blotting）检测蛋白的表达情况

取用液氮保存的胰腺组织，PBS液冲洗2次，冰上裂解制备匀浆。在4 ℃下以12 000 r·min^-1离心10 min，离心半径为8 cm，取上清液。用二喹啉甲酸法进行蛋白定量，加体积2×上样缓冲液，沸水浴变性（10 min）。以质量浓度120 g·L^-1十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行蛋白分离，转膜，脱脂奶粉封闭1 h。加兔抗大鼠p-IRS-1（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）和GLUT-4（1∶1 000）一抗，在4 ℃摇床中孵育过夜。TBST洗膜4次，每次10 min。加二抗（1∶2 500），室温孵育2 h。TBST洗膜4次，每次10 min。加增强型化学发光ECL（enhanced chemiluminescence）检测试剂，经Image Quant LAS4000生物分子成像仪曝光成像，观察条带灰度值，计算目的蛋白水平。目的蛋白水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

2.8 统计学方法

用SPSS 21.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料用（\overline{x}±s）表示，两组间比较用LSD-t检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况、生化指标的比较

与Con组比较，M组的体质量、HDL-C降低，饮水量、摄食量、TC、TG、LDL-C、FIns和HOMA-IR均升高（P<0.05）。与M组比较，L-Ber组、H-Ber组和Pon组的体质量、HDL-C依次升高，饮水量、摄食量、TC、TG、LDL-C、FIns和HOMA-IR均依次降低（P<0.05）。见表1。

3.2 不同时段糖耐量、FBG水平的比较

与Con组比较，M组不同时段的糖耐量、FBG水平均升高（P<0.05）。与M组比较，L-Ber组、H-Ber组和Pon组不同时段的糖耐量、FBG水平均依次降低（P<0.05）。见表2。

3.3 大鼠胰腺组织病理变化的比较

HE结果染色显示，Con组、N-DM组的胰岛结构清晰，胰腺细胞分布均匀，形态无异常。M组的胰腺细胞分布不均匀，排列紊乱，少量细胞核固缩，胰岛结构不清晰，体积变小，胰腺出现空泡。与M组比较，Pon组、L-Ber组和H-Ber组的胰腺细胞数量增多，胰岛结构较清晰，胞质均匀，胞核清晰，且改善效果L-Ber组<H-Ber组<Pon组。见图1。

3.4 p-IRS-1、p-PI3K和GLUT-4蛋白相对表达量的比较

与Con组比较，M组的p-IRS-1、p-PI3K和GLUT-4蛋白的相对表达量降低（P<0.05）。与M组比较，L-Ber组、H-Ber组和Pon组的p-IRS-1、p-PI3K和GLUT-4蛋白的相对表达量均依次升高（P<0.05）。见图2、表3。

4 讨论

IR在T2DM发病中发挥重要作用，可造成糖脂代谢紊乱，增加心血管、微血管内皮损伤发生风险^［7］。另外，T2DM还极易伴随血脂代谢异常，这是造成血管、肾脏损伤的一个独立危险因素^［8］。长时间血脂代谢紊乱可引发微血管、大血管及神经病变，致使胰岛内脂肪酸大量沉积，诱发胰岛细胞“脂凋亡”“脂毒性”，引起胰岛功能衰竭^［9-10］。

黄连入药在我国中医中历史悠久，具有清热燥湿、泻火解毒的作用。黄连素可降低胆固醇，调节血糖水平，增强胰岛素敏感性^［11-13］。本研究结果显示，黄连素高剂量给药可提升大鼠体质量，减少饮水量，且可改善血脂指标TC、TG、HDL-C和LDL-C，调节糖耐量、FBG、FIns和HOMA-IR；进一步分析病理变化显示，黄连素高剂量给药后胰腺细胞数量增多，胰岛结构较清晰，胞质均匀，胞核清晰，表明黄连素在改善DM大鼠血脂代谢、IR中具有一定效果，且呈剂量依赖性。经相关经动物模型的研究证明^［14］，黄连素可改善DM大鼠IR，且具有调脂功能，与本研究共同证实黄连素调节血脂代谢、IR的作用。

胰岛素可经正常胰岛素信号转导通路，发挥稳定血糖、促进合成代谢的作用，而胰岛素信号传递受阻或减弱为引发IR的主要原因。有报道显示^［15-16］，IRS-1、PI3K和GLUT-4为胰岛素转导通路中的关键靶点，其中任一靶点出现异常，均可引发IR，导致T2DM。正常情况下，胰岛素与其受体结合后，可激活酪氨酸激酶，引发IRS-1磷酸化，经IRS-1/PI3K/GLUT-4途径发挥部分代谢调控功能，比如促进葡萄糖摄取、刺激GLUT-4迁移到胞膜等。有学者^［17-18］提出，IRS-1基因突变可减弱IRS-1酪氨酸磷酸化，增强IRS-1丝氨酸磷酸化，干扰PI3K活化，影响下游信号通路转导，引发IR。GUI S等^［18-19］研究发现，黄连素可经激活PI3K及胰岛素信号通路，增强脂肪细胞对胰岛素的敏感性，以改善游离脂肪酸所致IR，表明DM患者血脂代谢及IR调控可能与IRS-1/PI3K/GLUT-4通路有关。本研究结果显示，黄连素可显著提升大鼠胰腺组织p-IRS-1、p-PI3K和GLUT-4蛋白的相对表达量，且效果呈剂量依赖性，表明黄连素调节IRS-1/PI3K/GLUT-4通路可能是其改善DM大鼠血脂代谢及IR的重要作用机制之一。

综上所述，黄连素可改善DM大鼠血糖、血脂代谢，减轻IR，其作用机制可能与调节IRS-1/PI3K/GLUT-4通路有关。本研究不足之处：所选大鼠数量较少，可能影响结果的客观性；黄连素对T2DM疗效的作用机制研究仍不够充分，是否可改善其他通路、靶点仍需在今后的研究中继续分析。

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基金资助

2021年度河北省医学科学研究课题计划项目(20210053)

2022年度河北省医学科学研究课题计划项目(20221875)