胡桃醌F127/TPGS混合胶束的制备及其对溃疡性结肠炎的治疗作用

Preparation of mixed micelles of juglone F127/TPGS and their therapeutic effects on ulcerative colitis

摘要

目的 优化胡桃醌普郎尼克F127（F127）/聚乙二醇琥珀酸酯（d-alpha tocopheryl polythylene glycol succinate，TPGS）混合胶束的制备工艺，并对该混合胶束进行表征和体内药效学研究。 方法 用薄膜分散法制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束，以包封率为指标，用单因素和3因素3水平响应面实验优化胡桃醌混合胶束的制备工艺。用透射电镜和马尔文粒度仪对混合胶束进行表征。用透析袋研究其体外释放度。通过疾病活动指数（DAI）和结肠HE切片研究胡桃醌F127/TPGS混合胶束体内抗溃疡性结肠炎作用。 结果 胡桃醌F127/TPGS混合胶束的最佳制备工艺：药物∶载体=1∶50、F127∶FPGS=4∶5、水化体积为10 mL、水化时间为1 h、乙醇体积为1 mL。对最优处方进行验证，得到胡桃醌的平均包封率为90.53%，与预测值（85.32%）偏差较小。透射电镜下混合胶束呈球形，形态完整且分布均匀。平均电位为（-3.86±3.05） mV，平均粒径为（13.91±0.15） nm，PDI为（0.092±0.009）。体外释放度实验结果显示，胡桃醌F127/TPGS混合胶束的累积释放度大于胡桃醌混悬液。胡桃醌F127/TPGS混合胶束干预后，小鼠DAI值下降，结肠组织病理损伤得到缓解。 结论 经响应面优化的胡桃醌F127/TPGS混合胶束制备工艺条件稳定，且可增加胡桃醌溶解度，增强胡桃醌抗溃疡性结肠炎的作用。

Abstract

Objective To optimize the preparation process of mixed micelles of juglone F127/d-alpha tocopheryl polythylene glycol succinate（F127/TPGS）， and to study the characterization and pharmacodynamics of the mixed micelles. Methods The mixed micelles of juglone F127/TPGS were prepared by thin film dispersion method. With the encapsulation rate as index， single-factor and three-factor and three-level response surface tests were used to optimize the preparation process of walnut quinone mixed micelles. The mixed micelles were characterized by transmission electron microscopy （TEM） and Malvern particle size analyzer. The release of the micelles in vitro was studied by dialysis bag. The anti-ulcerative colitis effect of juglone F127/TPGS mixed micelles in vivo was studied by disease activity index （DAI） and colon HE sections. Results The optimal preparation conditions were as follows： juglone/carrier=1∶50， F127∶ FPGS=4∶5， the hydration volume 10 mL， the hydration time 1 hour， and the ethanol volume 1 mL. After verification， the average encapsulation rate of juglone was 90.53%， which had little deviation from the predicted value of 85.32%. The mixed micelles of juglone F127/TPGS were spherical in shape and uniform in distribution under TEM. The average potential was （-3.86±3.05） mV， the average particle size was （13.91±0.15） nm， and the PDI was （0.092±0.009）. The results of release test showed that the cumulative release of F127/TPGS micelles was greater than that of juglone suspension. With the intervention of juglone F127/TPGS mixed micelles， DAI value of mice decreased， the pathological injury of colon tissue was relieved. Conclusion The optimized preparation of juglone F127/TPGS mixed micelles was stable and can increase the solubility of juglone and enhance the anti-ulcerative colitis effect of juglone.

Graphical abstract

关键词

胡桃醌 / Box-Behnken响应面法 / F127 / 聚乙二醇琥珀酸酯 / 混合胶束

Key words

juglone / Box-Behnken response surface method / F127 / TPGS / mixed micelles

青龙衣出自《开宝本草》，为胡桃科植物胡桃未成熟果实的外果皮，归肝脾胃经，味苦涩性平，可用于止痛止泻、解毒杀虫。其含有多种化学成分，如萘醌类、黄酮类、多酚类、萜类等^［1］。胡桃醌是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种功效^［2-3］。但胡桃醌不稳定、溶解度差、易分解挥发的特点限制了其开发利用^［4］。因此，需要寻找合适的载药系统解决胡桃醌的上述问题，为其开发应用奠定基础。

聚合物胶束由两亲性聚合物自组装形成，疏水基团在内，亲水性基团在外，难溶性药物可包裹在疏水核内部。聚合物胶束可提高难溶性药物的溶解度和稳定性，是一种极具潜力的药物载体^［5-6］。普郎尼克F127（F127）是两亲性共聚物，可增加难溶性药物的溶解度，且表面带负电荷，有利于药物的口服吸收^［7］。但是F127单独作为胶束时包封率较低^［8］。维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）是一种新型的非离子表面活性剂^［9］，同时具有亲脂性的维生素E基团和亲水性的聚乙二醇长链，具有两亲性特点^［10］。TPGS作为辅料能够提高药物包封率、提高生物利用度、提高药物靶向性^［11］。本文将F127和TPGS作为载体材料，制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束，并对该混合胶束进行工艺优化、表征和药效学研究，为后续药动学和药效学作用机制研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）；YH-C1002电子天平（瑞安市英衡电器有限公司）；RE-5203旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TDL-40B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Nano-ZS90电位及粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；KH-300TDB型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；JEM1400低电压透射电镜（日本JEOL公司）。Olympus Ⅸ73荧光倒置显微镜（南京奥力科学仪器有限公司）。

1.2 试药

胡桃醌对照品（质量分数为98%，批号F10HB169158）、胡桃醌（质量分数为98%，批号M19M10E83494）、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物（F127，批号H25J7C9431）均购自上海源叶生物科技有限公司；维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，批号147879，MCE公司）；甲醇（TEDIA公司）；无水乙醇（上海泰坦科技股份有限公司）。

1.3 动物

雄性ICR小鼠30只，4周龄，体质量为（18±2） g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。小鼠饲养于江苏省中医药研究院实验动物中心，温度为22 ℃，湿度为50%，12 h昼夜交替。本研究经江苏省中医药研究院伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 胡桃醌F127/TPGS混合胶束的制备

用薄膜分散法制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束。称取一定比例的胡桃醌、F127和TPGS置于50 mL茄形瓶中，加入2 mL无水乙醇超声30 min使其完全溶解。60 ℃减压旋转蒸发除去乙醇并形成干燥透明的药膜。加入10 mL纯化水剧烈振荡1 min，放于室温静置1 h使其充分水化。以12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液即为黄色透明的胡桃醌F127/TPGS混合胶束，同法制备空白胶束F127/TPGS-MM（不含胡桃醌）。

2.2 胡桃醌含量的测定

2.2.1 色谱条件

ZORBAX Extend C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水溶液（65∶35），流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为246 nm，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取胡桃醌对照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

取胡桃醌F127/TPGS混合胶束1 mL，置于15 mL离心管中，加入甲醇9 mL，超声15 min破除胶束结构，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取胡桃醌对照品溶液适量，用甲醇按不同比例稀释，得到质量浓度为0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg·mL^-1的系列对照品溶液，分别吸取20 μL进样分析，以胡桃醌质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2.2.5 包封率的测定

精密量取载药胶束1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声15 min破除胶束结构，过0.45 μm微孔滤膜，按2.2.1项下色谱条件检测，计算药物包封率。包封率＝（胶束中胡桃醌的含量/胡桃醌投药量）×100%。

2.3 单因素考察

2.3.1 胡桃醌与载体的质量比考察

固定胡桃醌为10 mg，水化体积为10 mL。其他条件同2.1项下条件，考察胡桃醌与载体之比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50时对混合胶束包封率的影响。

2.3.2 F127与TPGS的比例考察

固定胡桃醌为10 mg，水化体积为10 mL。其他条件同2.1项下条件，考察F127与TPGS投药量分别为4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、4∶5时对混合胶束包封率的影响。

2.3.3 水化时间的考察

固定载体材料F127与TPGS均为200 mg，胡桃醌投药量为10 mg，水化体积为10 mL，其他条件同2.1项下条件，考察水化时间为1、2、3、4、5 h条件对包封率的影响。

2.3.4 乙醇体积的考察

固定载体材料F127与TPGS均为200 mg，胡桃醌投药量为10 mg，水化体积为10 mL，其他条件同2.1项下条件，考察乙醇体积分别为1、2、3、4、5 mL对包封率的影响。

2.3.5 水化体积的考察

固定载体材料F127与TPGS均为200 mg，胡桃醌投药量为10 mg，其他条件同2.1项下，考察水化体积分别为6、8、10、12、14 mL时对包封率的影响。

2.4 Box-Behnken 响应面法优化处方

在单因素考察结果中，选择对包封率影响最大的3个因素：载体与胡桃醌的质量比（x₁）、F127与TPGS的质量比（x₂）、水化体积（x₃），选择低、中、高3个水平，以混合胶束包封率（y）为指标进行 Box-Behnken 响应面法实验设计。

2.5 胡桃醌F127/TPGS混合胶束的评价

2.5.1 粒径和电位

取胡桃醌混合胶束3 mL，置于5 mL离心管中，适当稀释，用马尔文粒度仪检测胶束的粒径、电位和PDI值。

2.5.2 形态学

在最优处方条件下制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束，滴于铜网上吸附3 min，用体积分数2%磷钨酸染色后用低电压透射电镜拍摄胶束形态。

2.5.3 体外释放度

分别取2 mL的胡桃醌F127/TPGS混合胶束和2 mL胡桃醌混悬液，置于透析袋中（截留相对分子质量为8 000~14 000），两端用透析袋夹夹紧并排除多余气泡，分别置于装有100 mL人工胃液和人工肠液中的溶出杯中，人工胃液和人工肠液中各加入体积分数1%聚山梨酯-80。置于37 ℃溶出仪中以100 r·min^-1搅拌，在0.5、1、2、4、8、10、12、24 h各取样2 mL，并及时补加等体积、等温度的释放介质。经0.45 μm微孔滤膜滤过后取续滤液进样，计算累积释放度。

2.5.4 药效学评价

将30只ICR小鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组（100 mg·kg^-1）、胡桃醌组（1 mg·kg^-1）、胡桃醌F127/TPGS混合胶束组（1 mg·kg^-1），每组6只。正常组小鼠饮用纯净水，其余各组小鼠饮用27 mg·mL^-1葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）水溶液。连续处理1周，建立溃疡性结肠炎模型。自造模之日起，各组开始灌胃给药，正常组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，连续处理10 d。每日称定质量、观察大便性状，计算疾病活动指数。第11天脱颈椎处死小鼠，取结肠进行HE染色。

3 结果

3.1 线性关系

以胡桃醌质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，得到回归方程y=56 598x+14.127（R²=0.999 5），结果表明胡桃醌在0.001~0.064 mg·mL^-1范围内与其峰面积呈良好线性关系。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 胡桃醌与载体的质量比考察

设置胡桃醌与载体质量比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。随着载体比例的增大，混合胶束的包封率逐渐增大，其包封率分别为（27.76%±2.56%）、（41.79%±3.59%），（59.40%±3.63%）、（74.83%±2.56%）、（75.83%±1.80%）。当胡桃醌与载体的比例为1∶40时，胶束的包封率较高，且样品颜色均一透明，稳定性良好。因此，确定胡桃醌与载体质量比为1∶40。

3.2.2 F127与TPGS的质量比考察

设置F127与TPGS的质量比分别为4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、4∶5，随着TPGS含量增加，混合胶束的包封率逐渐增加，包封率分别为（63.72%±5.35%）、（67.44%±3.68%）、（71.42%±4.18%）、（80.58%±1.51%）、（73.01%±6.30%）。当F127与TPGS的比例为4∶4时，胶束的包封率达到最大。因此，确定F127与TPGS的质量比为4∶4。

3.2.3 水化时间的考察

设置水化时间为1、2、3、4、5 h，所得胶束的包封率分别为（86.59%±1.42%）、（70.61%±5.77%）、（75.35%±0.95%）、（81.96%±2.78%）、（83.17%±5.88%）。当水化时间为1 h时，胶束的包封率最大，确定水化时间为1 h。

3.2.4 乙醇体积的考察

设置乙醇体积1、2、3、4、5 mL，所得胶束的包封率分别为（85.97%±1.91%）、（75.81%±4.26%）、（74.80%±1.43%）、（81.52%±2.26%）、（82.70%±6.33%）。当乙醇体积为1 mL时，胶束的包封率最大，随着乙醇体积的增加，包封率逐渐降低。确定乙醇体积为1 mL。

3.2.5 水化体积的考察

设置水化体积为6、8、10、12、14 mL，所得胶束的包封率分别为（61.44%±1.90%）、（71.44%±10.72%）、（66.62%±2.61%）、（73.00%±4.22%）、（67.35%±4.58%）。随着水化体积的增加，包封率逐渐增大，当水化体积为12 mL时，包封率最大。因此，确定水化体积为12 mL。

3.3 Box-Behnken 响应面法优化制备工艺

通过3因素3水平星点响应面法优化制备工艺，Box-Behnken 实验设计和结果见表1。

通过Design-Expert 8.0软件，对表1数据进行多元线性回归拟合，2项式拟合方程如下：y=76.30+6.12x₁+2.36x₂+2.25x₃+3.67x₁x₂-3.05x₁x₃-1.84x₂x₃-1.67x₁²-2.52x₂²-1.64x₃²。各因素回归系数和方差分析结果见表2：该模型P值为0.000 7，具有显著性，失拟项P值为0.680 5，无显著性。相关性系数R²为0.954 1，表明此模型可以较好地描述各因素与指标之间的关系。决定校正系数R_adj²为0.895 2，表明模型与数据的拟合度很高，实验误差小。用Design-Expert 8.0软件做不同因素相互作用的3D响应曲面图，见图1。最后通过Design-Expert 8.0软件的优化，确定混合胶束的最佳工艺条件为：胡桃醌∶载体=1∶50，F127∶FPGS=4∶5、水化体积10 mL、水化时间1 h、乙醇体积1 mL。预测样品包封率为85.32%。按软件计算得到的最优处方结果平行制备3批混合胶束，测定混合胶束中胡桃醌含量。得到胡桃醌的平均包封率为90.53%，与预测值（85.32%）偏差较小，RSD值为3.84%。表明模型预测值良好，制备工艺稳定。

3.4 胡桃醌F127/TPGS混合胶束的评价

3.4.1 粒径

胡桃醌F127/TPGS混合胶束的粒径和Zeta电位见图2，胡桃醌混合胶束的平均Zeta电位为（-3.86±3.05） mV，平均粒径为（13.91±0.153 7） nm，PDI为（0.092±0.009），结果表明，胡桃醌混合胶束带负电荷且粒径分布均匀。

3.4.2 透射电镜

在最优处方条件下制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束，用低电压透射电镜拍摄胶束形态。结果见图3。由图3可见，胡桃醌F127/TPGS混合胶束的形态基本呈球形，且分散均匀。

3.4.3 体外释放度

胡桃醌F127/TPGS混合胶束和胡桃醌混悬液的累积释放度见图4。在不同释放介质中，胡桃醌F127/TPGS混合胶束累积释放度均高于胡桃醌混悬液，表明聚合物胶束可能促进了胡桃醌的溶解。

3.4.4 药效学评估

小鼠DAI值见图5，胡桃醌和胡桃醌F127/TPGS混合胶束干预后，DAI值均下降，表明胡桃醌和混合胶束均能改善小鼠溃疡性结肠炎的症状。其中胡桃醌F127/TPGS混合胶束的DAI值下降更明显（P<0.05）。小鼠结肠HE切片见图6，由图6可见，结肠表面充血，黏膜破损。胡桃醌和胡桃醌F127/TPGS混合胶束干预后，结肠长度较模型组有回调，结肠表面有个别部位充血，无黏膜破损现象。与正常组相比，模型组黏膜及其下层有充血现象，隐窝破损，杯状细胞丢失，有大量炎性细胞浸润，符合溃疡性结肠炎典型病理现象。胡桃醌混悬液和胡桃醌F127/TPGS混合胶束干预后，隐窝受损和炎性细胞浸润减轻，腺体排列整齐，病理损伤得到缓解。

4 讨论

胡桃醌是一种有应用潜力的抗炎、抗肿瘤药物，但由于其溶解度和生物利用度均较低，故其临床应用受到限制^［12］。聚合物胶束是两亲性聚合物在临界胶束浓度（CMC）下自发形成的团聚体^［13］。亲水性基团和疏水性基团分别形成胶束的外壳和核心，在水环境下，亲水端在胶束外形成水保护层，疏水部分与疏水药物结合后包裹在胶束核内，增加其溶解度^［14］。与单一载体比较，混合胶束的结构更稳定，载药量更高，且制做过程简单。本文选择两大共聚物，TPGS是一种非离子表面活性剂，是维生素E与聚乙二醇1000的结合物，其中维生素E是疏水的，聚乙二醇是亲水的，具有两亲性，因此可以用来装载疏水药物^［15］。如巨鲜婷等^［16］用TPGS和F123作为载体材料，制备阿立哌唑（ARP）混合纳米胶束，显著提高了ARP的口服生物利用度。F127以聚丙烯氧化物为疏水核心，两侧为亲水聚乙二醇衍生物^［17］，是理想的胶束载体，在药物制剂中得到广泛应用。

本文通过薄膜分散法制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束，以包封率为指标，选择3因素3水平，用星点响应面法对工艺进行优化，优化后包封率达90.53%，表明胡桃醌被较多地封装在胶束中。通过疏水相互作用、氢键和范德华相互作用，溶解性差的药物被胶束包裹以提高其溶解性^［18］。从对胡桃醌F127/TPGS混合胶束的体外评价结果可以看出，胡桃醌F127/TPGS混合胶束的平均电位为（-3.86±3.05） mV，平均粒径为（13.91±0.153 7） nm，PDI为（0.092±0.009）。表明胡桃醌F127/TPGS混合胶束带负电荷且粒径分散均匀。体外释放度实验结果表明，胡桃醌F127/TPGS混合胶束显著提高了胡桃醌的溶解度，在人工肠液和人工胃液中的累积释放度均高于90%。可能是由于聚合物胶束的粒径较小，在体外释放介质中提供了更大的接触面积，进而促进了胶束的药物释放，提高了药物释放率。对胡桃醌混悬液和胡桃醌F127/TPGS混合胶束进行药效学评估，胡桃醌和胡桃醌F127/TPGS混合胶束均能改善小鼠溃疡性结肠炎的症状。

本研究用薄膜分散法制备胡桃醌F127/TPGS混合胶束，用3因素3水平星点响应面法对胡桃醌F127/TPGS混合胶束的制备工艺进行优化。优化后的混合胶束的外观形态、粒径、Zeta电位等参数符合要求，包封率高，加载胶束后胡桃醌的溶出度显著提高，且抗UC作用更佳。为后续药动学和药效学作用机制的研究奠定了基础。不仅如此，胡桃醌因具有一定细胞毒性限制了其开放应用^［19］，而用纳米递送载体可降低全身毒性以克服上述局限性。其在医药、食品安全和农业方面具有广阔的应用前景^［20］。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81403121)

江苏省中医药科技发展计划项目(MS2021025)

南京中医药大学自然科学基金项目(XZR2020025)