正交试验法优选复方黄栀连颗粒的提取工艺

Optimization of the extraction process of Compound Huangzhilian Granules with orthogonal test

摘要

目的 优化复方黄栀连颗粒的提取工艺。 方法 以黄芩苷含量为评价指标，用单因素实验确定加水量、提取时间、提取次数的因素水平；以干膏率及黄芩苷含量综合分值为评价指标，用L₉（3⁴）正交试验筛选复方黄栀连颗粒的最佳提取工艺。 结果 最优提取工艺为加12倍水，提取3次，每次1 h。 结论 该提取方法便于操作，稳定可靠，重复性好。

Abstract

Objective To optimize the extraction process of Compound Huangzhilian Granules. Methods By taking the content of baicalin as an indicator， single factor tests were used to choose the three levels of amount of water， extraction time and extraction times. By taking the comprehensive scores of the dry extract rate and the content of baicalin as indicators， an L₉ （3⁴） of orthogonal experiment was used to optimize the extraction process. Results The optimized extraction conditions were 12 times amount of water and extracted for 3 times with 1 hour for each time. Conclusion The optimized extraction process is stable and feasible with good reproducibility.

Graphical abstract

关键词

复方黄栀连颗粒 / 正交试验 / 黄芩苷 / 提取工艺

Key words

Compound Huangzhilian Granules / orthogonal experiment / baicalin / extraction process

痤疮是一种慢性炎症性皮肤病，受皮脂过度分泌、痤疮丙酸杆菌等微生物感染、雄激素水平、饮食习惯及精神等多方面影响^［1］。痤疮皮损具有多样性，常累及面部，也可见于躯干部，发病率高^［2-3］，且好发于青少年。部分痤疮患者会遗留瘢痕，不仅影响美观，且对患者的心理及社交也带来较大影响，已成为一种不可忽视的身心疾病。传统的中医药依据患者皮损情况辨证施治^［4］，通过内服、外治法治疗痤疮自古以来应用广泛，在治疗痤疮方面有着独特的优势^［5］。

复方黄栀连颗粒是由我院治疗痤疮的临床经验方发展而来，在我院已有20余年使用经验，由黄柏、黄芩、栀子、连翘、夏枯草、荆芥穗等16味中药组成，具有清热解毒、疏风祛湿、活血消痈等功效，治疗肺经风热证及湿热蕴结证之痤疮取得了较好的效果^［6-7］。该制剂原使用剂型为汤剂，一方面，中药煎煮费时且不易携带，影响患者的依从性；另一方面，煎煮不当或储存不当可能会影响临床疗效，故拟将其开发成颗粒剂，具有可直接冲服、携带方便、患者依从性好等优点^［8-9］。本研究通过单因素实验确定了各因素水平，再用L₉（3⁴）正交试验优化复方黄栀连颗粒的提取工艺，为该制剂的进一步研究和临床使用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2040C Plus型高效液相色谱仪、AUW220D型电子天平（d=0.1 mg，d=0.01 mg）均购自日本岛津公司；GR-120型电子天平（d=0.1 mg，日本A&D公司）；DHP-9162型电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；KQ2200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号110715-202122，中国食品药品检定研究院）；乙腈和甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；水为纯化水。

复方黄栀连颗粒处方中黄柏、黄芩、栀子、连翘等16味中药均购于东莞国药集团药材有限公司，经专家鉴别符合《中华人民共和国药典》规定的标准。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含量的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Shim-pack Scepter HD-C18-80（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为1 mL·L^-1磷酸（A）-甲醇（B）^［10-11］，梯度洗脱时间程序见表1。流速为1.0 mL·min^-1；柱温为40 ℃；检测波长为283 nm；进样量为10 μL。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液

精密称取适量黄芩苷对照品，加甲醇溶解，制成质量浓度为0.112 8 mg·mL^-1的溶液，微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液

精密吸取浓缩提取液1 mL，置于25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，放冷，甲醇定容至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2.3 阴性对照品溶液

按处方称取除黄芩外的阴性样品，制成浓缩液，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 专属性的考察

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱峰对应的位置上有相同的色谱峰，阴性对照品溶液在对应位置无此色谱峰，表明黄芩苷的测定未受其他成分的干扰，且分离度达到要求。

2.1.4 线性关系的考察

分别精密吸取黄芩苷对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，在2.1.1项下色谱条件下测定峰面积。以黄芩苷浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。回归方程为：y=30 220 843.063 5 x+2 109.939 0，r=0.999 9，结果表明黄芩苷质量浓度在0.011 28~0.090 24 mg·mL^-1范围内与其峰面积线性关系良好。

2.1.5 精密度实验

精密吸取同一份对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，以2.1.1项下色谱条件重复进样测定5次，记录色谱图，测得峰面积的RSD值为0. 71%，表明该仪器的精密度良好。

2.1.6 重复性实验

按照2.1.2.2项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以2.1.1项下色谱条件进样测定6次，黄芩苷含量测定结果RSD值为0.32%，表明该方法的重复性良好。

2.1.7 稳定性实验

取同一份供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样1次，以峰面积的相对标准偏差反映样品的稳定性，计算得RSD值为0.98%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率实验

精密吸取已知含量为2.959 8 mg·g^-1的供试品溶液1.0 mL，共6份，精密加入对照品溶液（质量浓度为1.968 6 mg·mL^-1） 1.0 mL，按照2.1.1项下色谱条件测定峰面积，计算加样回收率。计算得平均加样回收率为99.91%，RSD值为0.97%，表明该方法的回收率良好。

2.2 单因素实验

2.2.1 加水量

称取处方中药材5份，每份165 g，药材浸泡1 h，分别加入8、10、12、14、16倍量水，按照2.1.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1.1项下色谱条件下进样测定，结果见图2A。加水量增加时，黄芩苷的含量也随之增加，但加水量大于14倍时黄芩苷的含量呈现下降趋势，故选择12、14、16倍加水量做进一步考察。

2.2.2 提取时间

提取时间设定为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，其余同2.2.1项，结果见图2B。提取时间增加时，黄芩苷的含量也升高，但提取1.5 h后呈现下降趋势，故选择1.0、1.5、2.0 h做进一步考察。

2.2.3 提取次数

提取次数设定为1、2、3、4次，其余同2.2.1项，结果见图2C。提取次数增加时，黄芩苷的含量呈先升高后下降的趋势，提取4次与提取1次相比黄芩苷含量相当，为节约能耗、避免浪费，故选择1、2、3次做进一步考察。

2.3 干膏率的测定

将水煎提取液浓缩，定容至250 mL，精密吸取浓缩提取液25 mL。置于干燥至恒质量的蒸发皿中，于60 ℃蒸干，再置于105 ℃干燥至恒定质量，冷却后迅速精密称定质量，计算干膏率^［12-13］。

2.4 正交试验

2.4.1 正交试验设计

用L₉（3⁴）正交试验，以提取时间（A）、加水量（B）、提取次数（C）为影响因素，以干膏率、黄芩苷含量为评价指标，用综合评分法^［14-15］进行评价，其权重系数分别为30%、70%，综合评分=干膏率/干膏率最大值×30%×100+黄芩苷含量/黄芩苷含量最大值×70%×100。因素水平见表2，正交试验结果及方差分析结果见表3和表4。

2.4.2 正交试验结果与方差分析

从表3中R值可知，提取工艺受各因素的影响程度依次为：C>A>B，即提取次数>提取时间>加水量，方差分析结果显示提取次数对提取工艺有显著影响（P<0.05），而加水量、提取时间无显著影响（P>0.05）。直观分析各因素最佳水平组合为C₃A₃B₃，即加16倍水，提取3次，每次2 h，从省时、节能降耗角度考虑，结合正交试验和方差分析结果，确定提取方案为C₃A₁B₁，即加12倍量水，提取3次，每次1 h。

2.4.3 验证实验

按照优化工艺进行验证实验，平行3次，结果见表5，各指标的RSD值均小于3%，表明该提取工艺稳定可靠。

3 讨论

复方黄栀连颗粒是我院专家因地制宜，结合岭南地区气候及南方地区痤疮病因病机拟定的临床经验方，适用于肺经风热证及湿热蕴结证的痤疮的治疗，在临床上取得了较好的疗效^［16］。

该方以汤剂在临床使用，方中黄柏、黄芩、栀子等药材所含的活性成分均溶于水，因此沿用了水煎煮的提取工艺，以确保组方中有效成分得到充分利用。但加水量、提取时间及提取次数等因素均可影响活性成分的提取效率，干膏率是衡量中药复方制剂水提工艺的质控指标，干膏率的变化会影响有效成分的转移率，并最终影响药物的临床疗效。黄芩为方中君药之一，具有清热燥湿、泻火解毒等功效^［17］，其主要活性成分黄芩苷具有较强的抗炎活性^［18-19］及抗痤疮丙酸杆菌的作用^［20-21］，在本方中发挥清肺热的作用。选取干膏率及黄芩苷含量作为本研究的评价指标，可以更全面地反映提取工艺的合理性。

方法学考察关系到实验数据的可靠性，由于复方黄栀连颗粒是由16味中药组成的复方制剂，成分复杂。曾考察乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1 mL·L^-1磷酸等多个流动相，但分离度均不理想，最终采用甲醇-1 mL·L^-1磷酸为流动相进行梯度洗脱，色谱峰峰形及分离度均符合要求。

正交试验常用于优化生产工艺，本研究采用L₉（3⁴）正交试验确定了复方黄栀连颗粒的提取工艺，方差分析及验证实验结果显示，优化的提取工艺便于操作，稳定可靠、重复性好，可用于复方黄栀连颗粒的研制。

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基金资助

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