灯盏花乙素Soluplus/TPGS混合胶束的制备及评价

Preparation and evaluation of scutellarin Soluplus/TPGS mixed micelles

摘要

目的 采用Box-Behnken响应面法优化灯盏花乙素Soluplus/TPGS混合胶束（Scu-MMs）的制备工艺，考察其体外释放行为，并通过Caco-2单层细胞转运实验评价其渗透性。 方法 以Soluplus和TPGS作为载体材料，采用薄膜分散法制备Scu-MMs，以包封率为评价指标，采用响应面法优化并得到Scu-MMs的最优工艺条件；采用马尔文粒度仪和透射电镜对Scu-MMs进行表征；用透析袋研究Scu-MMs的体外释放度；用Caco-2单层细胞转运实验比较Scu原料药和Scu-MMs的渗透性。 结果 Scu-MMs的最优工艺条件：Soluplus与TPGS的比值为8.3∶1、载体与Scu的比值为20.9∶1，水化体积为16.4 mL，Scu的平均包封率为91.45%。Scu-MMs的平均粒径为（19.45±0.05） nm，平均电位为（-7.95±0.72） mV；透射电镜下观察到Scu-MMs呈均匀分散的球形分布；Scu-MMs在3种不同pH介质中释放速率均先快后慢，累积释放度在pH 4.5介质中最高；Scu-MMs在Caco-2单层细胞的渗透性显著高于Scu原料药。 结论 制备成的Scu-MMs粒径小，可明显提高药物渗透性，为后续药物的开发奠定基础。

Abstract

Objective The preparation process of scutellarin Soluplus/TPGS mixed micelles （Scu-MMs） was optimized by Box-Behnken response surface method. The release behavior was investigated in vitro， and the permeability was evaluated by Caco-2 single-layer cell transport experiment. Methods Soluplus and TPGS were used as carrier materials to prepare Scu-MMs by using thin film dispersion method. The encapsulation rate was used as evaluation index， and the optimal process conditions of Scu-MMs were optimized by response surface method. The Scu-MMs was characterized by Malvern particle size analyzer and transmission electron microscopy. The release of Scu-MMs in vitro was studied with dialysis bag. The permeability of Scu raw material and Scu-MMS was compared by Caco-2 monolayer cell transport assay. Results The optimal process conditions of Scu-MMs were obtained as follows： the ratio of Soluplus to TPGS was 8.3∶1， the ratio of carrier to Scu was 20.9∶1， the hydration volume was 16.4 mL， and the average entrapment rate of Scu was 91.45%. The average particle size of Scu-MMs was （19.45±0.05） nm and the average potential was （-‍7.95±0.72） mV. Uniformly dispersed spherical distribution of Scu-MMs was observed under transmission electron microscope. The release of Scu-MMs in 3 different pH media was first fast and then slow down， and the cumulative release rate was highest in the pH 4.5 medium. The permeability of Scu-MMs in Caco-2 monolayer cells was significantly higher than that of Scu raw material. Conclusion The prepared Scu-MMs has a small particle size， which can significantly improve the drug permeability and lay an experimental foundation for the development of subsequent drugs.

Graphical abstract

关键词

灯盏花乙素 / 混合胶束 / 响应面法 / Soluplus/TPGS / 渗透性

Key words

scutellarin / mixed micelle / response surface method / Soluplus/TPGS / permeability

灯盏花乙素（scutellarin，Scu）是从菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapu （Vant.） Hand-Mazz中提取的黄酮类有效成分^［1］，具有扩张血管、抗凝血、改善微循环等作用^［2-4］，临床上主要用于缺血性心脑血管病、脑出血所致后遗症等的治疗^［5］。Scu的水溶性和脂溶性均较差，口服给药几乎不吸收，生物利用度仅为0.40%^［6］。目前，Scu新制剂有磷脂复合物、脂质体、包合物、固体分散体等^［7-10］。

纳米胶束的粒径较小，能够提高难溶性药物的溶解性和生物利用度，且渗透性良好，得到越来越多研究者的关注。纳米胶束已从由一种辅料制备而成的单一胶束，发展到由多种辅料制备而成的混合胶束^［11］。Soluplus具有亲水性的PEG主链和疏水性的聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯侧链，临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）约为10^-8 mol·L^-1，当其浓度大于CMC值时，会自组装形成胶束，将疏水性药物包裹于疏水性核心，显著提高难溶性药物的溶解性^［12］。Soluplus结构中的羰基能够与药物分子中的羟基形成氢键，从而增强胶束的稳定性^［13］。聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（d-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）是具有代表性的两亲性维生素E琥珀酸酯衍生物，是一种非离子型表面活性剂，可增加难溶性药物的水溶性^［14-15］。同时，TPGS也是一种P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）抑制剂，能够促进药物的吸收。

本实验选用Soluplus和TPGS作为载体材料，采用薄膜分散法制备Scu-Soluplus/TPGS混合胶束（Scu-MMs），并对其包封率、电位、粒径、形态、体外释放行为和渗透性等进行考察，以期为Scu新制剂的研发奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；ML304T 102型分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；JEM-1200 EX型透射电子显微镜（日本JEOL公司）；Axiovert 40 CFC型倒置荧光显微镜（德国Zeiss公司）；RE-52 AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Malvern Zetasizer Nano-ZS型激光粒度仪（英国Marvern Instruments公司）；Herocell 240型CO₂培养箱（上海润度生物科技有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

Scu对照品（质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；Soluplus（德国BASF公司）；维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（d-‍α‍-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS，美国MCE公司）；甲醇（色谱纯，美国天地有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 Scu-MMs的制备

采用薄膜分散法制备Scu-MMs。按照处方比值称取一定量Soluplus和TPGS，溶解于三氯甲烷，再按比值称取Scu溶解于甲醇中，将上述2种溶液置于茄形瓶中混合，60 ℃减压旋转蒸发除去有机溶剂并形成一层均匀透明的药膜。加入蒸馏水水化2 h，超声20 min （功率为300 W），以8 000 r·min^-1离心15 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得Scu-MMs。同法制备不含Scu的空白胶束（Soluplus/TPGS）。

2.2 Scu含量的测定

2.2.1 色谱条件

ZORBAX Extend C₁₈ （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-体积分数0.1%磷酸水溶液（43∶67），进样体积为20 μL，流速为1.0 mL·min^-1，柱温为30 ℃，检测波长为290 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取Scu对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg Scu的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 Scu-MMs供试品溶液的制备

取Scu-MMs混悬液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇超声破坏胶束结构，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 线性关系考察

分别吸取对照品溶液5、10、15、20、25 μL进样，以Scu对照品含量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。

2.2.5 包封率测定

取Scu-MMs混悬液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇超声破坏胶束结构，过0.45 μm微孔滤膜后，按照“2.2.1”项下色谱条件进行检测。根据公式计算包封率，平行测定3次，取平均值。包封率（EE）=（载入胶束的药物量/投药量）×100%。

2.3 Scu-MMs单因素筛选

2.3.1 Soluplus与TPGS比值考察

固定Scu投药量（10 mg），载体与药物的比值为10∶1，水化体积为4 mL。载体为Soluplus与TPGS不同比值的混合物，考察Soluplus与TPGS比值分别为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1时对Scu-MMs包封率的影响。

2.3.2 载体与Scu比值考察

固定Scu投药量（10 mg），水化体积为4 mL，Soluplus与TPGS的比值为8∶1，考察载体与Scu之间的比值分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1时对Scu-MMs包封率的影响。

2.3.3 水化体积考察

固定Scu投药量（10 mg），Soluplus与TPGS的比值为8∶1，载体与药物的比值为20∶1，考察水化体积为4、8、12、16、20 mL时对Scu-MMs包封率的影响。

2.4 Box-Behnken响应面法优化Scu-MMs的制备工艺

Soluplus与TPGS的比值、载体与Scu的比值和水化体积对Scu-MMs包封率的影响较大，根据单因素考察结果，各影响因素均选择低、中、高3个水平，以Scu-MMs包封率（y）为指标进行Box-Behnken响应面法实验设计。各因素水平见表1。

2.5 体外评价

2.5.1 Scu-MMs粒径和Zeta电位的测定

取Scu-MMs混悬液2 mL，置于5 mL离心管中，适当稀释后，用马尔文粒度仪检测混合胶束的粒径和Zeta电位。

2.5.2 透射电镜观察Scu-MMs的形态

取Scu-MMs混悬液滴加至铜网上，吸附10 min后用滤纸吸干，再用体积分数2%磷钨酸染色，置于红外线烤灯下烤干，置于透射电镜下观察Scu-MMs的形态并拍摄照片。

2.5.3 体外释放度研究

用膜透析袋法考察Scu-MMs的体外释放行为。以含体积分数1%吐温-80的人工胃液和人工肠液为释放介质。取Scu-MMs 2 mL转移到一端夹紧的透析袋中（截留相对分子质量为8 000~14 000），小心排除气泡后夹紧另外一端，分别以100 mL含体积分数1%吐温-80的pH 1.2的盐酸溶液、pH 4.5的醋酸盐缓冲液和pH 6.8的磷酸盐缓冲液作为释放介质，于37 ℃以100 r·min^-1在溶出仪中搅拌。分别于0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h取样2 mL，并补加等体积等温度的介质。经0.45 μm微孔滤膜滤过后取续滤液，采用HPLC法测定并计算累积释放度，绘制释放曲线。

2.6 Caco-2细胞转运研究

使用6孔Transwell板进行Caco-2细胞转运研究。处于对数生长期的Caco-2细胞悬液密度为2.5×10⁵个·mL^-1，向Transwell培养皿中的肠腔侧（apical，AP）加入细胞悬液1.5 mL，基底侧（basolateral，BL）加入2.5 mL DMEM完全培养基。接种后，将Transwell培养板置于培养箱中（37 ℃、相对湿度为95%、CO₂含量为5%）进行培养。培养期间，每2 d监测Transwell膜两侧的跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）值1次，当TEER值500 Ω·cm²时认为Caco-2细胞单层已形成，可用于后续转运实验^［16］。实验前用DMSO将Scu配制成5 mmol·L^-1储备液，实验时再以HBSS缓冲液稀释。从AP侧到BL侧的转运实验：将Scu溶液或Scu-MMs 1.5 mL加入AP侧，将2.5 mL新鲜的空白HBSS缓冲液加到BL侧；同样，从BL侧到AP侧的转运实验如下：BL侧加Scu溶液或Scu-MMs 2.5 mL，AP侧加空白HBSS缓冲液1.5 mL。置于恒温水浴摇床温育后，分别收集AP侧和BL侧的溶液，用HPLC法测定Scu含量。

3 结果

3.1 标准曲线的建立

以Scu含量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），得到回归方程y=3 938.4x-931.7 （R²=0.999），线性范围为5.1~25.5 μg。

3.2 单因素实验的结果

3.2.1 Soluplus与TPGS的比值

当Soluplus与TPGS的比值为2∶1~6∶1时，Scu-MMs的包封率随着Soluplus占比的增加而上升；当Soluplus与TPGS的比值为6∶1~10∶1时，Scu-MMs的包封率随着Soluplus占比的增加而下降。见表2。后续对Soluplus与TPGS比值区间（4∶1~8∶1）进行优化。

3.2.2 载体与Scu的比值

Scu-MMs包封率随载体与Scu比值的增大而上升。在考察范围内，当载体与Scu的比值大于20∶1时，包封率趋于平稳，基本保持不变。见表3。后续对载体与Scu比值区间（15∶1~25∶1）进行优化。

3.2.3 水化体积

Scu-MMs包封率随水化体积的增大而上升，当水化体积达到16 mL时，包封率达到最大值；随后随着水化体积的增大包封率降低。见表4。后续对水化体积（12~20 mL）进行优化。

3.3 Box-Behnken响应面法优化Scu-MMs的制备工艺

3.3.1 实验过程

通过单因素实验选取Soluplus与TPGS的比值、载体与Scu的比值和水化体积3个因素的3个水平（见表1），以包封率为考察指标，用Box-Behnken响应面法优化Scu-MMs的制备工艺。实验方案和结果见表5。用Design-Expert 8.0.6软件对表5中的数据进行多元线性回归拟合，二项式拟合方程如下：y=92.49+1.76x₁ +2.84x₂ +0.88x₃-0.34x₁x₂-0.12x₁x₃ +0.30x₂x₃-6.11x₁²-8.39x₂²-4.39x₃²。各因素回归系数和方差分析结果见表6。模型的F值为22.90（P0.001），表明该模型可靠性较高。R²=0.967 1，R_adj²=0.924 9，进一步表明该模型的拟合情况较好，可以准确预测包封率。失拟项P=0.053 0，差异无统计学意义。影响Scu包封率的主次因素是B（载体与Scu的比值）A（Soluplus与TPGS的比值）C（水化体积），而且因素A²、B²、C²对Scu包封率具有显著影响。Scu-MMs中Scu包封率的响应面3D图与等高线图见图1。

3.3.2 验证实验

经响应面法优化得到Scu-MMs的最优工艺条件：Soluplus与TPGS的比值为8.3∶1、载体与Scu的比值为20.9∶1，水化体积为16.4 mL。在此条件下进行3次平行实验，Scu-MMs中Scu的平均包封率为91.45%，理论预测值为92.89%，两者相对误差为1.57%，表明优化得到的工艺参数准确、可靠，对实验的操作具有指导意义。

3.4 Scu-MMs的评价

3.4.1 Scu-MMs的表征

Scu-MMs的平均粒径为（19.45±0.05） nm，PDI为0.24±0.02，平均电位值为 （-7.9±0.72） mV，见图2。Scu-MMs形态为规则的球形，粒径约为20 nm，与用粒度仪分析的结果一致，见图3。以上结果表明，采用响应面法优化得到的最佳工艺条件制备的Scu-MMs粒径较小、粒度分布范围较窄，是均一、稳定的分散体系。

3.4.2 体外药物释放度

Scu-MMs在pH4.5介质中的累积释放度最高，其次为pH1.2介质，最低的是pH6.8介质。Scu-MMs在3种介质中，前2 h的累积释放度达20%，随后释放速度呈减缓趋势，48 h内的累积释放度约为70%。见表7。

3.4.3 Caco-2单层细胞渗透性研究结果

Scu原料药从AP侧转运到BL侧，其P_{app（AP→BL）}为（2.65±0.21）×10^-6 cm·s^-1，从BL侧转运到AP侧，其P_{app（BL→AP）}为（10.53±0.98）×10^-6 cm·s^-1，表明Caco-2单层细胞对Scu有外排作用；Scu-MMs从AP侧转运到BL侧，其P_{app（AP→BL）}为（7.32±0.61）×10^-6 cm·s^-1，从BL侧转运到AP侧，其P_{app（BL→AP）}为（4.32±0.37）×10^-6 cm·s^-1，与Scu原料药比较，Scu-MMs在增加药物吸收的同时抑制药物外排。

4 讨论

Soluplus由体积分数13%聚乙二醇PEG6000、体积分数57%乙烯基己内酰胺和体积分数30%乙酸乙烯酯组成。其中，以亲水性的PEG6000作为主链，亲脂性的乙酸乙烯酯与乙烯基己内酰胺随机共聚作为侧链，是一类新型的两亲性非离子型表面活性剂。Soluplus不仅安全性高，而且具有增溶、助悬、易成膜、空间稳定等优点。Soluplus已应用于固体分散体、药物纳米晶体、聚合物胶束、过饱和自乳化给药系统的制备，能够提高难溶性药物的溶解度和生物利用度^［17-20］。TPGS是一种常用的药物递送系统辅料，可提高药物溶解度、生物利用度、稳定性、调节释药速率、改善药代动力学特性、降低药物不良反应^［21-22］。本研究以Soluplus/TPGS混合胶束为载体，制备Scu-MMs。经测定，Scu的包封率达到91.45%。Scu-MMs的粒径为19.45 nm，Zata电位为-7.95 mV；Scu-MMs呈粒径均匀的球形且不聚集，粒径大小与粒度仪分析的结果一致。Scu-MMs在3种不同pH值介质中的释放速率均先快后慢。Scu-MMs前期释药较快，可能是因为胶束表面或前表面的药物快速释放；后期释药减缓，可能是胶束内部的Scu需要经过Soluplus/TPGS降解后才可以释放，所以出现释药速度减缓的情况。

P-gP能够上调细胞外排转运体的表达并增强其功能，从而减少由外源性有害异物造成的伤害，对维持细胞内环境稳态有重要作用。小肠上皮细胞中含有丰富的P-gP，可能不利于药物的吸收^［23］。Caco-2细胞的形态和功能与人体小肠上皮层相似，且保留了P-gP高表达的特点，能够用来测定药物的跨膜转运^［24］。本研究结果表明，Caco-2单层细胞对Scu原料药具有很强的外排作用，影响了其吸收。TPGS是一种安全的非离子型表面活性剂，可以抑制P-gP的活性^［25］。因此，在Scu-MMs处方中加入了TPGS。渗透性实验结果表明，Scu-MMs能够在促进药物吸收的同时降低药物外排。根据本研究的结果可以初步判断采用Soluplus和TPGS制备的纳米混合胶束能够增加Scu的口服生物利用度。

本研究用薄膜分散法制备Scu-MMs，采用响应面法对Scu-MMs的制备工艺条件进行优化。根据优化条件制备的Scu-MMs包封率高、粒径均一，能很好地控制药物释放，而且显著提高药物渗透性，具有较好的应用前景。

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基金资助

南京市医学科技发展项目(QYK11148)