基于网络药理学和单细胞转录组探究灵芝蜂胶胶囊抗肝细胞癌的潜在机制

Potential mechanism of Ganoderma Lucidum Propolis Capsules against hepatocellular carcinoma based on network pharmacology and single cell transcriptome analysis

摘要

目的 采用网络药理学和单细胞转录组分析方法研究灵芝蜂胶胶囊抗肝细胞癌的潜在机制。 方法 利用TCMSP、本草组鉴（HERB）和SwissTargetPrediction数据平台，获得灵芝和蜂胶的活性成分及靶点。基于TCGA数据库获取肝癌RNA-seq数据，运用R软件包DESeq2进行差异分析，将差异基因与药物靶点的交集基因作为灵芝蜂胶胶囊抗肝细胞癌的潜在靶点基因。采用R软件包clusterProfilter进行GO和KEGG富集分析。利用Cox和KM方法对交集靶点进行筛选，再使用GEO数据库中的GSE14520进行生存分析再次筛选得到核心基因。利用分子对接进行核心靶点基因和对应成分的模拟结合。采用GSE149614数据对核心基因进行单细胞分析，并对关键基因在多种癌症中的生存预后进行分析。采用qPCR验证灵芝蜂胶对HepG2和Huh7细胞的干预作用。 结果 基于网络药理学成功鉴定出肝细胞癌差异基因706个，灵芝蜂胶潜在作用靶点603个，二者交集靶点29个。富集分析结果主要涉及神经活性配体-受体相互作用和细胞周期等。满足生存分析筛选的关键靶点为AURKB、CCNA2、CCNB1、CCR3、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK。分子对接结果表明这些关键基因与对应成分均具有良好的结合能力。qPCR结果显示灵芝蜂胶可显著抑制HepG2和Huh7细胞中AURKB基因的表达。 结论 灵芝蜂胶可能通过过氧麦角甾醇等成分作用于AURKB等基因参与细胞周期等过程发挥抗肝细胞癌的作用，为进一步研究提供思路和参考。

Abstract

Objective To investigate the potential mechanism of Ganoderma Lucidum Propolis （GLP） Capsules against hepatocellular carcinoma （HCC） by using network pharmacology and single cell transcriptome analysis. Methods The targets of GLP were obtained by TCMSP， HERB and SwissTargetPrediction data platforms. The liver cancer RNA-seq data were obtained from TCGA database， and the R software package DESeq2 was used for differential analysis. The intersection genes of the significant fold change genes and the drug target genes were used as potential target genes. GO and KEGG enrichment analyses were performed by the R package clusterProfilter. The Cox and KM methods were used to screen the intersection targets， and then GSE14520 in the GEO database was used for survival analysis to screen the core genes again. Molecular docking was used to simulate the combination of genes and their corresponding components. Single cell analysis of key genes was performed by using GSE149614 data. And the survival prognosis of the key genes was analyzed in multiple cancers. quantitative polymerase chain reaction （qPCR） was used to verify the intervention effect of GLP Capsules on HepG2 and Huh7 cells. Results Totally 706 HCC differential genes were successfully identified， 603 were identified as potential targets of GLP， and 29 were identified as intersection targets. Enrichment analysis results mainly involved neuroactive ligand-receptor interaction and cell cycle. The key targets that met the survival analysis screening were AURKB， CCNA2， CCNB1， CCR3， CDK1， PLK1， TOP2A and TTK. Molecular docking showed that these key genes had good binding ability with their corresponding components. qPCR further verified that GLP significantly inhibited the expression of AURKB gene in HepG2 and Huh7 cells. Conclusion GLP may exert anti-HCC by acting on AURKB and other genes involved in cell cycle processes mainly through peroxyergosterol and other components， providing ideas and references for further research.

Graphical abstract

关键词

灵芝蜂胶胶囊 / 肝细胞癌 / 网络药理学 / 单细胞转录组 / 分子对接

Key words

Ganoderma Lucidum Propolis Capsules / hepatocellular carcinoma / network pharmacology / single-cell transcriptome / molecular docking

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）的90%，也是世界第三大致死性恶性肿瘤^［1］。在中国，肝癌在所有癌症中的发病率居第5位，死亡率居第2位^［2］。目前，HCC的治疗方式主要有手术切除肿瘤、肝脏移植、放疗等。但由于存在手术难度大、肝源不足、复发概率高和预后差等问题^［3］，故使用非手术方法治疗中晚期肝癌是一种重要的补充手段^［4］。临床上用化疗治疗肝癌有严重不良反应与耐药性，而中药具有低毒性的优势，已成为癌症治疗的研究热点。因此，中药已经成为抗肿瘤新药研发的新方向，是系统性治疗HCC的重要组成部分^［5］。灵芝作为一种重要的药食两用真菌，其具有抗肿瘤、降血糖、调节免疫、抗肝损伤的作用^［6］。蜂胶是一种由蜜蜂从树脂等天然物质中采集和加工而成的胶状物质。其含有树脂、蜂蜡和黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、抑菌和抗病毒等生物学活性^［7］。相关研究发现，灵芝多糖通过调控PI3K/Akt信号通路抑制Huh7的增殖和迁移，蜂胶黄酮则能抑制HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡^［8-9］。由于HepG2和Huh7细胞系均来源于人类肝癌组织，具有与体内肝细胞癌相似的特征，能够较好地模拟肝细胞癌的发展过程，故HepG2和Huh7常被用于药物代谢的相关研究。目前已有多种灵芝和蜂胶的复合产品用于高血糖和高血脂的治疗，但对其抗HCC作用的研究较少^［10-11］。本研究以灵芝-蜂胶为切入点，探究其抗HCC的潜在作用，为后续用灵芝蜂胶胶囊治疗HCC提供理论基础。

1 材料

1.1 试药

灵芝蜂胶提取物（安徽金寨仙芝灵生物科技有限公司）；总RNA小量抽提试剂盒（广州美基生物科技有限公司）；BioRT Master HiSensi cDNA First Strand Synthesis kit（杭州博日科技股份有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix（上海联迈生物工程有限公司）。

1.2 细胞系

HepG2和Huh7细胞株均购自美国典型培养物库（American type culture collection，ATCC）。

2 方法

2.1 灵芝、蜂胶成分的获取与靶点预测

灵芝蜂胶胶囊的主要成分为灵芝和蜂胶，以“灵芝”为关键词利用TCMSP^［12］（https：//tcmsp.php）进行检索以获取其活性成分。筛选条件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18。再用Swiss Target Prediction数据平台（http：//swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测。由于TCMSP截至本研究进行时未收录蜂胶，故从本草组鉴（HERB）^［13］（http：//herb.ac.cn/）平台获得药物靶点，将从2个数据库检索得到的结果取并集得到药物成分总靶点。

2.2 肝细胞癌数据下载与差异分析

从TCGA数据库中下载肝细胞癌数据集，再使用DESeq2包进行差异分析，差异基因的筛选条件为|Log₂FC|3且校正后P0.05。差异分析的结果以火山图的形式展示，差异基因与靶点基因的交集以Venn图的形式展示。

2.3 富集分析

使用R包clusterProfiler对交集靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。以P0.05为筛选标准，最终选择排名前10位的条目进行可视化。

2.4 生存分析

为了从交集靶点中筛选出更具价值的基因，在TCGA-LIHC数据集中，分别以这些基因的中位值分组，以Cox和KM 2种方法进行生存分析，随后用GEO芯片数据GSE14520，以最佳截断值分组进行KM生存分析，以筛选对HCC影响更稳定的基因。

2.5 单细胞分析

从GEO数据库中获取GSE149614数据集，在R中使用Seurat包进行单细胞分析。PC数设置为23，resolution值设置为0.5，质控标准为最小基因数500，最大基因数为4 000，线粒体基因百分比15，红细胞百分比0.1。采取手动注释方法，参考CellMarker^［14］网站（http：//xteam.xbio.top/CellMarker/）的信息进行注释，所用细胞标志物见表1。

2.6 分子对接

从PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取药物分子的3D结构（该数据库中暂无CCNA2对应成分ganosporelactone B的3D结构），将核心基因与对应成分在CB-Dock2^［15］（https：//cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php）中进行分子对接。

2.7 泛癌生存分析

单细胞分析结果显示，AURKB、CCNA2、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK不仅在肝癌细胞中显著表达，也在巨噬细胞和T细胞中显著表达，表明它们可能会通过影响免疫细胞来影响其他癌症。通过泛癌分析以拓展本研究的成果，为其他研究提供参考。使用基因集癌症分析数据库（Gene Set Cancer Analusis，GSCA^［16］，http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/）对基因进行泛癌的生存预后分析。

2.8 细胞培养与处理

将HepG2与Huh7接种于含体积分数10%胎牛血清（fetal Bovine Serum，FBS）和体积分数1%双抗的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂的细胞培养箱中培养，隔天换液，胰酶消化，常规传代，取对数生长期细胞进行实验。根据前期研究结果，将灵芝-蜂胶提取物用含体积分数0.1%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM培养基配置成质量浓度分别为200、400、800 μg·mL^-1的混悬液，分别作为低、中、高给药质量浓度，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。

2.9 实时荧光定量PCR

取处于对数生长期的HepG2和Huh7，用不同质量浓度的灵芝-蜂胶提取物处理，置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24 h。收集细胞，按照总RNA提取试剂盒说明书中的步骤提取细胞RNA，使用BioRT Master HiSensi cDNA First Strand Synthesis kit和SYBR Green PCR Master Mix进行逆转录反应和qPCR，以GAPDH作为内参，采用2^-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量，AURKB引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：5’‍-CAGTGGGACACCCGACATC-3’，5’‍-GTACA-CGTTTCCAAACTTGCC-3’。

2.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 10.0统计软件对数据进行处理。实验数据以（\overline{x}\pm s）表示，组间数据差异分析采用t检验（2组）和One-Way ANOVA（2组以上）。P0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 灵芝-蜂胶成分的获取

从TCMSP数据库中筛选出灵芝活性成分61个（筛选条件OB≥30%，DL≥0.18），见表2。蜂胶未被TCMSP收录，直接从HERB中获取靶点。

3.2 差异基因和靶点基因交集的获取

在R中使用DESeq2进行差异分析，获取706个差异基因（见图1A），通过SwissTargetPrediction和HERB数据库获得灵芝-蜂胶潜在治疗靶点603个。随后，通过分析肝细胞癌差异基因和灵芝-蜂胶靶点基因交集获得29个灵芝-蜂胶抗肝癌的潜在靶点。见图1B。

3.3 GO和KEGG富集分析

GO富集分析结果表明，AURKB、CCNA2、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A、TTK主要涉及有丝分裂细胞周期阶段转换等生物学功能，染色质区域等细胞组分以及神经递质受体活性等分子功能（‍见‍图‍2A）。KEGG信号道路富集分析结果表明，ADRA1A、ADRA2C、TOP2A、TTK等29个交集靶点主要参与神经配体-受体相互作用等多种通路（见图2B）。

3.4 生存分析

对29个交集靶点进行生存分析的筛选，得到满足条件的8个基因（AURKB、CCNA2、CCNB1、CCR3、CDK1、PLK1、TOP2A、TTK）。8个基因在GSE14520数据集中的生存曲线见图3。

3.5 单细胞分析

单细胞分析结果显示，AURKB、CCNA2、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK不仅在肝癌中表达，在巨噬细胞和T细胞中也有表达，表明它们可能会通过影响免疫细胞来影响其他癌症。见图4。

3.6 分子对接

本研究发现核心靶点基因是AURKB、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK，根据2.1的数据选择这些靶点对应的成分，把AURKB等核心靶点基因与对应成分进行分子对接。结果显示，它们具有良好的结合能力。见表3、图5。

3.7 泛癌生存分析

对AURKB等7个关键基因在肾上腺皮质癌等33种癌症中的无病生存期（disease free interval，DFI），疾病特异性生存期（disease-specific survival，DSS），总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）进行泛癌生存分析，结果显示AURKB等关键基因会显著影响肾上腺皮质癌等多种癌症患者的生存情况。

3.8 qPCR验证灵芝蜂胶对HCC细胞系AURKB表达的影响

qPCR结果显示，200、400、800 μg·mL^－1的灵芝-蜂胶提取物均能显著抑制HepG2和HUH7细胞中AURKB mRNA的表达。见图7。

4 讨论

肝癌是全球癌症相关死亡的第三大致死原因，其发病率呈持续上升趋势^［17］，严重威胁人类健康。目前对于肝癌的治疗方法主要有外科治疗、介入治疗、放射治疗和系统治疗等^［18］，但仍存在一定局限性。因此从中药中发掘治疗肝癌的药物具有重大的现实意义。有研究发现，灵芝蜂胶胶囊中的主要成分灵芝和蜂胶具有抗肿瘤成分^［19］，表明灵芝蜂胶胶囊可能具有治疗肝癌的作用，但其作用机制尚未明确。

网络药理学被广泛应用于生物医药的研究中，是一种具有广阔前景且成本低的药物开发新方法^［20-21］，从多靶点与复杂疾病关系角度研制药物治疗更多疾病，有助于对抗具有强大生物网络的复杂系统性疾病，尤其在恶性肿瘤治疗药物研发领域应用得更为广泛。网络药理学适合用于揭示像中药复方这样的成分复杂的药物治疗疾病的机制^［22］。微阵列和高通量测序技术提供了一种高效的工具来探索疾病的关键遗传或表观遗传变化，以识别可应用于疾病诊断、治疗和预后判断的生物标志物^［23-25］，在肿瘤领域应用日益广泛。

本研究取灵芝-蜂胶成分作用靶点与肝细胞癌差异基因的交集，并对其进行富集分析，结果表明，灵芝蜂胶主要通过影响神经活性配体-受体相互作用等途径发挥抗肝细胞癌的作用，随后在2个肝细胞癌测序数据集中进行生存分析筛选得到CCNA2、CCNB1、CCR3、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK等关键基因。分子对接模拟了过氧麦角甾醇、啤酒甾醇、灵芝甾酮和灵芝醇A等物质与AURKB、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK分子作用的机制。结果表明，AURKB、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK的分子对接的结合能均小于-7 kcal·mol^-1，表明灵芝-蜂胶中的单体成分过氧麦角甾醇、啤酒甾醇等能够与肝癌靶点有效结合。此外，单细胞分析结果显示，AURKB、CCNB1、CDK1、PLK1、TOP2A和TTK这些基因在细胞间的表达分布上存在明显的选择性，且它们分布趋势是较为一致的，此现象未见报道，可能潜藏着有待探索的复杂机制。由于这些基因在巨噬细胞和T细胞中显著表达，因此也有可能影响其他癌症。生存预后分析结果表明，这些关键基因在肾上腺皮质癌中的DSS期、OS期和PFS期和在肾乳头状细胞癌中的DSS期、OS期存在明显表达差异，表明AURKB等关键基因的研究价值。这些结果为进一步研究灵芝与蜂胶的作用提供了理论依据，有助于阐明灵芝蜂胶胶囊抗HCC的机制。

AURKB基因是编码Aurora激酶B的基因。这一基因编码的蛋白质是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞分裂的关键调节因子之一。AURKB被认为是许多癌症和肿瘤细胞系中异常表达的基因。近年的研究发现AURKB在HCC中的表达高于对照组，并且AURKB的表达与HCC患者的肿瘤分期显著相关。AURKB参与HCC细胞周期、DNA复制、p53信号通路和卵母细胞减数分裂。AURKB的过表达是预测肿瘤侵袭性和HCC预后不良的独立分子标志物，可作为HCC的潜在预后标志物^［26-27］。对AURKB基因的研究有助于理解细胞分裂机制、肿瘤生物学以及开发相关的治疗方法。因此，为了验证灵芝-蜂胶作用于筛选的基因从而抑制HCC，选择AURKB基因作为前期实验对象。qPCR结果显示，灵芝蜂胶显著抑制经典HCC细胞系HepG2和Huh7细胞中AURKB基因的表达，表明灵芝-蜂胶可能通过抑制AURKB基因，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，从而改善HCC。

综上所述，本研究利用网络药理学和单细胞数据分析探讨了灵芝蜂胶胶囊抗HCC的潜在机制，通过多种方法研究发现，灵芝蜂胶胶囊可能是作用于AURKB等基因，调节p53信号等通路，影响巨噬细胞和T细胞发挥抗癌作用，为临床治疗肝细胞癌和其他癌症提供新的思路。由于数据库的局限性及各软件平台的功能差异，以上结果未来仍需进一步实验验证。

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基金资助

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