姜黄素通过心肌血红素加氧酶1基因干预铁死亡和自噬抗心力衰竭的机制

Mechanism of curcumin intervening in iron death and autophagy against heart failure through HMOX-1 gene

摘要

目的 基于心肌血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HMOX-1）基因探讨姜黄素（curcumin，Cur）对心力衰竭（heart failure，HF）大鼠心肌的保护作用。 方法 纳入48只SD大鼠，随机选取8只大鼠作为对照组，其余大鼠进行腹主动脉缩窄手术。建模成功后，将大鼠随机分为HF组、Cur组、载体病毒（sh-NC）组、Hmox1基因敲减病毒（sh-Hmox1）组及Cur+sh-Hmox1组，每组8只。sh-NC组、sh-Hmox1组分别心肌定点注射sh-NC、sh-Hmox1-腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），4周后与对照组、HF组共同灌胃蒸馏水，Cur组予以400 mg·kg^-1灌胃，均每日1次，连续灌胃8周。用超声心动图和苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin，HE）分别评估心功能及心肌组织病理形态；比色法检测血清铁水平；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）测定血清脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、铁蛋白水平、心肌组织活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察自噬体、线粒体的微观结构；Western blotting检测铁死亡相关标志物［溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）］和自噬相关标志物（LC3Ⅱ、Beclin1、p62）蛋白的表达。 结果 与对照组比较，HF组大鼠的血清铁、铁蛋白、BNP水平、心肌组织中的SOD活性和SLC7A11、GPX4、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达均显著降低，ROS水平和p62蛋白表达均显著升高（P0.01）；心肌细胞肥大伴炎性细胞浸润；TEM显示线粒体肿胀减轻、自噬小体增加；在HF组中，Cur给药逆转了上述指标的变化趋势（P0.05）；sh-Hmox1注射后，抑制了Cur对HF组上述指标的改善作用（P0.05）。 结论 Cur可通过上调HMOX-1基因表达抑制铁死亡指标的表达水平，促进自噬，减轻心肌氧化应激，缓解HF大鼠的心肌损伤。

Abstract

Objective This study examines the protective effects of curcumin （Cur） on the myocardium of rats with heart failure， focusing on the heme oxygenase-1 （HMOX-1） gene. Methods In this study， a total of 48 Sprague-Dawley （SD） rats were utilized. Initially， 8 rats were randomly selected to serve as the control group， while the remaining rats underwent abdominal aortic coarctation to establish a model for the experiment. Following successful modeling， the rats were randomly assigned to 5 groups： The heart failure （HF） group， the Cur group， the vector virus （sh-NC） group， the Hmox1 gene knockdown virus （sh-Hmox1） group， and the Cur+sh-Hmox1 group， with each group comprising 8 rats. The sh-NC and sh-Hmox1 groups received injections of sh-NC and sh-HMOX1-adeno-associated virus （AAV）， respectively. After a period of 4 weeks， rats in the sh-NC and sh-Hmox1 groups were administered distilled water via gavage once daily， while those in the Cur group received curcumin at a dosage of 400 mg·kg^-1 by gavage once daily. This intragastric administration continued for 8 weeks. To assess cardiac function and the pathological morphology of myocardial tissue， echocardiography and hematoxylin-eosin （HE） staining were employed. Serum iron levels were determined using colorimetry. Additionally， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was utilized to measure serum brain natriuretic peptide （BNP）， ferritin levels， reactive oxygen species （ROS） levels， and superoxide dismutase （SOD） activity in myocardial tissue. Transmission electron microscopy （TEM） was employed to observe the microstructure of autophagosomes and mitochondria. Furthermore， Western blotting analysis was conducted to examine the expression of 7 iron death-related markers， including solute carrier family members 11 and 7 （SLC7A11）， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， as well as autophagy-related markers such as LC3Ⅱ， Beclin1， and p62 protein expression. Results In comparison to the control group， the HF group exhibited significant reductions in serum iron， ferritin， and BNP levels， as well as decreased SOD activity and diminished expressions of SLC7A11， GPX4， LC3Ⅱ， and Beclin1 proteins in myocardial tissue （P0.01）. Additionally， there were notable increases in ROS levels and p62 protein expression. Morphological changes included cardiomyocyte hypertrophy accompanied by inflammatory cell infiltration， and transmission electron microscopy （TEM） revealed decreased mitochondrial swelling and an increase in autophagosomes. The administration of Cur in the HF group effectively reversed these alterations in the aforementioned indicators （P0.05）. However， the injection of sh-Hmox1 inhibited the ameliorative effects of Cur on these parameters in the HF group （P0.05）. Conclusion Cur can inhibit the expression of the ferroptosis-associated genes by upregulating HMOX-1 gene expression， promoting autophagy， reducing myocardial oxidative stress， and alleviating myocardial damage in HF rats.

Graphical abstract

关键词

心力衰竭 / 姜黄素 / 血红素加氧酶1基因 / 铁死亡 / 自噬

Key words

heart failure / curcumin / heme oxygenase / ferroptosis / autophagy

心力衰竭（heart failure，HF）是一种复杂的临床综合征，由多种心血管异常引起，包括高血压、心肌缺血、心律失常和其他心血管疾病，最终导致心功能障碍状态^［1］。铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡形式，以细胞内有毒脂质过氧化产物蓄积，触发线粒体形态改变及氧化损伤为特征^［2］。

研究发现，上调血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）基因可以减轻氧化应激和炎症反应，从而通过拮抗铁死亡途径减轻组织损伤并阻碍疾病进展^［3］。此外，HMOX1基因的局部过表达已被证实可以通过促进亚铁离子的释放和增加活性氧的积累来缓解氧化应激^［4］。研究发现，铁死亡在心肌梗死、缺血再灌注损伤、肿瘤及肾脏损伤中发挥着重要作用^［5］。铁死亡有望成为治疗HF和改善预后的关键靶点之一。自噬作为一种维持细胞稳态的自我保护机制，在HF心肌细胞损伤的过程中，细胞利用溶酶体通过自噬机制降解细胞内物质，如受损的细胞器、多余的蛋白质、病原体和炎症因子，从而促进细胞保护和细胞器的更新^［6］。HF心肌细胞中强烈的炎症反应与自噬水平不平衡会导致更严重的器官组织损伤。通过促进心肌细胞自噬，可以减轻因炎症损伤导致的心肌功能障碍^［7］。NANDI S S等^［8］的研究发现，在HF患者中自噬处于被抑制的状态。ZHENG T等^［9］研究发现，通过Nfe2l2正向调控HMOX-1表达减轻细胞铁死亡和炎症反应，可缓解脑缺血病情。目前尚无关于上调HMOX-1表达在HF中对心肌细胞铁死亡及自噬作用的报道。

姜黄素（curcumin，Cur）是一种黄色、粉状、有生物活性的多酚，主要来自于姜黄属植物的根茎^［10］，具有抗凋亡、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用^［11］。近年来，多项研究结果表明，Cur对于多种疾病，尤其是心血管疾病具有潜在的治疗作用^［12］。本实验从心肌铁死亡与自噬角度，阐释Cur对HF大鼠心肌损伤的保护作用和机制，旨在为其临床应用奠定理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

多普勒超声诊断仪（飞依诺科技股份有限公司）；KHYL-00010型石蜡包埋机、KH-Q350型石蜡切片机均购自湖北泉林医疗设备有限公司；Agilent电泳仪（上海伯豪生物技术有限公司）；WG-JX3233PG型光学型显微镜（微谷光电仪器有限公司）；SH-Cute 523型化学发光凝胶成像系统（上海非利加实业有限公司）。

1.2 试药

姜黄素［生工生物工程（上海）股份有限公司］；Hmox1基因敲减腺相关病毒（sh-Hmox1-AAV）及其空载AAV（sh-NC-AAV）由珠海舒桐医疗科技有限公司合成；血清铁（Solarbio）、血清铁蛋白、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP），均购自南京金霖生物科技发展有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司；苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（昆明云科生物技术有限公司）；SLC7A11、GPX4、LC3Ⅱ、Beclin1、p62、GAPDH一抗均购自Proteintech。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠48只，8~12周龄，体质量为220~260 g，购自沧州市人民医院实验动物中心。饲养于受控环境（室温21~25 ℃，相对湿度40%~45%，每日12 h光暗循环）。实验操作经医院动物伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 动物分组和处理

随机抽取8只Sprague Dawley（SD）大鼠作为对照组，只分离腹主动脉，不结扎；剩余40只大鼠按照文献中的方法建模^［13］。本研究通过腹主动脉缩窄法制备心脏压力负荷超载HF模型，术后肌肉注射青霉素3 d防止感染，并将大鼠随机分为6组：对照组、HF组、Cur组、sh-NC组、sh-Hmox1组及Cur+sh-Hmox1组，每组8只。其中，sh-NC组、sh-Hmox1组分别于左心房内径（left atrial diameter，LAD）中心尖部局部多点注射sh-NC、sh-Hmox1-腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）（5个位点，每个位点5 μL）^［14］，4周后与对照组、HF组共同接受蒸馏水灌胃，Cur组每日灌胃给药200 mg·kg^-1，持续处理8周^［15-16］。末次灌胃2 h后，麻醉，进行超声心动图检测；留取血清；分离心肌组织，部分心肌组织以体积分数4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定进行病理检测，部分心肌组织于-80 ℃保存用于蛋白表达检测。

2.2 超声心动图检测

麻醉后，固定大鼠的四肢，去除心前区毛发，用二维超声心动图评估左心室的形态和表现，用M型超声心动图评估左心室的运动。所有手术均在标准化条件下进行，并利用在连续3个心脏周期内测量的每个参数的平均值来确定左心室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收缩末期容积（left ventricular end-systolic volume，LVESV）、射血分数（ejection fraction，EF）和左室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS），以评价左心室心脏收缩功能。

2.3 HE染色

心肌组织用体积分数4%的PFA固定，脱水，石蜡包埋，脱蜡，切片后脱水。然后用HE对组织进行染色，用光学显微镜观察心肌细胞损伤的程度。

2.4 血清铁水平检测

末次灌胃结束后，将大鼠麻醉后，腹主动脉取血，用亚铁嗪比色法测定血清铁水平。

2.5 ELISA

抽取大鼠腹主动脉血，按照ELISA试剂盒说明书检测血清BNP、铁蛋白水平；取每只大鼠质量为100 mg的心肌组织样品，匀浆，在预冷PBS中稀释至体积分数为10%，在4 ℃下以3 000 r·min^-1离心15 min。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测心肌组织中ROS的水平和SOD的活性。

2.6 透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察自噬小体、线粒体微结构

取心尖组织（0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm），用体积分数2.5%戊二醛固定，切片后用TEM观察自噬小体、线粒体的微结构。

2.7 Western blotting检测蛋白的表达情况

于细胞裂解液中添加体积分数1%蛋白酶抑制剂提取蛋白质，电泳、转膜后，与相应一抗在4 ℃下孵育过夜，然后与相应二抗在室温下孵育1 h，用ECL显影液进行曝光。以GAPDH为内参，测定靶蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析及绘图。计量资料以（\overline{x}\pms）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用One-Way ANOVA。P0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠心功能的比较

与对照组比较，HF组大鼠LVEDV、LVESV及血清BNP水平均显著升高，EF和LVFS均显著降低（P0.01）；Cur灌胃后逆转HF组上述指标的变化趋势（P0.05）；sh-Hmox1注射抑制了Cur对HF组大鼠上述指标的改善作用（P0.05）。见表1、图1。

3.2 各组大鼠心肌组织病理形态的比较

对照组大鼠心肌组织结构正常；HF组、sh-Hmox1组可见广泛心肌纤维紊乱甚至断裂（黑色箭头），炎症细胞浸润；Cur组较HF组、sh-Hmox1组小鼠心肌组织坏死程度明显减轻，炎症细胞浸润情况好转。见图2。

3.3 各组大鼠血清铁和铁蛋白水平的比较

HF组血清铁和铁蛋白水平均明显低于对照组（P0.01）；给予Cur后可上调HF组上述指标的表达水平（P0.05）；给予sh-Hmox1抑制Cur对HF组的血清铁和铁蛋白水平的提升作用（P0.05）。见表2。

3.4 各组大鼠心肌组织中ROS水平及SOD活性的比较

与对照组比较，HF组ROS水平显著升高，SOD活性明显降低（P0.01）；Cur灌胃后逆转HF组上述指标的表达趋势（P0.05）；Hmox1基因敲减后抑制Cur对心肌组织氧化应激指标的改善作用（P0.05）。见表3。

3.5 各组大鼠心肌自噬小体、线粒体微结构变化的比较

对照组线粒体排列正常，无肿胀或自噬小体；HF组和Cur+sh-Hmox1组心肌线粒体明显肿胀，偶有自噬小体存在（红色箭头）；与HF组比较，Cur组线粒体肿胀减轻，自噬小体增加。见图3。

3.6 各组大鼠心肌组织铁死亡指标蛋白表达情况的比较

HF组心肌组织中SLC7A11、GXP4蛋白的表达水平较对照组显著降低（P0.01）；Cur组上述指标的表达水平均升高（P0.05）；心内注射sh-Hmox1后抑制Cur对HF大鼠铁死亡指标的抑制作用（P0.05）。见表4、图4。

3.7 各组大鼠心肌组织自噬相关蛋白表达情况的比较

与对照组比较，HF大鼠心肌组织中LC3Ⅱ和Beclin1的表达水平显著降低，p62表达水平明显升高（P0.01）；给予Cur后可逆转HF组上述指标的变化趋势（P0.05）；敲减心肌Hmox1基因抑制Cur对HF大鼠自噬水平的增强作用（P0.05）。见图5、表5。

4 讨论

流行病学研究数据表明，全球成人HF的患病率为1%~3%^［17］。尽管HF的治疗策略已有所进展，但其病理生理机制仍未完全阐明，导致治疗效果欠佳。

铁是人体中广泛存在的微量元素，在氧转运、线粒体呼吸、核酸复制和修复、免疫反应和细胞信号转导等生理活动中发挥重要的作用。铁代谢是心肌能量代谢的重要组成部分^［18］。研究发现，HF患者同时表现出心脏线粒体铁超载^［19］和全身铁缺乏^［20］。此外，缺铁与HF患者死亡风险的升高有关^［21］。此外，心肌内铁过量可能诱导ROS的产生，从而损伤心肌组织和内皮功能。这一连锁反应可能加速HF的进展和恶化，并增加不良心血管预后的风险^［22］。最终，HF的特征是铁稳态失调及铁死亡，进而影响心脏疾病的发病机制和预后，这2种现象相互强化。因此，调节铁代谢和预防铁超载可能在治疗HF方面很有潜力。本研究的结果显示，HF大鼠的血清铁和铁蛋白水平下降，表明在疾病的进展过程中，铁稳态被破坏。此外，Cur的干预有效地恢复了铁蛋白的水平，并减少游离铁的积累。

在HF的进展过程中，多种细胞死亡模式共存，形成了一个复杂的调节网络。铁死亡是一种新发现的程序性细胞死亡途径，不同于细胞凋亡、自噬和焦亡，与慢性HF的发病有关。抑制铁死亡已被证明可以减轻心肌细胞肥大，改善心室扩张，减轻心肌炎症，增强心肌舒张功能^［23］。调节蛋白GPX4和SLC7A11是铁死亡过程中的关键调控因子，SLC7A11在胱氨酸和谷氨酸跨膜运输中发挥重要作用，促进细胞内胱氨酸向半胱氨酸的转化^［24］。半胱氨酸是GSH合成的重要前体，而GSH反过来激活GPX4。GPX4催化脂质过氧化物转化为无毒化合物，有效防止铁死亡^［25］。SLC7A11的表达下调阻碍了胱氨酸的吸收，导致GSH合成减少，氧化应激升高和铁超载导致细胞死亡^［26］。本研究结果显示，HF组心脏组织中SOD活性以及SLC7A11和GPX4蛋白的表达水平明显低于对照组。此外，HF组的ROS活性显著升高，表明铁通过氧化应激介导的细胞死亡在HF的进展中发挥了作用。Cur的干预显著增加HF大鼠的SOD活性以及SLC7A11和GXP4蛋白的表达水平，显著降低ROS水平，表明Cur可能通过抑制铁死亡来减轻氧化应激诱导的损伤。

本研究结果显示，Cur治疗后HF心肌自噬水平升高，这可通过自噬及相关指标蛋白的检测得到证明。现有研究结果表明，心肌细胞的自噬在维持血流动力学稳态和衰老稳态方面具有保护作用^［27］。此外，有研究发现，慢性HF与自噬水平降低相关，这表明增强自噬可能对心肌带来保护作用，而自噬水平降低可能加速HF的进展^［28］。WANG Z等^［29］研究表明，芹菜素在急性心肌梗死期间具有诱导心肌细胞自噬的能力，因此可能在心肌组织中起到保护作用。此外，淫羊藿苷^［30］、黄芩苷^［31］和银杏内酯B^［32］已被证明可以增强心肌细胞和成纤维细胞的自噬，从而抑制HF的发展。本研究通过观察自噬小体的数量和检测自噬相关蛋白的表达水平发现，Cur可以促进HF心肌组织的自噬，抑制HF小鼠心肌细胞铁死亡。因此，Cur有可能通过促进心肌自噬和减轻心肌细胞铁死亡来抑制HF的进展。

Hmox1基因编码一种催化血红素降解为胆绿素的酶，在细胞内铁死亡中发挥作用^［33］。其表达水平会在氧化应激和促炎因子的作用下上调，激活内源性抗氧化和抗炎作用^［34］。Hmox1基因的过表达已被证明能够抑制PI3K/Akt信号通路，并减轻炎症反应^［35］。然而，在HF中，其与心肌功能障碍的相关性尚未得到证实。在HF大鼠心内给予sh-Hmox1后，Cur对HF心肌组织细胞铁死亡的抑制作用和自噬的促进作用可能受到阻碍。这些结果表明，Cur对HF大鼠细胞铁死亡和自噬的调节作用可能与心肌Hmox1的激活有关。

在本研究中，采用动物超声多普勒来评估心功能，这是临床诊断HF的一个重要组成部分。然而，由于本实验仅在动物模型中检测了心肌炎症和心脏收缩功能，因此存在一定局限性。需要进一步研究Cur通过Hmox1调控HF大鼠铁死亡和自噬的分子机制，因此需要进一步使用心肌细胞进行实验。此外，本研究并没有研究自噬与Hmox1基因敲除后铁死亡途径中的关键靶蛋白之间的相关性。

综上所述，Cur通过增强心肌组织中的自噬、抑制心肌细胞铁死亡、改善铁代谢、减轻氧化应激等机制，显著减轻HF大鼠的心肌损伤，为治疗HF提供新的思路。

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基金资助

河北省2022年度医学科学研究课题计划项目(20220304)