七氟醚麻醉通过Nrf2/xCT信号通路损害胃癌大鼠认知功能的机制

Mechanism of sevoflurane anesthesia to impair cognitive function in gastric cancer rats through Nrf2/xCT signaling pathway

摘要

目的 探讨七氟醚（sevoflurane，SEV）麻醉是否通过调控铁死亡来影响胃癌大鼠的认知功能，并初步探讨潜在的信号途径。 方法 将Wistar大鼠随机分为Sham组（n=10）、模型组（n=11）、SEV低剂量组（L-SEV组）（n=10）、SEV中剂量组（M-SEV组）（n=10）和SEV高剂量组（H-SEV组）（n=11）。除Sham组外，其他各组通过肌氨酸乙酯亚硝胺、亚硝酸钠致癌剂灌服法来构建胃癌大鼠模型。采用Morris水迷宫测试评估大鼠的认知功能。分别采用苏木精伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP切口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法评估海马组织的病理损伤和神经元凋亡情况。用酶联免疫吸附试验检测海马组织中白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平。采用相应试剂盒检测海马组织中活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和铁离子水平。采用蛋白免疫印迹法检测海马组织中谷胱甘肽过氧化物酶4（recombinant glutathione peroxidase 4，GPX4）、核因子-红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和质子偶联二价金属离子转运蛋白成员2（solute carrier family 11 member 2，xCT）蛋白的表达水平。分别采用酶联免疫吸附试验和蛋白免疫印迹法检测炎症、氧化应激和铁死亡相关指标。 结果 Sham组大鼠的海马神经元轮廓清晰、结构紧凑，而模型组、L-SEV组、M-SEV组和H-SEV组的海马神经元形态出现一系列异常变化，包括轮廓模糊、结构松散、神经元凋亡，且M-SEV组和H-SEV组的异常变化更为严重。与Sham组比较，模型组、L-SEV组、M-SEV组和H-SEV组的逃避潜伏期明显延长，而目标象限停留时间、60 s内穿过平台的次数减少（P<0.05）；海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、ROS、MDA和铁离子水平均升高，GSH水平及GPX4、Nrf2和xCT蛋白表达水平均降低（P<0.05）；且M-SEV组和H-SEV组的改变更明显（P<0.05）。 结论 七氟醚麻醉通过诱导炎症、氧化应激和铁死亡导致胃癌大鼠术后认知功能损伤，其可能是通过调控Nrf2/xCT信号通路发挥作用的。

Abstract

Objective To investigate whether sevoflurane （SEV） anesthesia affects cognitive function in rats with gastric cancer by regulating ferroptosis and to preliminarily explore the potential signaling pathways. Methods Wistar rats were randomly divided into Sham group （n=10）， model group （n=11）， low-dose SEV （L-SEV） group （n=10）， medium-dose SEV （M-SEV） group （n=10）， and high-dose SEV （H-SEV） group （n=11）. Except for the Sham group， the other groups were employed to construct gastric cancer rat models by oral administration of sarcosine ethyl nitrosamine and sodium nitrite carcinogens. Morris water maze test was used to evaluate cognitive function. Hematoxylin-eosin staining （HE） and terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） method were used to evaluate the pathological injury and neuronal apoptosis of hippocampus tissue. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-‍α （TNF-‍α）， and interleukin-1β （IL-1β） in hippocampus tissue. The levels of reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） and iron ions in hippocampus tissue were detected by corresponding kits. Western blotting was used to detect the protein expression of recombinant glutathione peroxidase 4 （GPX4）， nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） and solute carrier family 11 member 2 （xCT） in hippocampus tissue. Results The hippocampal neurons in the Sham group had clear outline and compact structure， while the hippocampal neurons in the model group， L-SEV group， M-SEV group and H-SEV group showed a series of abnormal changes， including fuzzy outline， loose structure and neuron apoptosis， and the M-SEV group and H-SEV group were more serious. Compared with the sham group， the escape latency of the model group， L-SEV group， M-SEV group and L-SEV group significantly increased on the 3rd and 4th days， while the target quadrant residence time and the number of times they crossed the platform within 60 seconds decreased （P<0.05）； The levels of IL-6， TNF-‍α， IL-1β， ROS， MDA and iron were increased， while the levels of GSH and the protein expressions of GPX4， Nrf2 and xCT in hippocampus tissue were decreased （P<0.05）； Moreover， the above indexes changed more in M-SEV group and H-SEV group （P<0.05）. Conclusion Sevoflurane anesthesia leads to postoperative cognitive impairment in gastric cancer rats by inducing inflammation， oxidative stress and ferroptosis， which may be achieved by modulating the Nrf2/xCT pathway.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / 术后认知功能损伤 / 铁死亡 / Nrf2/xCT途径

Key words

gastric cancer / postoperative cognitive impairment / ferroptosis / Nrf2/xCT pathway

胃癌是一种常见疾病，其发病率在全球癌症中居第5位，是导致人类死亡的第3大原因^［1］。手术目前仍然是治疗胃癌的一线方法。然而，手术中的麻醉易引起术后认知功能障碍，进而影响患者的术后康复。目前临床尚缺乏防治术后认知功能障碍的有效措施。因此，研究麻醉剂对胃癌患者的影响对于改进治疗方法和减少术后认知功能障碍的发生具有重要意义。七氟醚是一种吸入麻醉剂，因其能够在不同的器官或系统中发挥作用，且具有不良反应小、起效快、麻醉效果好等优点，故被广泛用于临床实践^［2］。研究发现，七氟醚吸入麻醉参与胃癌根治术术后认知功能障碍的发生和进展^［3］，但相关机制尚未明确。铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡过程，通常伴随着铁聚集和脂质过氧化，与多种疾病的病理生理过程密切相关^［4］。已有研究证实，七氟醚通过诱导铁死亡介导神经毒性^［5］。本研究在既往研究的基础上进一步探讨七氟醚吸入麻醉对术后认知功能的影响是否涉及铁死亡，并探讨其可能的作用机制，以期为七氟醚吸入麻醉在胃癌手术中的应用提供数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YAN-MWMR型Morris水迷宫（上海玉研科学仪器有限公司）；CX23型光学显微镜（日本Olympus公司）；DM4000B型荧光显微镜（德国Leica公司）；ES-300型组织石蜡包埋机（金华市华速科技有限公司）；酶标仪（Multiskan™ FC，美国Thermo公司）；Tanon 5200型凝胶成像仪（上海天能上海天能生命科学有限公司）。

1.2 试药

七氟醚（质量分数>98%，上海熹垣生物科技有限公司）；活性氧（reactive oxygen，ROS）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒和总谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒均购自碧云天生物科技有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；铁离子检测试剂盒、抗谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗体、抗核因子类胡萝卜素2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗体、抗质子偶联二价金属离子转运蛋白成员2（solute carrier family 11 member 2，xCT）抗体均购自美国Abcam公司。

1.3 实验动物

Wistar大鼠（12周龄，体质量为220~250 g）购自深圳华瑞模式生物科技有限公司，实验动物许可证号为SYXK（粤）2022-0304。大鼠均在标准实验室条件下饲养，自由获取食物和水。

2 方法

2.1 模型构建及分组

根据参考文献［6］中的方法，采用肌氨酸乙酯亚硝胺（2.00 g·kg^-1）和亚硝酸钠（0.30 g·kg^-1）致癌剂混合灌服法建立胃癌大鼠模型，每日灌服1次，持续3个月。最后一次灌服结束后，经手术取出各组大鼠胃小弯体-窦交界处的胃黏膜行病理组织学鉴定。在光学显微镜下可观察到胃黏膜肠上皮化生病变，则表明建模成功。参与建模的50只大鼠中有42只（84.00%）建模成功。将成功的42只胃癌模型大鼠随机分为4组：模型组（n=11）、低剂量SEV组（L-SEV组）（n=10）、中剂量SEV组（M-SEV组）（n=10）和高剂量SEV组（H-SEV组）（n=11）。另选取10只Wistar大鼠作为假手术组（Sham组），Sham组大鼠不服用致癌剂，仅经手术取出胃小弯体-窦交界处的胃黏膜组织。手术后，所有大鼠均腹腔注射青霉素400 μg，每日1次，持续注射3 d，以预防感染。

2.2 麻醉处理

模型验证2周后，对模型组、L-SEV组、M-SEV组和H-SEV组大鼠进行腹部探查手术，手术时间为2 h。手术中进行常规吸氧，其中Sham组和模型组以腹腔注射100 mg·kg^-1丙泊酚进行麻醉诱导。L-SEV组、M-SEV组和H-SEV组分别进行体积分数1%、3%、5%七氟醚吸入麻醉诱导，吸入载体为纯氧，吸氧流量设置为2 L·min^-1［7］。手术结束后，腹腔注射400 μg青霉素，每日1次，以预防感染。Sham组仅腹腔注射生理盐水。

2.3 Morris水迷宫测试

腹部手术7 d后进行Morris水迷宫检测。将大鼠从不同的象限面向水池边缘释放，每次均从新的入水点放入。入水前使大鼠面向池壁，记录大鼠从入水到爬上平台的时间（潜伏期）。如果大鼠在90 s内未找到平台，则人工将其引导上平台，并记作90 s。大鼠爬上平台后休息30 s，再进行下一次实验。取4次训练成绩的平均值计为当天的潜伏期时间。经过4 d训练之后，第5天将平台撤除，让大鼠在水池中游泳90 s并记录其轨迹，记录大鼠经过平台的交叉次数以及在平台所在象限内的游泳时间。

2.4 海马组织标本采集

Morris水迷宫测试完成后，将大鼠断头处死，收集全脑组织。从左侧脑组织中快速分离海马组织，冻存于-80 ℃，用于ELISA和蛋白免疫印迹分析。右侧脑组织用体积分数4%甲醛固定，脱水后包埋于石蜡中，用于苏木精伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP切口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法检测。

2.5 HE染色

将经石蜡包埋的脑组织切成5 μm的连续切片，经脱蜡、梯度乙醇水化后，置于苏木素液中染色15 min。随后，用伊红溶液复染5 min。经梯度乙醇脱水、透明、封片后，使用Image-Pro图像分析软件分析海马组织病理情况（×100）。

2.6 TUNEL

采用TUNEL法检测海马组织中神经元的凋亡情况。将经石蜡包埋的脑组织切成5 μm的连续切片，并使用聚氨基酸固定在玻片上。用体积分数4%的三甲酚溶液将切片固定20 min，并按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行后续操作。在荧光显微镜下观察海马组织中阳性染色的细胞，并将图像放大400倍进行拍照。

2.7 ELISA

裂解海马组织，离心后收集裂解物，用相应的ELISA试剂盒检测海马组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。

2.8 铁离子和氧化应激指标水平的检测

采用相应的试剂盒检测海马组织中铁离子、ROS、MDA、GSH的水平，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

2.9 蛋白免疫印迹

利用放射免疫沉淀法裂解缓冲液从组织样本中提取蛋白。用SDS-PAGE分离蛋白，转膜。加入一抗，4 ℃孵育过夜。随后，加入二抗于室温下孵育1 h。加入免疫印迹化学发光试剂ECL后置于凝胶成像仪中拍照。用ImageQuant LAS 500进行分析。

2.10 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，多组间多个时间点数据的比较采用重复测量方差分析（若Mauchly球形检验结果P≥0.05，则满足球形检验，无需校正；若P<0.05，则不满足球形假设，需校正），两两比较采用Bonferroni校正法；多组间其他指标数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 七氟醚麻醉对胃癌大鼠术后认知功能的影响

水迷宫实验结果显示，各组大鼠逃避潜伏期在1、2 d时比较差异无统计学意义（P>0.05）；与Sham组比较，模型组、L-SEV组3、4 d时的逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间、60 s内穿过平台的次数均缩短（减少）（P<0.05）；但模型组和L-SEV组逃避潜伏期、目标象限停留时间、60 s内穿过平台的次数比较差异均无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，M-SEV组和H-SEV组3、4 d时的逃避潜伏期明显缩短，目标象限停留时间、60 s内穿过平台的次数延长（增加）（P<0.05）。各组间大鼠的游泳速度比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、表2。

3.2 七氟醚麻醉对胃癌大鼠海马组织损伤的影响

HE染色结果显示，Sham组大鼠的海马神经元轮廓清晰、结构紧凑。对照组和L-SEV组、M-SEV组、H-SEV组胃癌大鼠海马组织中的细胞形态出现一系列异常变化，包括轮廓模糊、结构松散等。与模型组比较，M-SEV组和H-SEV组大鼠海马组织的损伤更严重。见图1。

3.3 七氟醚麻醉对胃癌大鼠海马组织中神经元凋亡的影响

TUNEL分析结果显示，与Sham组比较，模型组海马组织中TUNEL阳性染色细胞数量有所增加，且M-SEV组和H-SEV组海马组织中TUNEL阳性染色细胞数量较模型组更多。见图2。

3.4 七氟醚麻醉对胃癌大鼠海马组织中炎症反应的影响

与Sham组比较，对照组大鼠海马组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平明显升高（P<0.05）。模型组与L-SEV组海马组织中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，M-SEV组和H-SEV组海马组织中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平均显著升高，且H-SEV组海马组织中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平均高于M-SEV组（P<0.05）。见表3。

3.5 七氟醚麻醉对胃癌大鼠海马组织中氧化应激的影响

与Sham组比较，模型组大鼠海马组织中的ROS和MDA水平均显著升高，而GSH水平显著降低（P<0.05）。模型组与L-SEV组海马组织中的ROS、MDA和GSH水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，M-SEV组和H-SEV组海马组织中的ROS和MDA水平均显著升高，而GSH水平显著降低，且H-SEV组海马组织中ROS和MDA水平均高于M-SEV组，GSH水平低于M-SEV组（P<0.05）。见表4。

3.6 七氟醚麻醉对胃癌大鼠海马组织中铁死亡的影响

与Sham组比较，模型组大鼠海马组织中铁离子水平显著升高，而GPX4蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。模型组与L-SEV组海马组织中铁离子水平和GPX4蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，M-SEV组和H-SEV组海马组织中铁离子水平显著升高，而GPX4蛋白表达水平显著降低，且H-SEV组海马组织中铁离子水平高于M-SEV组，GPX4蛋白的表达水平低于M-SEV组（P<0.05）。见图3、表5。

3.7 七氟醚麻醉对Nrf2/xCT途径相关蛋白表达的影响

与Sham组比较，模型组大鼠海马组织中Nrf2和xCT蛋白的表达水平均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组与L-SEV组海马组织中Nrf2和xCT蛋白的表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，M-SEV组和H-SEV组海马组织中Nrf2和xCT蛋白的表达水平均显著降低，且H-SEV组海马组织中Nrf2和xCT蛋白的表达水平均低于M-SEV组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4、表6。

4 讨论

术后认知功能障碍是指于麻醉或手术后发生的以认知能力下降为主要表现的中枢神经系统并发症，主要表现为心理活动、思维意识、人格行为、社交能力下降^［8-9］。胃癌患者术后认知功能障碍的发生已被证实与麻醉方法和麻醉深度密切相关^［10］。然而，目前关于七氟醚麻醉对胃癌术后认知功能障碍影响的研究较少，潜在机制尚未明确。

作为常用的吸入全身麻醉药物，七氟醚具有起效快、恢复时间短等优点。七氟醚的使用可能会影响癌症患者围手术期的结局。研究发现，七氟醚可直接或间接调节肿瘤细胞的迁移或侵袭，从而参与多种癌症恶性过程的调控。例如，YONG F等^［11］报道，将胃癌细胞暴露于5.1%七氟醚中，其迁移和侵袭能力被抑制。CHEN H等^［12］也研究证实了七氟醚对胃癌细胞具有抑制增殖和侵袭的作用。这些研究均证实七氟醚具有抗肿瘤活性。然而，近年的研究发现，七氟醚麻醉可能具有神经毒性。临床研究结果显示，早期多次暴露于七氟醚可能影响儿童期的神经发育，与注意力缺陷、学习和记忆障碍的发生有关^［13］。动物研究也发现，长期暴露于高浓度的七氟醚可引起神经炎症和神经元死亡，导致认知功能损伤^［14］。本研究将构建的胃癌模型大鼠分别给予1%、2%、3%七氟醚吸入麻醉，采用水迷宫测试评估大鼠的认知功能。结果显示，模型组和SEV组大鼠的逃逸潜伏期、目标象限停留时间和60 s内穿过平台的次数均显著高于Sham组，且M-SEV组和H-SEV组均显著高于模型组。同时，模型组和L-SEV组的学习和记忆能力比较差异均无统计学意义（P>0.05）。表明SEV可导致胃癌大鼠术后学习和记忆能力下降，且浓度越高，这种影响越严重。ZHAO L等^［15］将老年大鼠暴露于七氟醚，发现七氟醚对认知功能的影响程度与其浓度有关，这与本研究的结果一致。因此，七氟醚吸入麻醉可能会引起胃癌大鼠术后认知功能障碍，且吸入浓度越高，引起的术后认知功能障碍越严重。

术后认知功能障碍的发病机制尚未完全明确，但与神经炎症、氧化应激、自噬障碍、突触功能受损和缺乏神经营养支持有关^［16］。其中，神经炎症和氧化应激是导致手术后认知障碍的关键因素^［17］，神经炎症是导致中枢神经系统中ROS异常增多的主要因素，且过量的ROS会进一步加剧神经炎症。TANG X L等^［18］研究发现，七氟醚暴露通过加剧炎症损害老年大鼠的空间记忆。七氟醚能够增加成年大鼠海马体中细胞因子（IL-1β，IL-6和TNF-α）的释放和NF-κB信号的激活。此外，七氟醚能够增强新生大鼠脑氧化应激反应，诱导ROS的产生和神经元的死亡^［19］。本研究也发现，七氟醚能够引起胃癌大鼠海马组织损伤和神经元凋亡。同时，七氟醚处理能升高胃癌大鼠海马组织中炎症介质（IL-6、TNF-α和IL-1β）和促氧化应激指标（ROS和MDA）的水平，并降低抗氧化系统（SOD）的水平。这些结果表明，七氟醚通过加重海马组织中的神经炎症、氧化应激和神经元死亡，加重胃癌术后认知功能障碍。

铁死亡是一种新型的细胞死亡级联反应，主要由铁依赖性ROS增加引起的线粒体外脂质过氧化引发^［20］。其中，ROS在铁死亡过程中不可或缺。已证实铁死亡能以不依赖凋亡的方式消除癌细胞^［21］。诱导铁死亡可作为癌症的潜在治疗靶点^［22］。与自噬和凋亡不同，铁死亡的主要特征在于铁依赖和ROS依赖的细胞死亡^［23］。GPX4是铁死亡的关键调节因子，对GPX4的抑制会增加脂质过氧化，促进铁死亡的发生^［24］。最近的一项研究发现，选择性铁死亡抑制剂铁抑素-1预处理可保留线粒体功能并减轻继发于七氟醚暴露的神经元死亡，表明七氟醚引起的神经毒性可能与铁死亡有关^［25］。本研究发现，七氟醚麻醉不仅能增强胃癌大鼠海马组织中氧化应激，还能够显著上调游离铁离子水平，下调GPX4活性，表明七氟醚麻醉对胃癌大鼠术后认知功能障碍的影响可能通过诱导铁死亡实现。

Nrf2是细胞内抗氧化反应的关键调节因子，在维持适当的氧化还原稳态中发挥重要作用^［26］。值得注意的是，目前鉴定出的2种铁死亡诱导剂RSL-3和erastin分别通过抑制GPX4和胱氨酸/谷氨酸转运蛋白系统xC/xCT来启动铁死亡级联反应，而这两者都是Nrf2的下游靶标^［27］。因此，Nrf2又被认为是抗铁死亡的重要转录调节因子，能够阻止脂质过氧化和游离铁蓄积。FU D等^［28］研究发现，通过抑制Nrf2/xCT信号通路诱导的铁死亡能够增加胃癌细胞对顺铂的敏感性。本研究发现，七氟醚麻醉能够导致胃癌大鼠脑组织中Nrf2和xCT表达的下调，表明七氟醚对铁死亡的诱导作用可能是通过抑制Nrf2/xCT通路的激活来实现。

综上所述，七氟醚麻醉能够加重胃癌大鼠术后认知功能损伤，其机制可能是通过抑制Nrf2/xCT通路活化从而诱导铁死亡。

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基金资助

江苏省优势学科建设工程项目(YSHL0814-267)