利多卡因通过FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在带状疱疹后遗神经痛中的作用机制

Mechanism of lidocaine action in postherpetic neuralgia through FOXO1/miR-203b/Cacna1f axis

摘要

目的 研究带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）感染神经后，利多卡因通过FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在后遗神经痛中的作用机制。 方法 构建VZV感染的大鼠带状疱疹后遗神经痛（post herpetic neuralgia，PHN）动物模型，造模成功后，检测SD大鼠背跟神经节在感染VZV后的差异基因表达水平，结合生物信息学分析与疼痛相关的基因FOXO1（保护性）、Cacna1f（钙离子通道蛋白）和miRNA（Targetscan数据库分析并进行Realtime PCR验证），并利用双荧光素酶报告基因验证上、下游调控靶点。同时检测利多卡因组FOXO1、Cacna1f和miRNA的表达情况。 结果 SD大鼠PHN造模成功，且共鉴定出差异表达基因89个。生物信息分析结果显示，VZV感染后，FOXO1的表达下调，Cacna1f的表达上调；而利多卡因治疗组与VZV感染组比较，FOXO1的表达上调，Cacna1f的表达下调。Targetscan数据库分析结果显示，Cacna1f基因具有6个miRNA的结合位点，且仅有miR-203b的表达水平显著下降。通过双荧光素酶报告基因发现，在PHN中FOXO1对miR-203b具有转录调控作用，同时miR-203b可靶向于Cacna1f分子。 结论 FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在PHN中起重要的疼痛信号传递作用，利多卡因可通过作用于该轴减弱疼痛信号的转导，FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴可以作为治疗PHN的靶点通路。

Abstract

Objective To study the mechanism of lidocaine action and FOXO1/miR-203b/Cacna1f signaling axis in postherpetic neuralgia after varicella zoster virus （VZV） infection of nerves. Methods The SD rat model of post herpetic neuralgia （PHN） infected with VZV was established. After the successful modeling， the differential gene expression level in the dorsal heel ganglion of SD rats was detected， and the pain related genes FOXO1 （protective），Cacna1f （calcium channel protein） and miRNA （analyzed by Targetscan database and verified by Real-time PCR） were analyzed in combination with bioinformatics，and the upstream and downstream regulatory targets were verified by double luciferase reporter genes. At the same time， the expression of FOXO1，Cacna1f，and miRNA in the lidocaine group was detected. Results The model of PHN in SD rats was successfully established， and a total of 89 differentially expressed genes were identified. Bioinformatics analysis showed that FOXO1 expression was downregulated and Cacna1f expression was upregulated after VZV infection. Meanwhile，compared with the VZV infection group， the lidocaine treatment group showed upregulation of FOXO1 expression and downregulation of Cacna1f. The analysis of the Targetscan database showed that the Cacna1f gene has six miRNA binding sites， and only the expression level of miR-203b showed a significant decrease. It was found that FOXO1 has transcriptional regulatory effects on miR-203b in PHN， and miR-203b can target the Cacna1f molecule by double luciferase reporter genes. Conclusion FOXO1/miR-203b/Cacna1f signal axis plays an important role in pain signal transmission in PHN， lidocaine can alleviate the transmission of pain signals through the axis and can be used as a target pathway for the treatment of PHN.

Graphical abstract

关键词

带状疱疹后遗神经痛（PHN） / 利多卡因 / 生物信息学 / 缩足阈值 / 差异表达基因 / FOXO1 / Cacna1f / miR-203b

Key words

post herpetic neuralgia （PHN） / lidocaine / bioinformatics / paw withdrawal threshold （PWT） / differentially expressed genes / FOXO1 / Cacna1f / miR-203b

带状疱疹（herpes zoster，HZ）主要由儿时感染水痘后，潜伏在感觉神经节（脊神经节和半月神经节）内的水痘-疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）复苏、复制，并沿神经轴突向外周支配部位转移，造成外周神经纤维出现的一系列病理改变^［1］。VZV是一种嗜神经病毒，主要侵犯外周感觉神经，超过50%的患者伴有急性疼痛和感觉神经的炎症，严重影响患者的生活质量。HZ的常见症状是带状疱疹相关神经痛。即使患者在皮肤损伤完全愈合后，剧烈的疼痛依然存在，持续时间长，形成典型的神经病理性疼痛^［2-4］。常用的镇痛药物、物理疗法、外科性神经干预疗法效果均较差，严重影响患者的日常生活。由于带状疱疹相关神经痛发病机制复杂，带状疱疹后遗神经痛（post herpetic neuralgia，PHN）涉及外周神经重塑性改变和中枢敏化等永久性病理改变，因此HZ相关神经痛和PHN的治疗一直受到临床重点关注^［5-7］。本研究通过临床观察，结合动物实验探究VZV引起PHN可能的机制，为相关治疗提供可能靶点。

1 临床一般资料、仪器与材料

1.1 临床一般资料

收集本院2022—2024年确诊VZV感染的病例80例作为研究对象，其中男性32例，女性48例。将纳入的病例分为利多卡因组和对照组，每组40例。观察用利多卡因治疗4周后患者疼痛的改善情况。

1.2 仪器与试药

1.2.1 仪器

动态足底痛觉测量仪、低温离心机均购自德国Eppendorf公司；普通显微镜（日本Olympus公司）；化学发光凝胶成像系统、电泳仪，均购自美国Bio-Rad公司；酶联检测仪（台湾Meter-Tech公司）。

1.2.2 试药

1640基础培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自美国Gibco公司；FOXO1、Cacna1f抗体均购自Abcam公司；辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase， HRP）标记的羊抗兔/鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（混合二抗）、利多卡因均为本实验室前期保存；DAB染液、ECL发光液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒KGAF040、Realtime PCR试剂盒均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；PVDF膜（美国Bio-Rad公司）；affymatrix Rat Genome 230 2.0 Array表达谱芯片（泰州朝铉医疗科技有限公司）；PBST缓冲液、BSA、脱脂奶粉等均为本实验室配制、保存。

1.2.3 动物

SD大鼠购自安徽医科大学，8周龄，体质量为220~250 g，饲养于SPF级环境中，每日灯光环境下12 h，黑暗环境12 h，保持正常的生活节律。

1.2.4 病毒株与细胞系

水痘-带状疱疹病毒标准毒株VZV-1367、非洲绿猴肾母纤维细胞CV-1、HEK293细胞均为本实验室前期保存。

2 方法

2.1 临床利多卡因治疗效果评估

用利多卡因治疗4周后，用视觉模拟评分法（visual analogue scale，VAS）评估患者的疼痛情况，主观无疼痛感为0分，感觉到剧烈疼痛为10分。

2.2 VZV病毒扩增及滴度测定

将CV-1细胞（非洲绿猴肾母纤维细胞）按10⁵个·cm^-2的密度接种至25 cm²的克氏瓶中，置于35 ℃环境中培养，待细胞长成单层后，按感染复数（multiplicity of infection，MOI）=0.06接种VZV（ATCC，VZV-1367），于37 ℃吸附40 min，弃去病毒液，加入含体积分数2%胎牛血清的1640培养液，置于35 ℃培养3~5 d，即为第1代病毒。当细胞病变（cytopathic effect，CPE）达到最大时，进行传代。将CV-1细胞与正常细胞按照1∶1的比例进行连续传代，待CV-1细胞相对稳定时，采用蚀斑法检测病毒滴度。

2.3 PHN大鼠模型的构建

选取体质量为220~250 g的SD大鼠45只，随机分为实验组、空白对照组和阴性对照组，每组15只。实验组在左脚趾蹼下注入10⁶ 个·mL^-1的VZV病毒感染的CV-1细胞，阴性对照组于左脚趾蹼下注射10⁶ 个·mL^-1的正常培养的CV-1细胞，空白对照组左脚趾蹼下注射同体积生理盐水。采用动态足底测量仪检测大鼠术侧缩足阈值（paw withdrawal threshold，PWT），作为大鼠机械性痛觉超敏的评价指标。测量前，将大鼠置于铁丝网上11.5 cm×17 cm×14 cm大小的透明塑料盒内适应环境30 min。待大鼠安静后，将连接于机械泵上的金属丝（0.5 mm）置于大鼠右后足中央，避开足垫；启动机械泵，金属丝即以恒定速度自动上抬，对大鼠足底施加机械刺激。刺激力量从0 g开始以2.5 g·s^-1递增，直至大鼠产生缩腿反应。最大刺激力量为50 g，以免大鼠足爪受损。连续测量3次，每次间隔5 min，取平均值。分别于造模前（d₀）及造模后第4天（d₄）、第7天（d₇）、第14天（d₁₄）、第21天（d₂₁）、第28天（d₂₈）测量PWT。

2.4 背根神经节差异基因的筛选和分析

4周后取背跟神经节，用affymatrix Rat Genome 230 2.0 Array检测基因表达水平并分析可能参与的miRNA。

2.5 FOXO1基因对VZV病毒复制的影响

FOXO1的表达水平与VZV病毒基因ORF66的表达水平用Real-time PCR检测。ORF66扩增产物的大小为222 bp，上游引物：5’-GGAACCCCTGCACCATIAAA-3’，下游引物：5’-TCCCTCATGCCCGTIACAT-3’。分别于d₄、d₇、d₁₄、d₂₁、d₂₈将大鼠用体积分数10%水合氯醛腹腔注射（3.5 mL·kg^-1）麻醉，取出术侧左侧被根神经节，用液氮冷却后迅速置于-80 ℃冰箱中保存。

2.6 荧光素酶报告基因验证FOXO1对miR-203b的表达调控

用PCR扩增和DNA重组技术，将miR-203b的5’端调控区片段（-1 990 bp至+10 bp）定向克隆到pGL3-Basic质粒中，构建重组的荧光素酶报告基因质粒。重组质粒经用KpnⅠ和BglⅡ限制性内切酶双酶切，酶切片段长度为2 001 bp，用琼脂糖凝胶电泳验证酶切片段的长度与设计长度是否一致。并进行Sanger法测序，验证插入片段与目的片段的序列是否完全一致。以pRL-TK载体作为转染的内参，pGL3-Basic载体作为荧光素酶活性的阴性对照，测定FOXO1基因对miR-203b基因5’端启动子区转录活性。以500 bp步长截断miR-203b的启动子，检测FOXO1基因对miR-203b基因5’端启动子区的转录活性。突变miR-203b基因5’端启动子区FOXO1的结合位点，测定FOXO1基因对突变型miR-203b基因5’端启动子区的转录活性，以评价FOXO1对miR-203b转录的调控作用。

2.7 双荧光素酶报告基因验证miR-203b对Cacna1f的表达调控

扩增Cacna1f基因的3’UTR序列并突变其上miR-203b的结合位点，电泳，对目的条带进行测序。以pRL-TK载体作为转染的内参，pGL3-Basic载体作为荧光素酶活性的阴性对照，接种处于对数生长期的HEK293细胞于96孔板中，3×10³个·孔^-1，每个实验组设置6个复孔，37 ℃，5% CO₂培养箱中培养24 h；转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，加入1×Passive Lysis Buffer，每孔20 μL，用移液枪反复吸打以裂解细胞；在白色不透明的96孔板中加入Luciferase Assay Substrate，每孔100 μL；从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μL加入Luciferase Assay Substrate中混匀；用酶标仪测定500 nm处的荧光强度；加入Stop & Glo^® Substrate，每孔100 μL，混匀；用酶标仪检测500 nm处的荧光强度，2次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。

2.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行处理。计量资料用（\overline{x}\pms）表示，比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 临床利多卡因治疗的效果

治疗4周后，利多卡因组的疼痛评分下降更显著（P<0.05）。见表1。

3.2 VZV感染的大鼠PHN模型的建立

用带状疱疹标准毒株VZV-1367感染大鼠，于感染前，感染后第4、7、14、21、28天分别用热痛仪检测大鼠机械缩足反应阈值，发现VZV造模后大鼠热痛阈值显著下降，且在第14天时其阈值回升，但之后又逐渐下降，其变化趋势符合临床PHN的变化规律，表明PHN造模成功。见图1。

3.3 VZV感染大鼠后背根神经节差异基因的筛选

在VZV感染以及治疗4周后取背跟神经节，用affymatrix Rat Genome 230 2.0 Array检测基因表达水平，共找到差异表达的基因89个，其中44个基因的表达下调，45个上调。生物信息分析发现，VZV感染后，一个保护性的转录因子FOXO1的表达水平下降，而与疼痛相关的钙离子通道蛋白Cacna1f的表达水平上升，而利多卡因治疗组与VZV感染组比较，FOXO1的表达水平上升，Cacna1f的表达水平降低。见图2。

3.4 FOXO1与病毒基因ORF66表达相关性的分析

用Real-time PCR验证FOXO1表达水平与VZV病毒基因ORF66表达的相关性，以GAPDH为内参基因。FOXO1表达水平与VZV病毒基因ORF66的表达呈负相关，其相关性R²=0.89，χ²检验P<0.01。见图3。

3.5 与Cacna1f基因相关的miRNA在VZV感染后表达水平的变化

在Cacna1f的3’-UTR区，共有6个miRNA的结合位点，用Real-time PCR验证了VZV感染后背跟神经节中6个调控miRNA的表达水平，结果显示，miR-325等miRNA的表达水平均无明显变化，仅有miR-203b-5p的表达水平显著下降，且与Cacna1f的表达水平呈负相关。见图4。

3.6 在VZV感染的背跟神经节中miR-203b-5p与Cacna1f的调控关系

进一步分析Cacna1f的3’-UTR区，发现其在不同的种属中具有很高的保守性（见图5A）。通过双荧光素酶报告基因检测发现，在连接了Cacna1f基因3’-UTR区域后，加入miR-203b mimic，后者可以显著抑制荧光素酶的活性，但是在突变了Cacna1f基因3’-UTR区域的miR-203b的结合位点后，再加入miR-203b mimic则不能降低荧光素酶的活性（见图5B）。

3.7 在VZV感染的背跟神经节中FOXO1与miR-203b的调控关系

通过分析miR-203b启动区2 000 bp的序列，发现有多个FOXO1的结合位点（见图6A）。用荧光素酶报告基因检测验证FOXO1与miR-203b的调控关系。首先，以500、1 000、1 500、2 000 bp分段截取了miR-203b的启动区，分别连接荧光素报告基因，与FOXO1共转染，结果发现FOXO1在500、1 000 bp内分别有一个结合位点（见图6B）。

4 讨论

PHN是由HZ遗留下来的疼痛，属于后遗症的一种。临床上认为HZ的皮疹消退以后，局部皮肤仍有疼痛不适，且持续1个月以上称为PHN。表现为局部阵发性或持续性的灼痛、刺痛、跳痛、刀割痛，严重影响患者的睡眠、精神状态等^［5-7］。

本研究发现，将VZV标准毒株注射于SD大鼠左脚趾蹼皮下，4周后取大鼠背跟神经节，用affymatrix Rat Genome 230 2.0 Array检测基因表达水平，共找到差异表达的基因89个，其中44个表达下调，45个表达上调。生物信息分析结果显示，VZV感染后，一个保护性的转录因子FOXO1的表达下调，而与疼痛相关的钙离子通道蛋白Cacna1f表达上调（见图2），而利多卡因可减缓上述分子的表达变化，起到了一定的治疗作用。

FOXO1是FOX家族FOXO亚家族的成员，FOX家族成员均具有一个长110个氨基酸的保守的DNA结合结构域，称为FOX（Forkhead box）结构域，含有一个螺旋-转角-螺旋基序，有3个α螺旋和2个大环形成的翼状（winged）结构^［8-9］。FOXO亚家族主要通过调控转录和信号转导途径在动物细胞凋亡、细胞周期停滞、DNA损伤修复及糖代谢等方面发挥重要作用。FOXO1作为转录因子，其在细胞内的定位对其活性具有较大影响，FOXO1在细胞核与细胞质之间的穿梭主要靠自身的磷酸化修饰和乙酰化修饰，但二者作用方式不同，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）可以作用于FOXO1的Ser256位点，使其磷酸化，进而使FOXO1由细胞核转移到细胞质，从而使其失去转录活性^［10-11］。FOXO1磷酸化后转移至细胞质，诱导泛素化的发生和蛋白酶体的降解。用生长因子或胰岛素处理细胞，会使总FOXO1水平急剧下降，这种FOXO1降解是由于泛素化蛋白质水解造成。在细胞质，FOXO1发生泛素化，且这种修饰依赖于由AKT介导的磷酸化。AKT磷酸化FOXO1的Ser256位点，为E3连接酶SKP2创造结合位点。然而由ERK介导的FOXO1磷酸化，诱导其构象改变，促进FOXO1与另一种E3泛素连接酶MDM2结合，最终导致FOXO1的泛素化和蛋白酶体的降解。研究发现，FOXO1在病毒潜伏及启动中具有重要的作用^［12-13］。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus，KSHV）感染具有潜伏期和复制期2个阶段，当潜伏期被破坏，病毒则进入复制期，诱导恶性肿瘤的发生和发展。在已确定的调节KSHV生命周期的众多因素中，由活性氧物质清除和产生不平衡引起的氧化应激已被证明会严重破坏KSHV潜伏期并诱导病毒复制。GAO R等^［14］研究发现，抗氧化防御因子FOXO1在KSHV生命周期中发挥重要作用。一方面，抑制FOXO1功能或抑制FOXO1的表达可导致细胞内的ROS水平升高，这破坏了KSHV潜伏期并诱导病毒再激活；另一方面，用氧自由基清除剂N-乙酰- l -半胱氨酸处理，导致由FOXO1诱导的活性氧水平降低，最终导致KSHV再活化减弱^［15］。以上研究结果表明，FOXO1通过维持细胞内氧化还原平衡在保持KSHV潜伏期中起着重要作用。本研究发现，FOXO1的表达水平与VZV在体内的复制有关，VZV ORF66的mRNA表达水平与FOXO1 mRNA表达水平呈显著负相关（见图3）。表明FOXO1的低表达与VZV在体内的活化有关。

钙电压门控通道亚基α1f（Cacna1f）编码跨膜蛋白，作为电压依赖性钙通道的α₁亚单位发挥作用，介导钙离子流入细胞。Cacna1f主要编码L型钙通道蛋白Cav1.4，该基因的突变可导致X连锁眼疾病。Cacna1f早先被认为主要在视神经中表达，随着研究的深入，发现Cacna1f在神经肌肉接头、背根神经、小肠等部位均有表达^［16-18］。Cacna1f基因突变小鼠除了出现视觉障碍外，运动能力可能也存在异常，如其在爬杆实验、旋转棒实验中均表现出耐力不良（易疲劳）^［19］。Cacna1f基因突变小鼠脊髓灰质背根中Cav1.4的表达水平较对照组显著下降。在GEO、UCSC、NCBIGene等测序数据库中，Cacna1f在心血管、内分泌和神经等多个系统表达，在神经系统中主要表达于突触后神经元胞体和近端树突部位，为高电压激活型，激活时间持久，表现为持续的钙离子内流。这可能是导致PHN发生的重要因素。

L型钙电压门控通道与病理性神经疼痛具有重要的相关性。RADWANI H等^［20］在脊神经结扎神经病理性疼痛模型中敲除脊髓背角CAV1.2和囊内注射抗CAV1.2的siRNA都可降低触诱发痛和脊髓背角神经元的兴奋性。CAV1.2维持慢性病理性疼痛是通过钙离子内流引发细胞内信号转导通路反应，包括环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）转录因子的磷酸化、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB）依赖基因环氧化酶2转录的增加，最终在细胞水平上表现为脊髓神经元长期敏感而实现的。先天性静止性夜盲（congenital stationary night blindness，CSNB）样表型大鼠是由Cacna1f基因突变引起的自发性大鼠模型，OH A等^［21］研究发现，CSNB大鼠的逃逸潜伏期延长，而在MWM中的探针刺激减少。该结果表明，CSNB大鼠在回避试验中的错误次数增多，CSNB大鼠在野外活动中呈现不同的探索模式。通过运动相关行为显示罗塔罗德试验的下降潜伏期较短，CSNB大鼠的抓握时间缩短^［22-23］，导致了Cacna1f基因突变的CSNB大鼠疼痛机械阈值的升高。

L型钙电压门控通道基因的内源性调控机制比较多，但是miRNA在其表达调控中起着重要的作用。FAVEREAUX A等^［24］研究发现，慢性疼痛状态的特点是脊髓神经元长期敏感，而Cav1.2的上调在慢性神经病理性疼痛中发挥关键作用。在其进一步的研究中发现，miR-103b以一种新的综合调节方式同时调节形成Cav1.2-LTC的3个亚基的表达。幼稚大鼠中的miR-103b基因敲除导致其对疼痛敏感，而在神经病变动物中，miR-103b的表达下调，并且在鞘内应用miR-103b可有效缓解疼痛，从而使miR-103b被确定为神经病变慢性疼痛的一个新的可能的治疗靶点。此外，miRNA在调控T型钙通道蛋白引起的神经痛中也发挥重要的作用，苏州大学QI R等^［25］也研究发现，miR-32调控了Cav3.2的表达和功能，并参与疼痛调控，上调CCI-ION大鼠TG中miR-32的表达或功能，则引起Cav3.2表达下调，T型钙离子通道电流强度降低且大鼠机械痛阈值升高；抑制正常大鼠TG中miR-32的功能，Cav3.2的表达水平上调，同时大鼠机械痛阈值明显降低，导致痛觉过敏。

本课题组推测miRNA参与了Cacna1f基因的表达调控，并通过Targetscan等数据库分析了Cacna1f基因的调控miRNA（见图4）。通过分析发现，Cacna1f基因具有很短的3’-UTR区，仅有70 bp，其上有6个miRNA结合位点，本研究用Real-time PCR检测了这6个miRNA在VZV诱导的PHN大鼠背根神经节中的表达水平（见图4），结果发现仅有miR-203b的表达水平有显著性变化，其在VZV病毒感染后的表达水平显著下降。目前针对miR-203b的研究相对较少，已有研究发现miR-203b位于人染色体14q32反义链上，在上皮细胞分化、骨骼肌发育、肿瘤细胞凋亡中均发挥重要的作用^［26-28］。此外，miR-203b已经被证实在多种疼痛模型中发挥重要的作用，LI H等^［29］研究发现，miR-203b参与神经性疼痛的发生，并通过抑制Rap1a的表达阻止由神经生长因子诱导的神经元PC12细胞分化。通过研究坐骨神经损伤动物模型也发现miR-203b的异常表达^［30］。以上研究结果表明，miR-203b的异常低表达在PHN中发挥了重要的作用。

HOU Y等^［31］研究发现，在脂肪分化过程中，FOXO1与miR-203b具有相关性，但是该研究并未对二者是否存在转录调控进行验证。本研究进一步分析了miR-203b的启动子区（见图6A），发现其具有多个FOXO1的结合位点，表明FOXO1是miR-203b重要的转录调控因子。

利多卡因可通过FOXO1/miR-203b/Cacna1f轴影响PHN的治疗效果。这将有助于新的靶点药物的研发，对进一步阐明VZV在体内的复制机制具有一定的参考价值。同时也为临床治疗相关疾病提供新的、潜在的靶标。

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基金资助

淮安市科技计划项目(HAB201927)

徐州医科大学附属医院发展基金面上项目(XYFM202234)