一测多评法同时测定润肠丸（胶囊）中的9种成分

Determination of 9 constituents in Runchang Pills (Capsules) by quantitative analysis of multi-components with single-marker

摘要

目的 建立同时测定润肠丸（胶囊）中苦杏仁苷、阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、羌活醇、大黄素、异欧前胡素、大黄酚、大黄素甲醚含量的一测多评法（quantitative analysis of multi-components with single-marker，QAMS）。 方法 该药物甲醇提取液的分析采用Agilent Venusil C₁₈ Plus色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸（B）-水（C）；梯度洗脱；柱温为30 ℃；检测波长为218 nm（苦杏仁苷）、254 nm（阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、羌活醇、大黄素、异欧前胡素、大黄酚、大黄素甲醚）；以芦荟大黄素为内标物，建立与其他8种成分的相对校正因子，检测各成分的含量。 结果 苦杏仁苷、阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、羌活醇、大黄素、异欧前胡素、大黄酚、大黄素甲醚的质量浓度分别在11.48~229.56、2.79~55.92、2.34~46.96、3.44~68.82、3.01~60.33、2.07~41.49、4.34~86.82、4.69~93.76、3.78~75.72 µg·mL^-1范围内有良好的线性关系（r≥0.996 9）；加样回收率为97.42%~99.28%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.09%~2.27%；QAMS结果与外标法实测值无明显差异。 结论 建立的方法准确、可靠，稳定性、耐用性好，可用于润肠丸（胶囊）中苦杏仁苷、阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、羌活醇、大黄素、异欧前胡素、大黄酚、大黄素甲醚含量的测定。

Abstract

Objective To establish a quantitative analysis method for simultaneous content determination of amygdalin， ferulic acid， notopterol， isoimperatorin and other 5 anthraquinone derivatives in Runchang Pills （Capsules） by using the analysis of multi-components by single-marker （QAMS）. Methods The determination was carried out by using high-performance liquid chromatography （HPLC）. An Agilent Venusil C₁₈ Plus column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used with a mobile phase consisting of acetonitrile， 0.1% phosphoric acid and water in a gradient elution mode. The flow rate was maintained between 0.7~1.0 mL·min^-1， the column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelengths were 218 nm and 254 nm respectively. The content was calculated by using QAMS with aloe emodin as an internal standard. Results The mass concentrations of amygdalin， ferulic acid， aloe emodin， rhein， notopterol， emodin， isoimperatorin， chrysophanol， and physcion showed good linear relationships （r≥0.996 9） within the linear ranges of 11.48-229.56， 2.79-55.92， 2.34-46.96， 3.44-68.82， 3.01-60.33， 2.07-41.49， 4.34-86.82， 4.69-93.76 and 3.78-75.72 µg·mL^-1 respectively. The recovery rates were ranged from 97.42% to 99.28%， with RSD levels ranging from 1.09% to 2.27%. The results obtained by the 2 quantitative determination methods were consistent. Conclusion This method is accurate， reliable， stable and durable， providing an experimental basis for enhancing the standards of Runchang Pills （Capsules）.

Graphical abstract

关键词

润肠丸（胶囊） / 一测多评法 / 相对校正因子 / 含量测定

Key words

Runchang Pills （Capsules） / quantitative analysis of multi-components by single-marker（QAMS） / relative correction factor / content determination

润肠丸（胶囊）由当归、羌活、大黄、桃仁、火麻仁5味中药组成，用于治疗实热津亏引起的便秘，可润肠通便、活血祛风^［1］。方中当归活血养血、桃仁润肠通便，为君药；羌活祛风散邪、大黄泻热逐瘀为臣药；润肠通便、润燥补虚的火麻仁为佐使药。诸药相配，用于活血祛风、润肠通便。

现行质量标准为部颁标准与企业注册标准，部颁标准仅收载了性状检查、显微鉴别、当归薄层鉴别等，无定量检测指标，企业标准大多在部颁标准的基础上增加大黄、羌活等药味的薄层鉴别及大黄素、大黄酚的含量测定，标准设置严重滞后、检测项目专属性不强，难以从整体上控制润肠丸（胶囊）制剂的质量；相关研究文献也多为苦杏仁苷、阿魏酸、大黄素、大黄酚等单一成分的定量分析^［2-4］。李芸等^［5］建立了润肠丸中阿魏酸和蒽醌衍生物的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定方法，但未检出君药桃仁的指标性成分苦杏仁苷。根据《中华人民共和国药典》（2020版）中的中药质量标准要求，中药制剂应选择君药、臣药中有效成分或指标性成分进行含量测定。根据中药复方制剂多组分、多靶点、相互协同作用的特点，建立多成分的含量测定方法以有效控制润肠丸（胶囊）的整体质量显得尤为必要。

基于上述考虑，本文参考相关文献^［6-8］采用一测多评法（quantitative analysis of multi-components with single-marker，QAMS）同时测定润肠丸（胶囊）中9种指标性成分，有效提升了标准的科学性、可控性和适用性，有望为该制剂的质量控制与评价及市场监管水平提升提供技术支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Precisa 92SM-202A型号电子分析天平［普利塞因国际贸易（上海）有限公司］；JRA15-300A型数码超声波清洗机（无锡杰瑞安仪器设备有限公司）。

1.2 试药

苦杏仁苷（批号110820-202109，质量分数为93.1%）、阿魏酸（批号110773-201915，质量分数为99.4%）、芦荟大黄素（批号110795-201308，质量分数为97.8%）、大黄酸（批号110757-202308，质量分数为95.0%）、羌活醇（批号110820-202106，质量分数为97.5%）、大黄素（批号110756-201913，质量分数为96.0%）、异欧前胡素（批号110827-202113，质量分数为99.2%）、大黄酚（批号110796-201922，质量分数为99.4%）、大黄素甲醚（批号110758-202218，质量分数为98.9%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈，均为色谱纯，均购自德国默克公司；磷酸（优级纯，上海化学试剂总厂）；纯化水。7批润肠丸与5批润肠胶囊来源于6家药品生产企业，见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent Venusil C₁₈ Plus色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸（B）-水（C）；梯度洗脱；柱温为30 ℃；检测波长为218 （0~8 min）、254 （8~62 min）、218 nm （62 min）；进样量为10 μL；稳定13 min后进下个样品。梯度洗脱程序见表2。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取苦杏仁苷、阿魏酸、羌活醇、异欧前胡素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1 mL含苦杏仁苷229.56 μg、阿魏酸55.92 μg、羌活醇60.33 μg、异欧前胡素86.82 μg、芦荟大黄素46.96 μg、大黄酸68.82 μg、大黄素41.49 μg、大黄酚93.76 μg、大黄素甲醚75.72 μg的对照品储备液。取对照品储备液5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释，定容至刻度，摇匀，制得每1 mL含苦杏仁苷114.78 μg、阿魏酸27.96 μg、羌活醇30.16 μg、异欧前胡素43.41 μg、芦荟大黄素23.48 μg、大黄酸34.41 μg、大黄素20.98 μg、大黄酚46.88 μg、大黄素甲醚37.86 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取润肠丸样品，研细，取细粉（或胶囊内容物）0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，加塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，置于蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备

按处方比例，制备缺桃仁、缺当归羌活、缺大黄的阴性样品，并按照2.2.2项下的方法制成阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察

精密吸取2.2.1项下对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得5个系列质量浓度的混合对照品溶液，并按照2.1项下色谱条件进行测定。以苦杏仁苷、阿魏酸、羌活醇、异欧前胡素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，结果见表3。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果显示，9种待测成分色谱峰与相邻峰之间可实现基线分离，样品溶液其他成分对阴性样品无干扰。见图1。

2.4.2 精密度考察

取对照品溶液，按照2.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算苦杏仁苷、阿魏酸、羌活醇、异欧前胡素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品的RSD值分别为1.21%、1.36%、0.90%、0.77%、1.15%、0.79%、1.13%、1.06%、1.33%。

2.4.3 重复性考察

取样品（批号202204142）适量，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，苦杏仁苷、阿魏酸、羌活醇、异欧前胡素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为8.263 8、1.021 4、0.319 8、0.596 5、0.220 6、0.281 7、0.192 8、0.898 6、0.327 4 mg·g^-1，峰面积的RSD值分别为1.23%、1.36%、1.07%、1.43%、2.04%、1.45%、0.82%、1.48%、1.37%。

2.4.4 稳定性考察

取样品（批号202204142）适量，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，室温放置0、2、4、6、8、12、24 h，按照2.1项下色谱条件分别进样测定，苦杏仁苷、阿魏酸、羌活醇、异欧前胡素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为1.67%、1.58%、1.02%、0.96%、2.03%、1.39%、1.64%、1.83%、2.07%。

2.4.5 加样回收率考察

取含量已知的供试品（批号202204142）粉末约0.5 g，精密称定，加入约相当于样品含量的对照品溶液，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，计算9种待测成分含量的加样回收率及RSD值。结果显示，9种待测成分的平均加样回收率在97.42%~99.28%范围内，RSD在1.09%~2.27%范围内，符合方法验证要求，方法准确度良好。见表4。

2.5 相对校正因子的计算

以芦荟大黄素为内标物，建立其与苦杏仁苷、阿魏酸、羌活醇、异欧前胡素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的相对校正因子。f_is=（A_i×C_s）/（A_s×C_i）（其中f_is为待测成分相对于芦荟大黄素的相对校正因子，A_s为内标峰面积，C_s为内标质量浓度，A_i为待测成分峰面积，C_i为待测成分质量浓度）。见表5。

2.6 耐用性考察

2.6.1 仪器、色谱柱

分别考察了Agilent TC-C₁₈（2）、GL INERTSIL ODS-SPC₁₈、Agilent Venusil C₁₈ Plus色谱柱（规格均为4.6 mm × 250 mm，5 μm）；Agilent 1260型、赛默飞 DGP-3600SDN型、Waters e2695型色谱仪对相对校正因子的影响。结果显示，待测成分的校正因子与测试仪器与色谱柱无相关性（RSD<3%）。见表6。

2.6.2 柱温

取对照品溶液，分别在25、30、35 ℃进样测定，考察柱温对相对校正因子的影响，结果显示，不同柱温对相对校正因子无明显影响（RSD<2%）。见表7。

2.6.3 色谱峰定位考察

取2.2.1项下对照品溶液，分别考察在Agilent 1260型、赛默飞 DGP-3600SDN型、Waters e2695型色谱仪及Agilent TC-C₁₈（2）、GL INERTSIL ODS-SPC₁₈、Agilent Venusil C₁₈ Plus色谱柱（规格均为4.6 mm × 250 mm，5 μm）的测定条件下，待测成分相对保留时间的重复性。结果显示，所用仪器与色谱柱对测定成分相对保留时间无明显影响（RSD<2%）。见表8。

2.7 样品含量测定

分别取7批润肠丸与5批润肠胶囊样品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，分别采用外标法（external standard method，ESM）、QAMS计算各成分的含量。结果显示，不同生产企业的样品含量结果存在明显差异，个别企业不同批次的样品含量结果有明显波动。本文12批供试品制备工艺与投料量不同，最终成品规格各异（0.4 g~0.8 g相当于原药材1.5 g），不同制备方法的样品计算得到的单位质量化学成分含量存在差别；在原材料供应环节，药材的产地、生长环境、采收期、饮片加工方法及生产批次等多重因素均与药材质量密切相关，进而对待测成分含量结果产生直接影响。将每种成分的2组数据导入SPSS 21.0软件进行Pearson相关系数r分析，2种方法测定结果具有一致性。见表9。

3 讨论

分别考察了提取溶剂、提取时间及提取方式对样品提取效率的影响，结果表明，以甲醇为溶剂超声提取30 min，各待测成分色谱峰与相邻峰之间能够达到基线分离，色谱峰信息丰富，稳定性与重复性良好。

苦杏仁苷在酸性条件下易水解为氢氰酸和苯甲酸，弱有机酸阿魏酸需在酸性环境中才能稳定存在。流动相选择为乙腈-体积分数0.1%磷酸-水，通过三相梯度洗脱在线调节体积分数0.1%磷酸溶液和水的配比以控制不同时间流动相的pH值，实现苦杏仁苷和阿魏酸同时检出。在实验过程中，发现羌活醇和大黄素的色谱峰不能基线分离，经反复实验探索，通过调节二者出峰时间内的流速及流动相配比，使其分离度满足分析要求。检测波长218 nm时基线噪声相对较小，苦杏仁苷峰与相邻杂质峰完全分离，出峰时间适中，峰型尖锐对称；254 nm检测波长能够保证其余8种待测成分的检出灵敏度、稳定性及重复性，基线平稳。柱温30 ℃时无前沿峰及包裹峰，样品分离效果较佳。芦荟大黄素对照品价格低廉，易于购置，样品中含量较高，出峰时间适中，峰形良好，优选为内标物。综上所述，色谱条件选择乙腈-体积分数0.1%磷酸-水为流动相，柱温为30 ℃，检测波长为218、254 nm波长切换联合梯度洗脱。

因苦杏仁苷检测波长（218 nm）接近乙腈截止使用波长，分析过程中存在一定基线波动，酸性流动相环境对苦杏仁苷分析结果稳定性也有一定影响。羌活醇和大黄素色谱峰的分离度及出峰强度在后续研究中仍有提升空间，上述原因可能导致本研究中苦杏仁苷、羌活醇、大黄素的线性相关系数偏低。基于部分润肠胶囊生产厂家在制备工艺中加入了药用辅料β-环糊精与淀粉，本研究在方法建立过程中，比较了不同基质背景的制剂对测定结果的影响，β-环糊精与淀粉在提取溶剂甲醇中均不溶，通过超声提取、过滤滞留于滤渣中，药用辅料β-环糊精与淀粉的存在对测定结果的准确度无明显影响。

本文测定成分涵盖方中君药（桃仁、当归）和臣药（羌活、大黄）中的指标性成分，并与药典中相应药材项下检测指标一致，使得制剂中可控项目达到所含药味的90%，该项研究为润肠丸（胶囊）制剂的质量可控性和标准先进性奠定了基础。

4 结论

本研究建立了能同时测定润肠丸（胶囊）中苦杏仁苷、阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、羌活醇、大黄素、异欧前胡素、大黄酚、大黄素甲醚含量的QAMS，该方法简化了实验操作步骤，降低了检测成本，简便快捷，准确可靠，与外标法测定结果一致，为提高润肠丸（胶囊）制剂的质量标准奠定了基础。

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基金资助

河南省市场监督管理局科技计划项目(2023sj94)