高冠平胶囊的质量标准提升研究

Study on the improvement of quality standard for Gaoguanping Capsules

摘要

目的 提升高冠平胶囊的质量标准，确保临床应用的安全性和有效性。 方法 采用薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）鉴别高冠平胶囊中的葛根素和丹参酮Ⅱ‍ A；采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定羟基红花黄色素A、葛根素和3’-甲氧基葛根素的含量。 结果 高冠平胶囊中的葛根素和丹参酮Ⅱ A的TLC特征斑点清晰可见，分离效果好，且阴性样品无干扰。HPLC测定结果显示，羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素分离度良好，质量浓度分别在相应范围内（1.63~32.61、5.94~118.79、4.90~97.90 µg·mL^-1）均与其峰面积线性关系良好（r ≥0.999 8）；平均加样回收率为98.85%~100.38%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于1.5%。 结论 建立的高冠平胶囊TLC定性鉴别和HPLC定量测定方法简便、准确，专属性和重复性好，可用于提升高冠平胶囊的质量标准，加强其质量控制。

Abstract

Objective To improve the quality standard of Gaoguanping Capsules to ensure the safety and effectiveness in clinical application. Methods Puerarin and tanshinone ⅡA in Gaoguanping Capsules were identified by thin-layer chromatography （TLC）. The content of hydroxysafflor yellow A， puerarin and 3’-methoxy puerarin in Gaoguanping Capsules was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC）. Results The TLC characteristic spots of puerarin and tanshinone ⅡA in Gaoguanping Capsules were clear， with good separation effect and without interference. The HPLC method showed excellent chromatographic separation of hydroxysafflor yellow A， puerarin and 3’-methoxy puerarin， and within the corresponding concentrations ranges （1.63~32.61， 5.94~118.79， 4.90~97.90 µg·mL^-1）， all of components showed a good linear relationship with their peak areas （r≥0.999 8）. The average recovery rates were in the ranges of 98.85%~100.38%， and the relative standard deviation （RSD） was less than 1.5%. Conclusion The established TLC qualitative identification and HPLC quantitative methods for Gaoguanping Capsules are simple， accurate， specific and reproducible， which can be used to improve the quality standard of Gaoguanping Capsules and strengthen the quality control of the capsules.

Graphical abstract

关键词

高冠平胶囊 / 薄层色谱法 / 高效液相色谱法 / 葛根素 / 丹参酮Ⅱ‍ A / 羟基红花黄色素A / 3’-甲氧基葛根素

Key words

Gaoguanping Capsules / thin-layer chromatography （TLC） / high performance liquid chromatography （HPLC） / puerarin / tanshinone Ⅱ‍‍ A / hydroxysafflor yellow A / 3’-methoxy puerarin

高冠平胶囊是由陕西省药品监督管理局批准的山海丹医院的院内制剂，由黄芪、丹参、红花、白芍、红参、三七、葛根等19味中药材组成，具有益气养血、活血化瘀、通络潜阳之功效，用于治疗冠心病、高血压病及高血压性心脏病^［1-3］。作为高冠平胶囊的君药，丹参具有扩张血管以降低血压，抑制血小板聚集，改善心肌缺血和微循环，防治心肌梗死等作用^［4］；其活性成分丹参酮Ⅱ A可治疗动脉粥样硬化^［5］、心肌缺血^［6］、心肌纤维化^［7］和心肌肥厚^［8］。臣药红花具有扩张冠状动脉、改善心肌缺血、抗凝、抗血栓等作用^［9］；其黄酮类成分羟基红花黄色素A可减少心肌缺血再灌注损伤，改善脑缺血再灌注损伤^［9］。葛根具有降血压的作用^［10］，可抑制动脉粥样硬化，降低血脂，改善心肌缺血^［11-14］和心律失常^［15-16］，保护心功能；其异黄酮类成分葛根素可抗动脉粥样硬化，抑制心肌肥厚，抗心律失常及控制心率^{［12，14-15］}；3’-甲氧基葛根素可保护脑缺血再灌注损伤，减小梗死面积，提高脑皮质超氧化物歧化酶活力，并能降低丙二醛的含量^［17］。

该制剂现有质量标准仅对性状、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁、黄芪甲苷和芍药苷的鉴别做了相关规定，覆盖面较窄。本研究用薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）对高冠平胶囊中的葛根素和丹参酮ⅡA进行定性鉴别。建立了羟基红花黄色素A、葛根素和3’-甲氧基葛根素的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）含量测定方法，为全面提升高冠平胶囊的质量标准提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），配置Waters 2489型紫外检测器（美国Waters公司）；XPR2/A型、AG135型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-250DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4V型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；RE2000A型旋转蒸发器（上海亚荣仪器生化厂）；三用紫外分析仪（江阴市申港电光厂）。

1.2 试药

高冠平胶囊（批号：1904001、1904002、1904003、1909001、1909002、1909003、1912001、1912002、1912003、1912004，山海丹医院）；羟基红花黄色素A（批号HS21807B1，质量分数为98.0%）、葛根素（批号HS14914B2，质量分数为98.0%）、3’-甲氧基葛根素（批号HR2202W5，质量分数为98.0%），均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；葛根素（批号110752-201816，质量分数为95.4%）、丹参酮Ⅱ A（批号110766-202022，质量分数为98.9%），均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇（HPLC级），均购自美国Honeywell公司；甲醇、磷酸、乙醚、三氯甲烷、石油醚（沸点60~90 ℃）、甲酸（分析纯），均购自成都市科隆化学品有限公司；乙酸乙酯（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 高冠平胶囊的TLC鉴别

2.1.1 葛根素

取高冠平胶囊内容物2 g，加甲醇20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇4 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取葛根素对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL^-1的对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020版）^［18］四部通则0502中的TLC法进行实验。吸取供试品溶液和对照品溶液各5 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，于365 nm紫外光灯下检视。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见图2。

2.1.2 丹参酮Ⅱ A

取高冠平胶囊内容物15 g，加乙醚50 mL，超声溶解15 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯0.5 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取丹参酮Ⅱ A对照品，加乙酸乙酯制成质量浓度为1 mg·mL^-1的对照品溶液。按照《中国药典》（2020版）^［18］四部通则0502中的TLC法进行实验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（沸点60~90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见图3。

2.2 羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素含量的测定

2.2.1 色谱条件

Waters SunFire C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）。以乙腈-1 mL·L^-1磷酸水溶液（13∶87）为流动相进行等度洗脱；检测波长为250 nm；流速为1.0 mL·min^-1；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。

2.2.2 混合对照品溶液的制备

取羟基红花黄色素A对照品约10 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得质量浓度为203.840 µg·mL^-1的羟基红花黄色素A对照品母液；取葛根素对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得质量浓度为989.898 µg·mL^-1的葛根素对照品母液；取3’-甲氧基葛根素对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得质量浓度为979.020 µg·mL^-1的3’-甲氧基葛根素对照品母液。取羟基红花黄色素A对照品母液8 mL、葛根素对照品母液6 mL和3’-甲氧基葛根素对照品母液5 mL，置于50 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇稀释定容至刻度，摇匀得混合对照品母液。取混合对照品母液10 mL，置于25 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇稀释定容至刻度，摇匀得混合对照品溶液，其中羟基红花黄色素A质量浓度为13.045 8 µg·mL^-1、葛根素质量浓度为47.515 1 µg·mL^-1、3’-甲氧基葛根素质量浓度为39.160 8 µg·mL^-1。

2.2.3 供试品溶液的制备

取20粒高冠平胶囊的内容物，研磨混匀，取内容物约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为70%的甲醇25 mL，称定质量，超声提取45 min，放冷，再次称定质量。以体积分数为70%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 标准曲线、线性范围的考察

精密量取2.2.2项下制备的混合对照品母液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，得到7个不同质量浓度的溶液。按照色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x），进行线性回归分析，结果见表1。

2.2.5 精密度实验

精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液10 μL，按照2.2.1项下色谱条件连续测定6次，记录目标成分的峰面积并分析相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。测得羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素峰面积的RSD值分别为0.15%、0.06%、0.12%（n=6），表明该仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性实验

取2.2.3项下供试品溶液，常温下放置0、2、4、8、12、16、24 h，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，测得羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素24 h内峰面积的RSD值分别为1.63%、0.93%、1.68%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性实验

取同批高冠平胶囊（批号1904001）内容物0.5 g，按照2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，测得羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素的平均含量分别为0.671 6、1.430 0、0.277 1 mg·g^-1，RSD值分别为0.88%、0.64%、0.54%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.2.8 回收率实验

精密称取0.25 g已知含量的高冠平胶囊（批号1904001）内容物6份，分别置于锥形瓶中。按照《中国药典》（2020版）四部要求^［18］，分别精密加入另行配制的混合对照品溶液（羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素的质量浓度分别为33.611 3、71.628 4、13.858 7 µg·mL^-1）5 mL，再按照2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，记录待测成分的色谱峰面积，计算各成分的回收率及RSD值。高冠平胶囊中羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素的平均加样回收率分别为100.04%、100.38%、98.85%，RSD分别为0.94%、1.24%、0.79%（n=6）。见表2。

2.2.9 样品含量测定

测定10批高冠平胶囊中羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素的含量，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件测定，计算羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素的含量。见表3和图4。

3 讨论

高冠平胶囊是山海丹医院治疗高血压及高血压性心脏病的特色院内制剂，临床疗效突出，已成为该院治疗心脑血管疾病的主要使用药品，因此提升其质量评价体系水平对保证临床用药的有效性与安全性具有重要意义。

3.1 TLC鉴别

佐药葛根选择其有效成分葛根素^［19］作为鉴别指标，TLC鉴别方法展开系统简单，重复性好，方法简便灵敏，故列入质量标准。君药丹参的有效成分明确^［20］，主要是丹参酮Ⅱ A和丹酚酸B发挥治疗作用，丹酚酸B在TLC鉴别时，经多次点样观察，供试品与对照品色谱在相应的位置上，均无明显相同颜色的斑点。样品制备过程中较为黏稠，重复性差，故不将丹酚酸B鉴别列入标准。最终选择丹参酮Ⅱ A作为鉴别指标。臣药香附的主要成分包括挥发油类物质、黄酮、生物碱、三萜与甾醇、蒽醌等^［21］。α-香附酮在TLC鉴别时，经多次点样观察，供试品与对照品色谱在相应的位置上，均无明显相同颜色的斑点。香附的有效成分对热敏感，在样品制备时，取样量较大，重复性不好，因此不将香附的鉴别列入标准。佐药决明子含有蒽醌类、苯丙吡咯酮类、苷类、脂肪酸类等化学成分^［22］，由于大黄酚等黄酮类成分与何首乌有效成分重叠，选择其特征有效成分橙黄决明素作为鉴别指标，经多次点样观察，供试品与对照品色谱在相应的位置上，均无明显相同颜色的斑点，因此不将决明子的鉴别列入标准。

3.2 HPLC含量测定

3.2.1 流动相的选择

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-1 mL·L^-1甲酸溶液、乙腈-1 mL·L^-1甲酸溶液、甲醇-1 mL·L^-1磷酸溶液、乙腈-1 mL·L^-1磷酸溶液等流动相，经测定，用乙腈-1 mL·L^-1磷酸水溶液（13∶87）等度洗脱时，羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素的色谱峰分离效果及峰形最佳，且基线平稳，故以乙腈-1 mL·L^-1磷酸水溶液（13∶87）为流动相。

3.2.2 波长的选择

基于二极管阵列检测器在200~400 nm范围内全波长进行扫描，比较不同波长下的羟基红花黄色素A、葛根素、3’-甲氧基葛根素紫外吸收强度和色谱峰参数，结果发现，在250 nm波长处各个目标峰的响应较高、分离度与峰形均较好、基线平稳，故以250 nm作为检测波长。

3.2.3 供试品溶液制备方法的选择

因高冠平胶囊处方含19味中药材，有效成分复杂，结构类型丰富，理化性质差异明显，本研究前处理考察了超声提取、加热回流、索氏提取，发现超声提取效果最好。考察了不同体积分数的甲醇溶液（100%、70%、50%、30%）和不同体积分数的乙醇溶液（100%、70%、50%、30%）作为提取溶剂。结果表明，以体积分数为70%的甲醇为溶剂时，各成分提取比较充分，故提取溶剂为体积分数为70%的甲醇。考察了15、30、45、60 min等不同提取时间，结果表明，45 min即可提取完全，且杂质峰较少，故提取时间选择45 min。

综上所述，本研究建立的TLC能对高冠平胶囊中的葛根素和丹参酮Ⅱ‍A进行准确鉴别，且简便灵敏、专属性强、重复性好；建立的同时测定羟基红花黄色素A、葛根素和3’-甲氧基葛根素含量的HPLC法，专属性强、重复性良好，可提升高冠平胶囊的质量标准，更好地评价和控制高冠平胶囊的质量。

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基金资助

咸阳市重点研发计划项目(2021ZDYF-SF-0011)

陕西中药行业全产业链检验检测平台项目(2021PT-040)