小檗碱通过调控miR-30a对口腔鳞状细胞癌细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响

Berberine regulates miR-30a and affects 5-fluorouracil resistance in oral squamous cell carcinoma cells

摘要

目的 观察小檗碱对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）耐药性的影响，并探讨可能的机制。 方法 取对数期耐5-FU的人舌鳞癌CAL27细胞（human tongue squamous cell carcinoma CAL27 cells resistant to 5-FU，CAL27/5-FU），将微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miR）-30a抑制质粒miR-30a inhibitor转染至CAL27/5-FU细胞上，将其随机分为inhibitor组和联合组，inhibitor组常规培养，联合组加入40 μg·mL^-1小檗碱进行培养；另取对数期CAL27/5-Fu细胞分为空白组和小檗碱组，空白组常规培养，小檗碱组加入40 μg·mL^-1小檗碱进行培养。用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞的增殖抑制率；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测细胞miR-30a的表达水平；双染法检测细胞的凋亡率；双荧光素酶实验验证miR-30a与三结构域蛋白31（tripartite motif-containing protein 31，TRIM31）的靶向关系；免疫印迹法（Western blotting）检测细胞TRIM31蛋白的表达情况。 结果 与空白组比较，小檗碱组的增殖抑制率、miR-30a的表达水平和凋亡率均升高，TRIM31蛋白的表达量降低（P<0.05），inhibitor组的增殖抑制率、miR-30a的表达水平和凋亡率均降低，TRIM31蛋白的表达量升高（P<0.05）；与小檗碱组比较，联合组的增殖抑制率、miR-30a的表达水平和凋亡率均降低，TRIM31蛋白的表达量升高（P<0.05）；与inhibitor组比较，联合组的增殖抑制率、miR-30a的表达水平和凋亡率均升高，TRIM31蛋白的表达量降低（P<0.05）。双荧光素酶实验结果显示，TRIM31是miR-30a的靶基因，两者的结合位点为TRIM31的3’-UTR片段。 结论 小檗碱可逆转OSCC细胞的5-FU耐药性，促进细胞凋亡，其作用机制可能是通过上调miR-30a的表达来进一步靶向下调TRIM31的表达。

Abstract

Objective To observe the effect of berberine on 5-fluorouracil （5-FU） resistance of oral squamous cell carcinoma （OSCC） cells， and to explore the possible mechanism. Methods Human tongue squamous cell carcinoma CAL27 cells resistant to 5-FU （CAL27/5-FU） cells in logarithm phase were taken， and microRNA （miR）-30a inhibitory plasmid miR-30a inhibitor was transfected into CAL27/5-FU cells. The cells were randomly divided into inhibitor group， combined group， and inhibitor group with routine culture. The combined group was added berberine （40 μg·mL^-1）. In addition， the logarithm phase cells were divided into blank group and berberine group. The blank group was routinely cultured， and the berberine group was added with berberine （40 μg·mL^-1）. The inhibition rate of cell proliferation was detected by MTT method. The relative expression of miR-30a in cells was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The apoptosis rate was detected by double staining. The targeting relationship of miR-30a to tripartite motif-containing protein 31 （TRIM31） were verified by dual-luciferase experiments. The expression of TRIM31 protein in cells were detected by Western blotting. Results Compared with the blank group， the proliferation inhibition rate， miR-30a expression and apoptosis rate were increased， the TRIM31 protein expression was decreased in the berberine group （P<0.05）， the proliferation inhibition rate， miR-30a expression， and apoptosis rate were decreased， and the TRIM31 protein expression was increased in the inhibitor group （P<0.05）. Compared with the berberine group， the proliferation inhibition rate， miR-30a expression， and apoptosis rate were decreased， and the TRIM31 protein expression was increased in the combined group （P<0.05）. Compared with the inhibitor group， the proliferation inhibition rate， miR-30a expression， and apoptosis rate were increased， and the TRIM31 protein expression was decreased in the combined group （P<0.05）. The dual-luciferase results showed that TRIM31 was a target gene of miR-30a， and the binding site was the 3’-UTR fragment of TRIM31. Conclusion Berberine can reverse 5-FU resistance and promote cell apoptosis in OSCC cells， and its mechanism may be related to the up-regulation of miR-30a and the further targeted down-regulation of TRIM31 expression.

Graphical abstract

关键词

小檗碱 / 微小RNA-30a / 口腔鳞状细胞癌 / 5-氟尿嘧啶 / 耐药性

Key words

berberine / microRNA-30a / oral squamous cell carcinoma / 5-fluorouracil / drug resistance

口腔鳞状细胞癌（oral squamous-cell carcinoma，OSCC）是临床常见的头、颈部恶性肿瘤，多发生于40岁以上男性，以复发性强、病死率高为主要特征，可影响咀嚼能力及面容形象，对患者的生活质量和自信力造成严重损害^［1-2］。我国是OSCC的高发国家之一，每年新发病例超过4万例，目前OSCC已成为我国公共卫生事业的重大难题^［3］。手术切除配合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）化疗是OSCC常用的治疗方法，可显著延长患者的生存期，但细胞耐药性可限制其疗效，导致化疗失败，是导致该病病死率居高不下的主要原因^［4］。小檗碱是中草药黄连的主要活性物质，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、提升免疫力等多种药理活性^［5］。研究发现^［6］，小檗碱可通过抑制鼻咽癌细胞的增殖迁移，诱导细胞的凋亡、坏死，停滞细胞周期等方式，发挥抗肿瘤作用，但目前关于小檗碱对头颈部恶性肿瘤化疗耐药性影响的研究较少，且缺乏相应的机制研究。本研究通过体外培养5-FU耐药的人舌鳞癌CAL27细胞，观察小檗碱对其耐药性的影响，并探讨相关机制。

1 仪器与材料

1.1 试药

小檗碱（质量分数≥98%）、5-FU均购自上海易恩化学技术有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒、双染凋亡检测试剂盒，均够自上海抚生实业有限公司；Lipofectamine^TM3000试剂盒、微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miR）-30a沉默质粒miR-30a inhibitor质粒、miR-30a阴性对照质粒miR-30a NC、miR-30a过表达量质粒miR-30a mimics、双荧光素酶检测试剂盒，均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；兔抗人三结构域蛋白31（tripartite motif-containing protein 31，TRIM31）一抗（美国R&D公司）。

1.2 仪器

Infinite200型酶标仪（瑞士Tecan公司）；7500型RT-qPCR仪（美国ABI公司）；FACSAria型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 细胞株

人OSCC CAL27细胞系（中国科学院上海细胞库）。

2 方法

2.1 细胞培养

将人OSCC CAL27细胞株置于DMEM培养基（10%胎牛血清、1%青链霉素）中，温度为37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱内常规培养，每2 d换1次培养液，待细胞融合至贴壁，胰酶消化传代培养，取对数期细胞进行后续实验。

2.2 建立耐5-FU的人舌鳞癌CAL27细胞株（human tongue squamous cell carcinoma CAL27 cells resistant to 5-FU，CAL27/5-FU）

采用药物浓度递增法建立CAL27/5-FU细胞株，取对数期CAL27细胞置于完全培养液中培养，分别加入200 μL终质量浓度为10、20、40、80、160 μg·mL^-1的5-FU，各质量浓度分别干预48 h，期间剔除死亡细胞。于常规培养基上继续传代，传代后继续诱导，2个月后待细胞可稳定生长于培养基（5-FU终质量浓度为20 μg·mL^-1）中，代表CAL27/5-FU细胞株诱导成功，取对数期细胞进行后续实验。

2.3 MTT法检测CAL27、CAL27/5-FU细胞的5-FU敏感性

取对数期CAL27、CAL27/5-FU细胞，调整细胞密度为1×10⁵个·mL^-1，接种至6孔板中，待细胞融合至贴壁，每孔分别加入含5-FU（10、20、40、80、160 μg·mL^-1）的DMEM培养液，48 h后再加入20 μL MTT溶液（5 g·L^-1），2 h后弃去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，充分振荡，用酶标仪检测490 nm处的吸光度值，计算细胞增殖抑制率和两者半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC₅₀）。细胞增殖抑制率=［1-（各质量浓度5-FU孔吸光度值/空白对照孔吸光度值）］×100%。

2.4 RT-qPCR检测CAL27、CAL27/5-FU细胞miR-30a的表达情况

取对数期CAL27、CAL27/5-FU细胞，Trizol法提取总RNA，Promega试剂盒合成cDNA，以U6为内参荧光，定量检测miR-30a的表达水平。反应体系：双倍Gelred染料10 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各1 μL，cDNA 1 μL，双蒸水补足至20 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min，重复40个循环。用2^-△△CT法分析并计算miR-30a的相对表达强度。引物序列见表1。

2.5 细胞干预、转染及分组

取对数期CAL27/5-FU细胞，磷酸盐缓冲液洗涤，胰酶消化、重悬，以1×10⁶个·mL^-1接种于6孔板，待细胞融合至贴壁，按照Lipofectamine^TM3000试剂盒说明书操作进行细胞转染，将miR-30a沉默质粒miR-30a inhibitor转染至CAL27/5-FU细胞，随机分为inhibitor组和联合组，inhibitor组置于DMEM培养基中常规培养，在联合组培养基中另加入40 μg·mL^-1小檗碱。另取对数期CAL27/5-FU细胞分为空白组、小檗碱组，空白组置于DMEM培养基中常规培养，在小檗碱组培养基中另加入40 μg·mL^-1小檗碱，干预48 h后进行后续实验，每组细胞设置5个复孔^［7］。

2.6 MTT法检测细胞增殖抑制率

取空白组、小檗碱组、inhibitor组和联合组细胞，洗涤、重悬、接种、染色同“2.3”项下操作方法，加入40 μg·mL^-1 5-FU，培养48 h后，计算各组的细胞增殖抑制率。

2.7 RT-qPCR检测miR-30a的表达情况

取空白组、小檗碱组、inhibitor组和联合组细胞，操作同“2.4”项下方法。

2.8 双染法检测细胞的凋亡率

取空白组、小檗碱组、inhibitor组和联合组细胞，PBS洗涤，胰酶消化、重悬，冰上以2 500 r·min^-1离心10 min，弃去上清液，根据双染凋亡检测试剂盒说明书进行实验，binding buffer缓冲液标记细胞，混合5 μL AnnexinV-FITC液，避光孵育10 min，PI液二次染色，经流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，计算凋亡率。凋亡率=（凋亡细胞数量/细胞总数量）×100%。

2.9 双荧光素酶实验验证miR-30a的靶向基因

经数据库TargetScan预测，miR-30a与TRIM31的3’UTR存在结合位点，构建合成野生型TRIM31 3’-UTR-WT及突变型TRIM31 3’-UTR-MUT载体，与miR-30a阴性对照质粒miR-30a NC共同转染至293T细胞，48 h后收集细胞，采用试剂盒测定荧光酶活性。

2.10 免疫印迹法（Western blotting）检测TRIM31蛋白的表达情况

取空白组、小檗碱组、inhibitor组和联合组细胞，加入预冷裂解液裂解，冰上以10 000 r·min^-1离心12 min，BCA法测定总蛋白并定量。将40 μg样本蛋白与4倍体积上样缓冲液混合，沸水浴加热变性，离心取上清，加载至10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），电泳分离并转膜，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）液封闭，混合加入兔抗人TRIM31一抗（1∶500），4 ℃冰箱冷藏过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶偶联抗体（1∶2 000），室温孵育2 h，洗膜，浸入增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL），置于暗室显色，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，经凝胶成像仪拍照分析TRIM31蛋白的相对表达量。

2.11 统计学方法

数据资料的分析、处理采用SPSS 22.0软件。以（\overline{x}±s）表示计量资料，以单因素方差分析比较多样本资料，两两样本资料比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CAL27、CAL27/5-FU细胞5-FU敏感性的比较

不同质量浓度的5-FU对CAL27、CAL27/5-FU细胞增殖抑制率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；不同质量浓度的5-FU对CAL27/5-FU细胞的增殖抑制率低于CAL27细胞，IC₅₀值高于CAL27细胞（P<0.05）。表明耐药株CAL27/5-FU建立成功。见表2，图1。

3.2 CAL27、CAL27/5-FU细胞miR-30a表达水平的比较

与CAL27细胞系比较，CAL27/5-FU细胞系中miR-30a的表达量降低（P<0.05）。见表3。

3.3 各组细胞增殖抑制率的比较

与空白组比较，小檗碱组增殖抑制率升高，inhibitor组增殖抑制率降低（P<0.05）；与小檗碱组比较，联合组增殖抑制率降低（P<0.05）；与inhibitor组比较，联合组增殖抑制率升高（P<0.05）。见表4。

3.4 各组细胞miR-30a表达水平的比较

与空白组比较，小檗碱组miR-30a的表达水平升高，inhibitor组miR-30a的表达水平降低（P<0.05）；与小檗碱组比较，联合组miR-30a的表达水平降低（P<0.05）；与inhibitor组比较，联合组miR-30a的表达水平升高（P<0.05）。见表5。

3.5 各组细胞凋亡率的比较

与空白组比较，小檗碱组的细胞凋亡率升高，inhibitor组的细胞凋亡率降低（P<0.05）；与小檗碱组比较，联合组的细胞凋亡率降低（P<0.05）；与inhibitor组比较，联合组的细胞凋亡率升高（P<0.05）。见表6，图2。

3.6 双荧光素酶实验结果

TargetScan预测显示，miR-30a与TRIM31存在互补序列。见图3。与miR-30a NC转染细胞比较，miR-30a mimics转染细胞野生型TRIM31-WT荧光酶活性显著降低（P<0.05），对突变型TRIM31-MUT荧光酶活性无影响（P>0.05）。表明TRIM31是miR-30a的一个靶基因，两者结合位点为TRIM31的3’-UTR片段。见表7。

3.7 各组细胞TRIM31蛋白表达水平的比较

与空白组比较，小檗碱组TRIM31蛋白的表达水平降低，inhibitor组TRIM31蛋白的表达水平升高（P<0.05）；与小檗碱组比较，联合组TRIM31蛋白的表达水平升高（P<0.05）；与inhibitor组比较，联合组TRIM31蛋白的表达水平降低（P<0.05）。见表8，图4。

3 讨论

OSCC是起源于口腔黏膜上皮浅表组织的癌症，多发于舌缘、口底及牙龈处，其发病是一个慢性病理变化的过程，早期表现为白斑或皲裂性病变，后续发展为色素斑、溃疡或小结节。随着癌细胞迅速扩散至周围组织，出现结块增大、溃疡加重、出血等症状，癌细胞随淋巴液转移至区域淋巴结，或侵犯临近舌根、牙龈造成发声困难、牙痛，最终转移至全身，造成恶性病变，危及生命^［8］。5-FU是头、颈部恶性肿瘤及鳞状细胞癌的主要化疗药物，作为细胞毒性药物，可在肝脏作用下活化为氟尿嘧啶脱氧核苷，与脱氧尿苷酸竞争性结合DNA，从而阻断肿瘤细胞增殖，同时5-FU代谢产物氟尿嘧啶可渗入RNA，抑制RNA合成^［9］。5-FU的耐药性机制尚未完全明确，多认为与核酸转运蛋白缺乏、叶酸代谢酶活性降低、胸苷酸合成酶活性改变、DNA修复及信号传输通路改变等因素相关，在这些因素的作用下OSCC细胞增殖能力增强，复发概率升高^［10］。因此，寻找逆转5-FU耐药的新药物来抑制OSCC细胞增殖是降低OSCC复发率、改善患者预后的关键。

中医将OSCC归属于“舌疳”“舌岩”范畴，起舌之根旁，初状如黄豆，碎烂略痛，舌烂弥漫，肿如菌样，汤水难咽，每食不足、渐变舌岩，此病为本虚标实之证，主要病理机制为饮食不节、情志内伤、邪由外入、蕴积肌膜、交结凝滞，以致热毒内生、气机失调、郁火焦灼、进而发病，化疗乃火毒之药，虽消癌肿，亦伤脾胃，故治疗应以清热解毒、健脾养胃、散郁开结为主^［11］。中药黄连是中医常用清热药物，取自毛茛科植物黄连的根茎，性寒，味苦，归心经、脾经、胃经、肝经、胆经、大肠经，可清热泻火、燥湿解毒。明代医学家倪朱谟言，黄连可清七情六欲之火，治舌烂口臭，唇齿燥裂，压心脾之邪热^［12］。小檗碱又名黄连素，是从黄连中提取的异喹啉生物碱，可通过降低细胞内钙离子浓度来抑制花生四烯酸催化活性及拓扑异构酶活性，从而阻断肿瘤细胞的DNA复制，抑制细胞增殖^［13］。QU H等^［14］的研究结果表明，小檗碱可增强胶质母细胞瘤细胞自噬及凋亡能力，表现出良好的化疗增敏效果，提示小檗碱或可成为克服化疗耐药问题的研究新方向。本研究结果显示，与空白组比较，小檗碱组增殖抑制率升高、凋亡率升高，提示小檗碱可逆转OSCC细胞5-FU耐药性，促进OSCC细胞凋亡。

miR是长度为22 nt左右的一种小分子单链非编码RNA，在生长、发育、发病、转归、衰老等多个生理、病理过程中扮演重要角色，可定向调控基因表达，影响肿瘤的发展^［15］。miR-30a属于miR-30家族成员，在多个肿瘤组织及癌细胞系中低表达，作为抑癌因子发挥抗肿瘤作用^［16］。TRIM31是一种E3泛素连接酶活性蛋白，可参与调控蛋白泛素化降解影响肿瘤细胞代谢过程，促进肿瘤细胞增殖、迁移，增强耐药性^［17］。FAN M D等^［18］研究发现，TRIM31过表达可增强胶质母细胞瘤A172细胞活力，提高替莫唑胺对其的IC₅₀值，并抑制其凋亡，敲除TRIM31则会增强替莫唑胺的敏感性，促进A172细胞的凋亡，提示TRIM31过表达可增强癌细胞的耐药性，其可作为癌症化疗的潜在靶点。本研究结果显示，与CAL27细胞比较，CAL27/5-FU细胞系miR-30a表达水平降低，提示miR-30a在5-FU耐药细胞株中低表达；经双荧光素酶实验验证，miR-30a与TRIM31存在结合位点，TRIM31是其靶向调控基因之一。此外，与空白组比较，inhibitor组TRIM31蛋白的表达水平升高，且与小檗碱联用可在一定程度上减弱转染对OSCC细胞5-FU耐药性的影响，提示小檗碱逆转OSCC细胞5-FU耐药可能与调控miR-30a，进而负向调控下游的靶基因TRIM31的表达有关。

综上所述，小檗碱可逆转OSCC细胞5-FU耐药性，促进细胞凋亡，其作用机制可能与上调miR-30a进一步靶向下调TRIM31的表达有关。

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基金资助

2021年河北省医学科学研究课题计划项目(20210409)