万古霉素结合光热治疗协同抵抗金黄色葡萄球菌

Vancomycin combined with photothermal therapy synergistically resists Staphylococcus aureus

摘要

目的 金黄色葡萄球菌感染对人体危害极大，而用抗生素治疗容易引起细菌耐药。因此，开发新型抗菌剂和抗菌模式迫在眉睫。 方法 本文通过非键合功能化作用将万古霉素（Vancomycin，Van）结合在聚乙二醇功能化的氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）表面，利用GO良好的光热转化性能，构建新型抗菌复合材料以对抗金黄色葡萄球菌感染，并通过紫外可见光谱、红外光谱及扫描电子显微镜等对其进行表征。 结果 该抗菌复合材料不仅具有Van对金黄色葡萄球菌的抑制作用，同时在白光照射下还具有光热抗菌活性，这种光热-化学双重抗菌模式可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。该复合材料在光照下具有优异的光热转化活性，当其质量浓度≥4 µg∙mL^-1时，可有效抑制金光色葡萄球菌的生长，抑制质量浓度与不光照比较，降低了4倍。 结论 该新型抗菌模式有望拓展Van等抗生素的应用。

Abstract

Objective Staphylococcus aureus-induced infection is harmful to human body. Meanwhile， antibiotic treatment can easily lead to bacterial resistance. Therefore， it is urgent to develop a new antibacterial material and model. Methods In this paper， through the non-bonding functionalization of vancomycin （Van） and polyethylene glycol-functionalized graphene oxide （GO）， a novel antibacterial material was created to combat S. aureus-induced infection due to GO’s strong photothermal conversion capabilities. The nanocomposite was characterized by UV-vis spectroscopy， infrared spectroscopy， and scanning electron microscopy. Results This antibacterial model not only has the inhibitory effect of Van against S. aureus， but also has photothermal antibacterial activity under white light irradiation. This dual antibacterial effect can effectively inhibit the growth of S. aureus. The results showed that the nanocomposite had excellent photothermal activity under light irradiation. When the nanocomposite concentration was more than 4 µg∙mL^-1， it could effectively inhibit the growth of S. aureus， which was 4-times lower than that without light irradiation. Conclusion This new antibacterial model is expected to expand the application of antibiotics，such as Van.

Graphical abstract

关键词

万古霉素 / 光热治疗 / 氧化石墨烯 / 抗菌活性

Key words

vancomycin / photothermal therapy / graphene oxide / antibacterial activity

金黄色葡萄球菌感染对人体危害极大，万古霉素（vancomycin，Van）是一种重要的抗生素，常用于革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）感染的治疗^［1］。Van通过抑制革兰氏阳性细菌细胞壁的生物合成，发挥抗菌作用^［2］。然而，随着Van的广泛应用及给药量的增加，出现了对Van耐药的细菌，严重威胁人类健康。因此，开发新型高效的抗菌材料和抗菌模式迫在眉睫。

光热治疗（photothermal therapy，PTT）具有高效、不良反应少的优势，被认为是一种比抗生素治疗更具有潜力的治疗方法^［3-5］。常见的光热材料有金纳米棒^［6-7］、黑磷^［8-9］、上转换纳米粒子^［10-11］、二硫化钼^［12-13］、碳纳米管^［14-15］和石墨烯^［16-18］。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一种重要的石墨烯衍生物，能吸收光能并产生热量，对细菌的膜结构造成不可逆的损伤^［19-20］。由于GO表面存在含氧官能团，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）分子结合在GO表面可进一步提高其水溶性^［21］。同时，Van通过非键和功能化作用结合在GO表面，可提高纳米复合物的抗菌性能^［22］。然而，这种基于Van负载PEG功能化GO（polyethylene glycol-functionalized GO，GO-PEG）复合材料用于光热作用抑制金黄色葡萄球菌生长的研究尚未见报道。

本文设计、制备了基于Van负载GO-PEG（GO-PEG@Van）的复合材料，作为一种新型光热抗菌材料用于抵抗金黄色葡萄球菌引起的感染。通过紫外可见光谱、红外光谱和扫描电镜对制备的纳米复合材料进行表征，并详细研究其光热性能和抗菌活性。

1 仪器和试药

1.1 仪器

UV-9000型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；Nicolet iS50型傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Fisher公司）；Quanta 250 FEG型场发射扫描电镜（FEI公司）；SW-CJ-2F型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ML-T型分析天平（Mettler Toledo公司）；LDZX-50KBS型立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；ZWY-103B型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；Testo 868型光热成像仪（德国德图仪器公司）。

1.2 试药

石墨粉（≥325目）、聚氧乙烯二胺、Van和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐［1-（3-（dimethylamino）propyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有溶液均用超纯水配制。

2 方法

2.1 GO-PEG的制备

羧基化GO（GO-COOH）的制备参照文献^［23］中的方法进行。将0.5 mL 10 mg·mL^-1聚氧乙烯二胺水溶液加入40 mL 1.0 mg·mL^-1 GO-COOH溶液中，超声振荡10 min。再加入1.0 mol·L^-1 EDC溶液使其浓度达到20 mmol·L^-1，超声30 min后搅拌24 h。产物以10 000 r·min^-1离心30 min，弃去上层清液后加超纯水超声打散。以2 000 r·min^-1离心10 min，上层溶液即为GO-PEG。

2.2 GO-PEG@Van复合材料的制备

取5 mL 1.0 mg·mL^-1 GO-PEG，向其分别加入2.5 mL的2.0 mg·mL^-1 Van溶液和超纯水，超声30 min后避光搅拌24 h。产物以10 000 r·min^-1离心30 min，弃去上层清液后加10 mL超纯水超声打散。以2 000 r·min^-1离心10 min，上层溶液即为GO-PEG@Van。

2.3 Van标准曲线的测定

用超纯水准确配制7组不同质量浓度（500.0、333.0、222.0、73.0、24.0、8.0、2.6 μg·mL^-1）的Van溶液，依次扫描其在200~370 nm范围内的紫外可见光谱。以280 nm处的吸光度（A）值与其相应的质量浓度进行线性拟合，得到Van的标准曲线。

2.4 GO-PEG@Van光热性能的测定

分别取不同质量浓度的GO-PEG@Van溶液置于2.0 mL离心管中，在白光下（159 mW·cm^-2）照射10 min，用光热成像仪记录溶液温度的变化。

2.5 细菌生长抑制实验

金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）过夜培养后用LB培养基稀释至1.0×10⁶ CFU·mL^-1，并与不同质量浓度的GO-PEG@Van等体积混合。在白光下（159 mW·cm^-2）照射10 min后，置于37 ℃培养箱中孵育8 h。用紫外可见分光光度计检测各样品在600 nm处的A值。实验重复3次。

2.6 抑菌圈实验

取50 μL经过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液，将其均匀涂抹在LB琼脂培养基表面。取直径为1.0 cm含有抗菌材料的圆形吸水纸，将其缓慢置于琼脂板表面，在白光下（159 mW·cm^-2）照射10 min后，置于37 ℃培养箱中孵育6 h。

3 结果与讨论

3.1 GO-PEG@Van复合材料的制备

为了提高GO的水溶性和生物相容性，GO表面采用PEG进行功能化修饰^［21］。先将GO表面的酯基转化为羧基，再通过EDC偶联法，使聚氧乙烯二胺中的氨基与GO表面的羧基发生酰胺化反应，得到PEG-GO。在加入Van之后，Van通过π-π堆积的非共价功能化作用结合在GO-PEG表面，得到GO-PEG@Van复合材料。制备流程见图1。

3.2 GO-PEG@Van复合材料的表征

为了证实PEG分子已结合在GO表面，分别检测了GO和GO-PEG的红外光谱，见图2。由图2可见，与修饰PEG前GO的红外谱图比较，修饰后GO-PEG在2 923、2 854 cm^-1处的亚甲基伸缩振动峰明显增强；修饰PEG后，GO在1 732 cm^-1的羰基的伸缩振动峰红移到了1 635 cm^-1处；而且，GO-PEG在1 260 cm^-1处存在明显的碳氧单键的伸缩振动峰。因此可以确定PEG修饰分子已经修饰到GO表面。

为了研究Van是否负载到GO-PEG表面，分别检测了GO、GO-PEG、GO-PEG@Van以及24 μg·mL^-1 Van的紫外可见光谱图，见图3。由图3可见，PEG修饰对GO的吸收峰位置没有影响，吸收峰依然在230 nm处。在GO-PEG和Van的紫外可见光谱图中可以明显观察到GO和Van的特征吸收峰分别在230、280 nm。在GO-PEG@Van的紫外可见图谱中可以观察到在280 nm处存在吸收峰，表明Van已经负载到GO-PEG表面，同时GO受到负载上的Van的影响，特征吸收峰从230 nm蓝移到了201 nm。

GO-PEG@Van的SEM照片见图4。由图4可见，该复合材料具有很薄的纳米片层，并呈现出特有的褶皱结构。

3.3 GO-PEG对Van负载能力的研究

为了研究GO-PEG对Van的负载能力，测定了Van的标准曲线，其线性方程为y=4.4x-0.001 6，相关系数为0.997，见图5和图6。分别检测GO-PEG负载Van前（Van质量浓度为500 μg·mL^-1）以及负载完成后经过高速离心所得上层清液中Van的紫外可见光谱，见图7。由图7可以明显观察到280 nm波长处的Van特征吸收强度明显下降，表明经24 h的搅拌，有部分Van已负载至GO-PEG表面。通过Van的线性方程可以精确计算出离心后上层清液中Van的质量浓度为251.4 μg·mL^-1，即在10 mL GO-PEG@Van复合材料中，纳米片层表面所负载的Van的量为2.485 mg。

3.4 光热性能的研究

在白光照射下，研究了不同质量浓度GO-PEG@Van复合材料和超纯水的光热转化性能，见图8和图9。光照5 min后，超纯水的温度无明显变化。GO-PEG@Van的温度随时间和质量浓度的增加而升高。当GO-PEG@Van复合材料质量浓度为32 μg·mL^-1时，光照5 min后，体系温度从26.6 ℃上升到64.3 ℃，结果与红外热成像保持一致。以上结果表明，GO-PEG@Van复合材料具有优良的光热转化性能，可应用于光热抗菌。

3.5 抗菌性的研究

细菌生长抑制和抑菌圈实验可用于评估GO-PEG@Van复合材料的光热抗菌活性。不同质量浓度GO-PEG@Van复合材料在有、无光照条件下对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果见图10。在无光照条件下，当GO-PEG@Van复合材料的质量浓度≥16 µg·mL^-1时，可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，抗菌作用主要来源于GO对细菌细胞膜的切割作用以及Van对细胞壁生物合成的抑制作用。然而，在白光下照射10 min后，材料产生相应的光热活性，当质量浓度≥4 µg·mL^-1时，可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，抑制质量浓度与无光照比较，降低了4倍。这可能是由于抗菌作用不仅来源于GO对细菌细胞膜的切割作用以及Van对细胞壁生物合成的抑制作用，而且还有GO的光热抗菌效应，GO-PEG@Van复合材料的这种多重抗菌作用使其对金黄色葡萄球菌的抑制作用大大提高。本实验结果表明，GO-PEG@Van复合材料具有优异的光热抗菌活性，可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。

与细菌生长抑制实验相比，抑菌圈实验可以更加直观地反映材料抗菌活性的强弱。吸水纸a为未负载Van的GO-PEG，可以观察到GO-PEG的抑菌圈很小；吸水纸b为0.248 5 mg·mL^-1的Van溶液（质量浓度与GO-PEG@Van复合材料负载Van质量浓度相同），可以观察到其周围具有明显的抑菌圈，但直径略小；吸水纸c为GO-PEG@Van复合材料的抑菌圈，可以发现GO-PEG@Van复合材料的抑菌圈远大于GO-PEG与Van的抑菌圈直径的加和，见图11。以上结果表明，在光照条件下，GO-PEG@Van复合材料具有协同抗菌作用，其对金黄色葡萄球菌的生长的抑制作用最强。

4 结论

本文成功制备了GO-PEG@Van复合材料，其可作为新型光热抗菌材料。实验结果证实，Van已结合在GO片层上。而且，该复合材料在白光照射下，具有优异的光热转化性能，可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，具有潜在的应用价值。

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基金资助

国家自然科学基金项目(51703259)

河南省自然科学基金项目(232300421191)

中原工学院自然科学基金项目(K2023MS012)