嗜麦芽窄食单胞菌的耐药性与Ⅵ型分泌系统及外排泵的研究

The correlation analysis of type Ⅵ secretion system and efflux pump in antibiotic resistance of Stenotrophomonas maltophilia

摘要

目的 分析临床分离嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，SMA）Ⅵ型分泌系统（type Ⅵ secretion system，T6SS）、外排泵基因SmeABC和SmeDEF的分布情况，探讨T6SS和携带外排泵基因与抗菌药物耐药的关系。 方法 收集2021年3月至2024年2月医院192株非重复SMA临床分离株，统计患者的一般临床资料。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法检测所有分离株的T6SS基因，外排泵SmeABC、SmeDEF基因。使用VITEK-2 Compact仪器及纸片扩散法对分离菌株进行鉴定和抗菌药物敏感试验。 结果 192株SMA中，T6SS阳性菌株共计47株（24.48%），T6SS阳性菌株对头孢噻肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明的耐药率明显高于T6SS阴性菌株（P<0.05），T6SS阳性组患者入住ICU及气管插管、胸腹引流管占比情况均高于T6SS阴性组（P<0.05）。外排泵基因检测结果显示，114株（59.38%）过表达SmeABC基因，且高表达组对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率高于低表达组（P<0.05），106株（55.21%）过表达SmeDEF基因，高表达组对庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均明显高于低表达组（P<0.05）。同时，T6SS阳性组SmeABC、SmeDEF的表达量相较于T6SS阴性组的表达量均明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）。 结论 T6SS阳性组的耐药率较高，在医院ICU、机械通气及插管的患者中检出率较高，SmeABC、SmeDEF的表达量显著高于T6SS阴性组，提示SmeABC、SmeDEF过表达可能与T6SS阳性菌株多重耐药性存在一定的相关性。

Abstract

Objective To analyze the distribution of type Ⅵ secretion system（T6SS） secretion system， SmeABC efflux pump genes， and SmeDEF in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia （SMA） type Ⅵ‍， and explore the relationship between T6SS and carrying efflux pump genes and antibiotic resistance. Methods From March 2021 to February 2024， 192 non repetitive clinical isolates of SMA infection were collected from our hospital， and the general clinical data of patients were collected. Polymerase chain reaction （PCR） was used to detect the T6SS type Ⅵ‍ secretion system gene， SmeABC and SmeDEF efflux pump genes in all isolates. The isolated strains and antimicrobial susceptibility were identified by using VITEK-2 Compact Instrument and micro broth dilution method. Results Among the 192 strains of SMA， a total of 47 （24.48%） were T6SS positive. The resistance rate of T6SS positive strains to cefotaxime， ceftazidime， gentamicin， amikacin， ciprofloxacin， levofloxacin， and compound sulfamethoxazole was significantly higher than that of T6SS negative strains （P<0.05）. Patients in the T6SS positive group had higher rates of Intensive Care Unit （ICU） admission， intubation， and drainage than those in the T6SS negative group （P<0.05）. The results of gene testing for efflux pumps showed 114 strains （59.38%） overexpressed the SmeABC gene， and the high expression group had a higher resistance rate to ceftazidime and cefotaxime than the low expression group （P<0.05）. 106 strains （55.21%） overexpressed the SmeDEF gene， and the high expression group had a significantly higher resistance rate to gentamicin， amikacin， ciprofloxacin， and levofloxacin than the low expression group （P<0.05）. Meanwhile， the expression levels of SmeABC and SmeDEF in the T6SS positive group were significantly higher than those in the T6SS negative group， and the differences were statistically significant （P<0.001）. Conclusion The drug resistance rate of T6SS positive strains is relatively high， and the higher detection rate， the higher ICU admission， mechanical ventilation， and intubation. The expression level of Sme ABC and Sme DEF is significantly higher than that of T6SS negative strains， indicating that SmeABC and SmeDEF may be related to the multiple drug resistance of T6SS positive strains.

Graphical abstract

关键词

嗜麦芽窄食单胞菌 / 外排泵基因 / 荧光定量聚合酶链式反应 / Ⅵ型分泌系统

Key words

Stenotrophomonas maltophilia / extracellular pump genes / fluorescence quantitative polymerase chain reaction / type Ⅵ secretion system

嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，SMA）是一种非发酵革兰氏阴性杆菌，作为一种机会性致病菌，越来越多的住院患者被感染，特别是对免疫功能低下的患者具有较高的致病性和死亡率^［1-2］。其感染的危险因素主要包括免疫力降低、恶性肿瘤、囊性纤维化、血管内导管等留置设备、机械通气以及长期使用广谱抗菌药物^［3］。近年来，由于广谱抗菌药物的广泛应用以及医院感染风险的增加，导致SMA对复方新诺明等一线抗菌药物的耐药率逐渐上升^［4］。目前，一些分子机制已被证实参与SMA耐药性的形成，例如多重药物外排泵系统SmeABC和SmeDEF，以及sul耐药基因的存在等^［5-6］。Ⅵ型分泌系统（type Ⅵ secretion system，T6SS）是一种重要的大分子蛋白质复合物，作为细菌的毒力因子，其能够将有毒蛋白（效应物）传递到靶细胞中，提高细菌自身的定植及竞争能力^［7］。研究发现^［8］，在纳入研究患者的SMA菌株中检测出T6SS基因，且SMA可以利用T6SS消除大肠埃希菌和洋葱伯克霍尔德菌等异源细菌，并与共同感染的铜绿假单胞菌竞争。尽管多重药物外排泵系统SmeABC和SmeDEF及T6SS在SMA的耐药机制中均有相关报道^［9］，但关于其在多重耐药SMA中的检出率与耐药率之间的关系的研究较少，因此，本研究回顾性分析我院感染SMA患者的临床特征，分析T6SS的检出率及SmeABC、SmeDEF泵的表达水平与临床分离株抗菌药物耐药的相关性，以期为多重耐药SMA的临床防治提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集皖南医学院第二附属医院2021年3月至2024年2月192株非重复性SMA临床分离株，统计感染SMA患者的一般临床资料和相关数据。其中男性患者113例，女性患者79例，年龄为31~92岁，平均56.6岁。采集的样本包括痰液标本（113株，58.85%）、肺泡灌洗液标本（46株，23.96%）、咽拭子标本（23株，11.98%）、分泌物标本（5株，2.60%）、尿液标本（3株，1.56%）、胸腹水标本（2株，1.05%）。本研究经医院伦理委员会审核、批准。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及药敏试验

使用VITEK-2 Compact仪器（法国bioMerieux公司）进行细菌鉴定，使用VITEK 2药敏卡片和纸片扩散法（英国Oxoid公司）进行药敏试验。包括以下药物：庆大霉素、阿米卡星、复方新诺明、头孢他啶、头孢噻肟、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、米诺环素。根据《2022年版临床和实验室标准协会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）指南M100》对结果进行解读。质控菌株使用嗜麦芽寡养单胞菌 ATCC13637，来自安徽省耐药监测中心。

1.2.2 总DNA/RNA提取及逆转录

采用煮沸法提取细菌总DNA，用RNA提取试剂盒（美国Axygen公司）提取细菌RNA，参照说明书操作。检测A₂₆₀并计算A₂₆₀/A₂₈₀，采用A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8~2.0之间的样本，并逆转录成cDNA，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆转录试剂盒（日本TOYOBO公司），逆转录操作方法，取Rnase Free H₂O 8 μL，Primer Oligo（dT）20 μL，总RNA样本3 μL，65 ℃变性，5 min，取变性后的RNA 12 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mixture 1 μL，共计20 μL反应体积。逆转录反应条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.3 PCR扩增T6SS及SmeABC、SmeDEF

PCR检测T6SS保守序列基因hcp，以hcp检测阳性判定SMA菌株T6SS为阳性，使用SYBR Premix EX Taq™ Ⅱ（Takara公司）和 Roche light Cycle480荧光定量PCR扩增仪（瑞士 Roche公司）对SmeABC、SmeDEF进行荧光定量PCR。PCR引物使用Primer Express软件设计，由上海生工有限公司合成。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃延伸2 min。每个检测样本设置3个复孔，SmeABC、SmeDEF的相对表达水平以rDNA为内参，采用2^-△△Ct法计算，反应完成后取20 μL PCR产物，于120 V电压1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min后，使用紫外凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）在紫外光下成像拍摄。引物序列见表1。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0统计软件处理分析数据。计数资料以“例（%）”表示，组间比较用χ²检验。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。用GraphPad Prism 7.0对数据进行统计学分析及图片绘制。

2 结果

2.1 T6SS阳性组与阴性组的一般资料

将192例患者纳入研究，根据hcp检测是否阳性将感染SMA菌株的患者分为T6SS阳性组［T6SS（+）］和T6SS阴性组［T6SS（-）］，对2组患者的临床资料进行比较，结果显示，SMA菌株中T6SS阳性菌株共47株，阴性菌株共145株，2组患者的性别、年龄、基础疾病等比较差异均无统计学意义（P>0.05）。T6SS（+）组患者入住ICU及气管插管、胸腹引流管占比情况均高于T6SS（-）组（P<0.05），见表2。

2.2 T6SS（+）组与T6SS（-）组的药敏试验结果

经统计分析得出SMA对β内酰胺类的头孢噻肟、头孢他啶的耐药率较高，耐药率均>50%，对左氧氟沙星、米诺环素、氯霉素的耐药率较低，耐药率均<20%。统计结果显示，T6SS（+）组对β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类及复方新诺明的耐药率相较于T6SS（-）组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.001）。见表3。

2.3 SMA菌株耐药性与SmeABC、SmeDEF基因表达的相关性

采用荧光定量PCR检测192株SMA菌株中SmeABC、SmeDEF基因过表达情况，结果显示，114株（59.38%）过表达SmeABC基因，106株（55.21%）过表达SmeDEF基因。SmeABC过表达的菌株对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率明显高于SmeABC（-）组（P<0.05），SmeDEF过表达的菌株对氨基糖苷类庆大霉素、阿米卡星，喹诺酮类环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率明显高于SmeDEF（-）组（P<0.05）。见表4。

2.4 SMA菌株T6SS（+）组SmeABC、SmeDEF过表达情况

通过使用荧光定量PCR检测SMA菌株的Sme ABC、SmeDEF基因表达水平，结果显示，T6SS（＋）组SmeABC、SmeDEF表达量分别为11.318±4.526和19.694±7.817，相较于T6SS（-）组（2.053±1.712，3.175±1.681）表达量明显升高，差异具有统计学意义（t=22.361，26.766；P<0.001）。见图1。基因电泳结果中1~4泳道分别为SmeABC、SmeDEF表达阳性。见图2。

3 讨论

SMA作为医院获得性感染的主要病原菌，其临床感染分离率在非发酵菌属中的排名仅次于铜绿假单胞菌和不动杆菌^［10-11］，并且在免疫力低下的患者中表现出高发病率和高死亡率。由于近年来SMA对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类及磺胺类抗菌药物的耐药率持续升高，世界卫生组织也将其列为危害公共卫生安全的主要病原菌之一。随着对SMA耐药机制的深入研究，目前已发现多种耐药机制，包括产β-内酰胺酶（L1型、L2型）、氨基苷6’-N-乙酰转移酶、外排泵机制、膜通透性降低等。因此，细菌耐药性的监测对于抗菌药物的合理使用及耐药机制的研究有着极为重要的作用。本研究通过检测T6SS与外排泵基因SmeABC和SmeDEF的分布，探讨上述耐药机制与耐药性的相关性。

T6SS多发现于革兰氏阴性杆菌中，包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等。其在细菌定植、毒力及侵袭能力提高方面起到重要的作用。研究显示，T6SS能够促进细菌耐药基因的传递^［12］。刘丽娟等^［13］研究发现，在耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌中T6SS的检出率明显升高，同时携带有高毒力基因iucA、mrkD、rmpA2等。

在生物膜形成能力方面，T6SS阳性鲍曼不动杆菌在正常人血清中表现出更高的生物膜形成活性和更高的生存率，免疫功能低下及置入医疗器械的患者更易于感染^［14］。本研究结果显示，T6SS（＋）组SMA菌株对头孢他啶、头孢噻肟、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星及复方新诺明的耐药率相较于T6SS（-）组均明显升高，表明T6SS的检出与SMA多重耐药密切相关，且T6SS（＋）组患者在ICU入住比例、气管插管或切开、置入胸腹引流管患者中，占比明显高于T6SS（-）组，表明侵入性操作患者易感染T6SS阳性SMA。

多重外排泵系统在细菌耐药机制中扮演着重要的角色，有研究发现，MexAB-OprM外排系统在耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中起到了重要的作用，且生物膜形成能力与外排泵基因过表达存在正相关性^［15］。在对鲍曼不动杆菌外排泵与生物膜形成能力的研究中，使用外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）能够有效抑制其生物膜的形成，且生物膜的形成有助于鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药^［16］。外排泵SmeABC和SmeDEF均是与SMA耐药相关的重要机制。SmeT是SMA外排泵系统的转录阻遏因子，任何致使SmeT功能失活的突变，或者任何阻碍SmeT抑制蛋白与SmeD基因连接的突变都会导致SmeDEF基因的过度表达，使SMA产生耐药性^［17］。本研究结果显示，SmeABC过表达组对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率明显升高，SmeDEF过表达组对庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星左氧氟沙星的耐药率明显升高，且与T6SS的相关性分析结果显示，T6SS（＋）组SmeABC、SmeDEF表达量显著高于T6SS（-）组，差异具有统计学意义（P<0.001）。结果显示，T6SS阳性菌株携带外排泵基因SmeABC和SmeDEF的表达水平显著高于T6SS阴性菌株。

综上所述，SmeABC、SmeDEF在SMA T6SS阳性组中高表达，且对抗菌药物的多重耐药性显著增加，两者在多重耐药SMA中存在协同的作用，从而促进菌株产生耐药性。目前由于SMA耐药率不断升高，检测细菌耐药机制在治疗多重耐药菌株感染中极为重要。判定SMA感染能力、致病力与其产生生物膜及相关毒力基因是否相关，需要后续进一步的研究，以期为临床防治多重耐药菌株提供更坚实的理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81601806)