磷酸西格列汀中基因毒性杂质及其检测方法的研究进展

Research progress in the determination of genotoxic impurities in sitagliptin phosphate

摘要

目的 磷酸西格列汀作为广泛应用于2型糖尿病治疗的口服二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂，其安全性直接关系到众多糖尿病患者的健康。该文旨在为研究人员和监管机构提供关于磷酸西格列汀生产中可能产生的基因毒性杂质的综合信息，并为未来新合成路线中的基因毒性杂质筛查提供依据。 方法 检索了中国知网、PubMed、万方等数据库中与磷酸西格列汀合成相关的基因毒性杂质及其检测技术。 结果 总结了磷酸西格列汀常用合成途径中可能产生的10种潜在基因毒性杂质及相关检测手段。探讨了近年来在提高这些杂质检测灵敏度、特异性和准确性方面的进展。 结论 严格控制磷酸西格列汀在生产中产生的基因毒性杂质对于保障糖尿病患者的健康安全至关重要。

Abstract

Objective Sitagliptin phosphate is an oral dipeptidyl peptidase-Ⅳ inhibitor widely used in the treatment of type 2 diabetes. Its drug safety is very critical to the health of many diabetes patients. This article aims to provide comprehensive information for researchers and regulatory agencies on the potential genotoxic impurities in sitagliptin phosphate， and to provide a basis for screening genotoxic impurities in future synthetic routes of sitagliptin. Methods The potential genotoxic impurities and their detection methods in sitagliptin phosphate synthesis were systematically searched through databases such as CNKI， PubMed and Wanfang. Results This article summarized 10 types of potential genotoxic impurity that may be generated during the synthesis of sitagliptin phosphate. The detection progress in improving the sensitivity， specificity， and accuracy of these impurities in recent years were also discussed. Conclusion Strict control of the genotoxic impurities in the production of sigliptin phosphate is essential to ensure the health and safety of patients with diabetes.

Graphical abstract

关键词

磷酸西格列汀 / 基因毒性杂质 / 杂质检测

Key words

sitagliptin phosphate / genotoxic impurities / impurity detection

1 前言

磷酸西格列汀（sitagliptin phosphate）作为第一个被批准用于2型糖尿病患者的口服二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂，因其显著的降糖效果、良好的耐受性及易被接受的不良反应，已被作为口服降糖药物在全球范围内广泛使用^［1］。然而，随着药物安全要求的日益严格，磷酸西格列汀在生产过程中可能产生的基因毒性杂质（genotoxic impurity，GTI）问题逐渐成为研究的热点。GTI是指在较低浓度即可通过直接或间接作用损伤人体遗传物质，进而产生基因突变并具有致癌倾向的一类化合物。目前，市场上已发生多起因磷酸西格列汀基因毒性杂质残留超限量而致暂停销售并强行召回的案例^［2］。因此在药物的开发和生产过程中，对这些潜在的基因毒性杂质进行严格的控制和管理至关重要^［3］。磷酸西格列汀的合成涉及多个路径及步骤，包括多种反应中间体及化学产物，这为基因毒性杂质的产生提供了潜在的机会。本研究旨在总结当前磷酸西格列汀常用生产途径中可能产生的基因毒性杂质及其相关检测手段，期望能为研究人员及监管机构提供该药物生产中基因毒性杂质安全监管的综合性信息，给西格列汀生产过程中的质量控制提供技术支持，为未来该药物新合成途径的开发及基因毒性杂质的监测提供参考。

2 磷酸西格列汀合成中涉及的基因毒杂质及含量测定方法

目前，合成磷酸西格列汀的路线较多，其中最具有代表性的是将2，4，5-三氟苯乙酸与米氏酸缩合后，再与3-（三氟甲基）-1，2，4-三唑并［4，3-a］吡嗪盐酸盐缩合，经醋酸铵氨化后，再经不对称还原后成盐得到终产物磷酸西格列汀^［4］。本文以该合成途径为基础，对合成中可能涉及的潜在基因毒性杂质及其检测手段进行综述。

2.1 米氏酸

米氏酸（Meldrum’s acid）是一种具有强酸性的有机化合物，其在药物合成中特别是西格列汀的生产过程中具有重要应用。根据ICH M7指导原则推断，米氏酸可被视为潜在的基因毒性杂质，因此对成品中残留米氏酸含量的检测和控制变得尤为重要。传统的米氏酸含量测定方法如薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）和酸碱滴定法操作繁琐且准确性不足^［5］。现代分析技术，尤其是高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography， HPLC），已成为检测米氏酸含量的常用技术之一。刘云英等^［5］采用YMC-Triart C₁₈色谱柱和甲醇-磷酸二氢钾缓冲盐溶液作为流动相，建立了HPLC方法。该方法条件简单，但单针运行时间较长（20 min），且检测限较高（1 µg·mL^-1），难以满足磷酸西格列汀中痕量杂质米氏酸的检测要求。为了提高灵敏度和特异性，液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）被开发用于追踪极低浓度的米氏酸。周安琪等^［6］开发的LC-MS/MS方法，使用Waters CORTECS^®C₁₈色谱柱，实现了米氏酸的快速分析及良好分离。该方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）和检测限（limit of detection，LOD）分别为0.6、0.19 ng·mL^-1，平均回收率为98.2%，质量浓度在0.6~36.0 ng·mL^-1范围内重复性良好，灵敏度高，适用于制药行业对磷酸西格列汀中痕量杂质米氏酸的严格质量控制。

2.2 水合肼

在磷酸西格列汀的合成过程中，肼可能与溶剂中的水分反应生成水合肼（hydrazine hydrate），这是一种已知的基因毒性杂质，正常成人对肼的慢性毒理学限值为0.2 ppm·d^-1，在合成中应严格把控。尽管已有多种方法如离子色谱法（ion chromatography，IC），HPLC和气相色谱法（gas chromatography，GC）等用于检测肼类化合物，但由于肼类化合物的相对低分子质量和弱紫外吸收，仅使用这些方法通常无法达到所需的灵敏度^［7-9］。LC-MS/MS法可有效检测和定量药物中的微量水合肼，例如赵会明等^［9］建立的检测水合肼的LC-MS/MS法，质量浓度在0.47~9.37 ng·mL^-1范围内线性关系良好，LOD可达0.23 ng·mL^-1。但有研究^［8］发现，LC-MS/MS法受基质影响较大，灵敏度也较低，且在高浓度下可能导致色谱柱堵塞。相比之下，以丙酮-冰醋酸作为衍生化试剂的气相色谱-串联质谱法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）可有效减弱基质效应的影响，提高检测的灵敏度^［10-12］。李善金等^［12］通过将水合肼与丙酮反应生成二丙酮腙，并使用DB-1701（14%氰丙基-苯基）甲基聚硅氧烷毛细管柱，成功建立了一种灵敏度高、专属性强的GC-MS法。对磷酸西格列汀中水合肼进行含量测定，LOQ和LOD分别为10.4、3.1 ng·mL^-1，质量浓度在10.36~230.25 ng·mL^-1范围内线性关系良好，平均加标回收率为102%~112%，适用于磷酸西格列汀中水合肼的严格监控。

2.3 乙二胺

在药物合成中，乙二胺作为一种常用的中间体或试剂，在磷酸西格列汀的制备中扮演着关键角色。但其分子结构中存在的潜在警示结构可能导致其在合成过程中生成基因毒性杂质，给药物安全性带来风险。因此，在磷酸西格列汀的开发与生产中严格控制乙二胺的含量至关重要。目前用于乙二胺定量分析的方法有很多，如荧光光谱法、电位滴定法、IC法、HPLC和GC法等^［13-15］。但由于乙二胺的分子量小、易受样品基质干扰、缺乏发色基团和紫外吸收等特性，这些方法均难以实现对乙二胺的痕量级测定。穆丽娜等^［16］开发的衍生化HPLC-MS法能够有效地定量检测磷酸西格列汀中的潜在乙二胺。他们通过使用对甲苯磺酰氯作为衍生化试剂，将乙二胺转化为具有发色基团的乙二胺对甲苯磺酰氯衍生物，不仅提高了检测的灵敏度，还减小了对色谱柱的腐蚀性。结果显示，该方法在0.50~33.46 ng·mL^-1的质量浓度范围内线性关系良好，平均回收率达到102.4%，LOD低至0.50 ng·mL^-1，远低于根据毒理学关注阈值2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）原则计算的每日摄入安全限度11.45 ppm。此方法的专属性好、灵敏度高和准确性高，为确保磷酸西格列汀用药安全提供了有力保障。

2.4 氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯

氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯作为潜在的基因毒性杂质，在磷酸西格列汀合成中需严格控制。目前可以采用GC法和GC-MS法对其含量进行精准检测。因二者的结构及物理性质相似，传统GC填充柱难以有效分离，现代GC技术采用毛细管柱可提升其柱效和分析速度。此外，通过与不同检测器或质谱的联用，也可以进一步提高检测的灵敏度和准确性^［17］。翟华伟等^［18］比较了GC法中不同检测器对检测氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯这2种杂质的灵敏度。研究发现，ECD检测器具有更高的灵敏度（LOD为0.10 µg·mL^-1）。朱雪萍等^［19］利用VF-1701 ms色谱柱，成功建立了GC-MS法检测奥拉西坦原料药中的氯乙酸甲酯，该方法展现了良好的专属性和准确度（LOD为5 ng·mL^-1）。穆丽娜^［20］的研究证实了GC-MS法能有效检测磷酸西格列汀原料药中的氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯，具有良好的线性关系和高回收率（104.5%、103.3%），LOD分别为4.34、7.17 ng·mL^-1。该方法简便且专属性强，为检测氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯提供了可靠的技术支持。

2.5 磷酸三甲酯（trimethyl phosphate，TMP）和磷酸三异丙基酯（triisopropyl phosphate，TIP）

在磷酸西格列汀的生产中，甲醇和异丙醇作为溶剂，在加热条件下与磷酸反应，可能生成具有基因毒性的TMP和TIP。这2种化合物均为有机磷酸酯类基因毒性杂质，有潜在的致癌风险。按照TTC原则计算每日每人摄入限度为1.5 µg，应在药物生产过程中进行严格的监测和管理。常用的检测方法包括GC法、GC-MS法和LC-MS/MS法等^［21-23］。其中GC法较为常用，但该方法灵敏度较低，无法进行痕量检测。LC-MS/MS法是检测磷酸三甲酯的有效手段之一，朱红茹等^［22］开发的UPLC-MS法能有效测定磷酸西格列汀中的TMP和TIP，其中TMP和TIP的LOD分别为0.007 4、0.007 8 µg·mL^-1。尽管该方法灵敏度较高，但易受基质效应影响。精密度高、灵敏度好的GC-MS可能更适用于这类易挥发杂质的痕量检测。徐盼等^［23］使用DB-624毛细管柱和离子监测模式，实现了质量浓度在40.93~233.90 ng·mL^-1范围内对磷酸西格列汀中TMP的痕量检测。该方法具有较低的LOQ和LOD（分别为40.9、12.3 ng·mL^-1），以及良好的加样回收率（97.0%）和稳定性。此外，为了提高检测的准确性，前处理技术如固相萃取（solid phase extraction，SPE）和顶空分析法可用于样品的预处理，能够进一步富集目标杂质、降低样品的复杂性^［24］。

2.6 甲磺酸乙酯

在西格列汀的合成过程中，使用含有磺酸基团的原料或试剂可能在特定条件下与醇类发生酯化反应，生成磺酸酯类基因毒性杂质，如甲磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）。这类杂质已被确证具有致突变和致畸作用，根据ICH M7指导原则，按TTC法计算每日摄入限度为每人1.5 μg，因此其在磷酸西格列汀的生产过程中的控制和检测至关重要^［25］。目前，常用的测定方法主要有GC法和GC-MS法等。但GC法灵敏度较低，即使加入顶空前处理也仅适用于微克级别的检测^［26］。GC-MS是目前检测EMS等磺酸酯类基因毒性杂质最有效的方法^{［25，27-29］}。如刘颖娜等^［29］采用5%苯基-95%聚甲基硅氧烷为固定相的色谱柱开发的GC-MS方法，成功对磷酸西格列汀中的EMS进行了痕量检测。该方法质量浓度在0.05~20.00 µg·mL^-1的范围内显示出良好的线性关系，LOD值为1 ng·mL^-1。此外，很多研究将衍生化技术和顶空分析法用于样品处理以提高检测的灵敏度和选择性^［30-33］。刘晓强等^［31-32］均采用柱前NaI-H₂O碘化衍生对药品中的EMS进行了GC-MS检测，这些方法具有良好的线性关系，且回收率高，其中侯金凤等^［32］通过使用聚乙二醇为固定相的熔融石英毛细管柱，将LOD降至0.5 ng·mL^-1，更适用于EMS的痕量检测。

2.7 （R）-3-乙酰氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸甲酯

（R）-3-乙酰氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸甲酯是磷酸西格列汀合成中制备中间体时不可避免引入的杂质，很可能会传递到最终产物中。根据ICH M7指导原则评估，其可被认定为一种潜在的基因毒性杂质，因此建立该化合物的检测方法对于确保磷酸西格列汀的安全性和质量控制具有重要意义。周安琪^［34］采用Waters Xbridge BEH C₁₈色谱柱，成功建立了一种LC-MS/MS定量分析方法。该方法在0.26~32.21 ng·mL^-1的质量浓度范围内显示出良好的线性关系，平均回收率为100.89%，且LOQ和LOD分别为3.85、1.29 ng·mL^-1。该方法的重复性良好，专属性强，灵敏度高，分析时间短。目前关于（R）-3-乙酰氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸甲酯含量检测的信息较为有限，该方法为磷酸西格列汀原料药中该杂质的检测提供了有效的技术支持。

2.8 Nitroso-STG-19 （NTTP）

亚硝胺类化合物是已知的强致癌基因毒性杂质，即使是小剂量也可能导致动物癌症，且能通过胎盘和乳汁影响后代。NTTP作为一种亚硝胺类基因毒性杂质，在2022年被发现可能在西格列汀的合成中由合成中间体三氟甲基-5，6，7，8-四氢-1，2，4-三唑并-［4，3-α］-吡嗪盐酸盐（3-（Trifluoromethyl）-5，6，7，8-tetrahydro-［1，2，4］triazolo［4，3-a］pyrazine，TTP）与亚硝酸盐反应产生（见图1）。目前已在很多磷酸西格列汀的检品中发现了NTTP的存在，这引起了药物安全监测领域的广泛关注。澳大利亚治疗药品管理局、欧洲药品管理局及美国食品药品监督管理局等机构最初将NTTP的每日最大摄入量设定为37 ng·人^-1。但目前市面上很多西格列汀产品中的NTTP含量已超出该限制，若召回可能会导致西格列汀产品的短缺。因此评估后最终将每日最大摄入量调整为246.7 ng·人^-1［35］。

鉴于此，对西格列汀中NTTP的含量检测和控制具有重要意义。2022年WANG Z等^［36］开发了一种可有效检测磷酸西格列汀中的NTTP的HPLC-MS/MS法。该方法的专属性强，回收率高，质量浓度在0.5~100 ng·mL^-1范围内线性关系良好，灵敏度远优于亚硝胺类常见遗传毒性杂质N-亚硝基二甲胺的LOD（1 ng·mL^-1）。2023年袁松等^［35］建立了检测磷酸西格列汀制剂中的NTTP的UPLC-MS/MS法。结果显示，NTTP质量浓度在0.54~53.93 ng·mL^-1范围内具有良好的线性关系，回收率高，LOQ和LOD分别为0.08 、0.02 ng·mL^-1。应用此方法在4家原料厂家的12批样品及3批磷酸西格列汀片中均检出了NTTP。2024年JIREŠ J等^［37］建立了一种更为灵敏的UPLC-MS/MS检测方法，用于监测痕量NTTP。该杂质质量浓度在0.06~2.50 ng·mL^-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度高，专属性强，适用于筛查和测定磷酸西格列汀制剂中的微量NTTP。

2.9 5-［1-羟基-2-（2，4，5-三氟苯基）亚乙基］-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4，6-二酮

5-［1-羟基-2-（2，4，5-三氟苯基）亚乙基］-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4，6-二酮是磷酸西格列汀合成过程中的中间产物。根据ICH M7指导原则评估，其可被认定为一种潜在的基因毒性杂质，因此建立该化合物的检测方法对于确保磷酸西格列汀的安全性和质量控制具有重要意义。但目前，关于5-［1-羟基-2-（2，4，5-三氟苯基）亚乙基］-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4，6-二酮的含量检测的信息较为有限。周安琪^［34］选用Waters CORTECS^®C₁₈色谱柱，采用LC-MS/MS法对磷酸西格列汀原料药中残留的该基因毒性杂质进行了检测。结果表明，该杂质质量浓度在0.11~32.08 ng·mL^-1范围内线性关系良好，平均回收率为100.33%，LOQ和LOD分别为1.07、0.36 ng·mL^-1。该方法的重复性良好，专属性强，灵敏度高，分析时间短，可为磷酸西格列汀原料药中残留该杂质的检测提供帮助，弥补其检测方法空白。

2.10 氯甲烷、氯乙烷、氯乙酸及2-氯丙烷

磷酸西格列汀的中间体3-甲基-5，6，7，8-四氢-［1，2，4］三唑并［4，3-a］吡嗪盐酸盐的合成过程中使用了对氯乙酰氯，其水解产生的氯乙酸，可能会被带入到产物中。且在磷酸西格列汀的合成过程中，甲醇、乙醇和盐酸等试剂的大量使用可能导致氯甲烷和氯乙烷等杂质的产生。这些化合物已被归类为卤化烃类基因毒性杂质，具有3类致癌风险，表现出显著的扩散性和生殖毒性。根据ICH M7指导原则，采用TTC法通常设定为每人每日1.5 μg的基因毒性杂质摄入量^［25］。因此，必须严格控制这些杂质在磷酸西格列汀原料药中的含量，以保障患者的用药安全。氯甲烷和氯乙烷易挥发，通常采用GC法进行检测。穆丽娜^［20］及徐甲等^［38］均以DMSO为溶剂使用DB-624色谱柱开发的顶空气相色谱法（headspase gas chromatography， GC-HS）法可有效检测药物中氯甲烷的含量，灵敏度高，回收率高。王崇益^［39］也通过GC-HS法联合电子捕获检测器（electron capture detector， GC-HS-ECD）法，利用DB-5色谱柱成功检测了盐酸溴己新原料药中的氯甲烷，灵敏度高（LOD为0.010 1 µg·mL^-1）。此外，通过与质谱的联用，也可进一步提高检测的灵敏度和准确性。郑梅等^［40］采用GC-MS法使用DB-624UI色谱柱以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂检测药品中氯甲烷的含量，该方法的灵敏度高（LOD为50 ng·mL^-1）。

对于氯乙酸的检测，国内外报道的方法包括HPLC、IC、超高液相色谱-质谱联用法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）及GC-MS/MS等。但HPLC和IC无法满足对基因毒性杂质检测限的要求^［41-42］，UPLC-MS/MS虽然灵敏度高，但对色谱柱的要求较为特殊，限制了其应用范围。GC-MS/MS法是目前能够满足各方面检测需求的有效检测方法，胡松等^［43］建立了可有效检测饮用水中氯乙酸的GC-MS/MS法，但该方法在样品处理上较为复杂，需要4 ℃冷藏和较长的处理、衍生及提取时间。周安琪^［34］首次采用硫酸二甲酯对氯乙酸衍生化结合GC-MS/MS法，有效检测了磷酸西格列汀原料药中的残留氯乙酸。结果表明，氯乙酸质量浓度在176.56~706.23 ng·mL^-1范围内线性关系良好，该方法检测限低（LOD为53.0 ng·mL^-1），回收率高（平均回收率为97.15%），满足了对磷酸西格列汀中氯乙酸的基因毒性杂质的限度要求。

3 总结和展望

为了用药安全，各国针对不同药物剂量和暴露时间设定了ppm级别的严格分析检测限制，这进一步要求了更为灵敏和具有选择性的分析技术。对药物生产过程中潜在的基因毒性杂质进行精确量化是制药行业面临的一项核心挑战。目前，磷酸西格列汀的合成涉及多种原料药、中间体和试剂，其合成路径的复杂性预示着未来可能涌现更多的新合成方法和潜在的基因毒性杂质。因此，研发高效且准确的检测手段对于控制这些杂质至关重要。本文总结了目前相关研究中磷酸西格列汀在合成过程中可能出现的基因毒性杂质及其检测技术，展示了近年来在提升检测灵敏度、专属性和准确性方面取得的进展。未来研究应致力于进一步优化现有检测方法，缩短分析时间，提高灵敏度和准确性，以符合日益严格的药品安全监管标准。同时，深入探究基因毒性杂质的生成机制，将有助于更有效地控制和预防其产生，为确保磷酸西格列汀等药物的安全开发及用药提供坚实的技术支撑。

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基金资助

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