清肺十八味丸中非法染色剂808猩红的测定

Detection of illegally added 808 scarlet in Qingfei Shibawei Pills

摘要

目的 建立清肺十八味丸中非法染色剂808猩红的检测方法。 方法 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）色谱柱为Phenomenex Gemini C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈-体积分数0.1%甲酸（80∶20）；检测波长为518 nm；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL；流速为1.0 mL·min^-1。高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF/MS）液相色谱柱为Poroshell 120 EC-C₁₈（50 mm×3.0 mm，2.7 µm）；流动相为体积分数0.1%甲酸-乙腈（20∶80）；进样体积为1 µL；流速为0.2 mL·min^-1；质谱离子源为正电子电喷雾电离（positive electrospray ionization，ESI⁺）。 结果 HPLC法测得808猩红在6.875~343.750 ng范围内线性关系良好（r=0.999 6），平均加样回收率为98.76%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.22%（n=6）。LC/MS法测得供试品中相关离子峰及碎片特征与808猩红对照品一致。 结论 HPLC法操作简便，专属性强，重复性好，可用于清肺十八味丸中808猩红的初步确认，LC/MS法操作快速，可用于清肺十八味丸中808猩红的进一步确认，上述2种方法结合可用于清肺十八味丸的质量控制。

Abstract

Objective To establish a method for the detection of illegally added 808 scarlet in Qingfei Shibawei Pills. Methods High performance liquid chromatography （HPLC） method with a Phenomenex Gemini C₁₈ column （250 mm×4.6 mm， 5 µm） was applied. The injection volume was 10 μL at a flow rate of 1.0 mL·min^-1 with acetonitrile-0.1% formic acid （80∶20） as mobile phase. The wavelength was set at 518 nm and the column temperature was 30 ℃. HPLC-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF/MS） method was performed on a Poroshell 120 EC-C₁₈ column （50 mm×3.0 mm， 2.7 µm） in positive electrospray ionization （ESI⁺） mode， with acetonitrile-0.1% formic acid （80∶20） as mobile phase. The flow rate was 0.2 mL·min^-1 and the column temperature was 30 ℃. Results In HPLC method， the linear range of 808 scarlet was between 6.875 and 343.750 ng （r=0.999 6） with average recovery of 98.76%， RSD=1.22% （n=6）．‍ In LC/MS method， the molecular ion peaks and characteristic fragments in samples were consistent with those of the 808 scarlet control sample. Conclusion The HPLC method is easy to be operated， and it can achieve specificity and high repeatability， and can be used for the preliminary confirmation of Qingfei Shibawei Pills. The LC/MS method is fast and can be used for further confirmation of Qingfei Shibawei Pills. The combination of the above 2 methods can be used for the quality control of Qingfei Shibawei Pills.

Graphical abstract

关键词

清肺十八味丸 / 808猩红 / 含量测定 / 高效液相色谱法 / 四级杆飞行时间液质联用

Key words

Qingfei Shibawei Pills / 808 scarlet / content analysis / high performance liquid chromatography / high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry

清肺十八味丸处方由石膏、牛黄、红花、檀香、降香、拳参、麝香、黑云香、草乌叶、诃子、木香、银朱、甘草、北沙参、沉香、肉豆蔻、苦参、蒜炭共18味中药材组成。在国家药品监督管理局近年来组织开展的中药饮片违法染色问题专项抽检中发现，药材中非法使用808猩红染色时有发生，808猩红为偶氮类化工染色剂，其在体内经过生物转化分解，可引起中毒性肝病，甚至导致癌变^［1-2］。清肺十八味丸现行标准为卫生部药品标准（蒙药分册）ZZ-8400，其中没有808猩红检查项^［3］。清肺十八味丸为《新型冠状病毒感染的肺炎蒙医药预防和诊疗方案》（试行第二版、第三版）收载品种，明确该制剂可用于治疗新型冠状病毒感染。本研究参考国家药品监督管理局检验补充检验方法及相关文献^［4-8］，建立清肺十八味丸中非法添加808猩红的检测方法，用于市售多批次清肺十八味丸样品检测，旨在有效控制清肺十八味丸的内在质量，保障用药安全。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（美国沃特世公司）；Agilent 6530B Accurate-Mass型四级杆飞行时间液质联用系统（high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF/MS）（美国安捷伦科技有限公司）；Sartorius BP211D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KH-700DE型数控超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药

808猩红对照品（批号111940-201804，中国食品药品检定研究院）；清肺十八味丸（A厂批号：20180612、20180919、20190104、20190207、20190432、20190513、20190523；B厂批号：1801029、2012040；C厂批号：18459002、19459001；D厂批号：180914、200107；E厂批号：180705、191242）；乙腈（色谱级）、乙醇（色谱级），均购自德国默克公司；甲酸（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取808猩红对照品约10 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液^［9］。精密量取对照品储备液2 mL，置于20 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为10.21 µg·mL^-1的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取清肺十八味丸样品适量，研细，称取0.2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL乙醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.3 LC-MS法测定808猩红

2.3.1 色谱条件

采用Poroshell 120 EC-C₁₈（50 mm×3.0 mm，2.7 µm）色谱柱。流动相为体积分数0.1%甲酸-乙腈（20∶80）；进样量为1 µL；流速为0.2 mL·min^-1。

2.3.2 质谱条件

采用电喷雾电离（electrosprayionization，ESI）正离子模式；毛细管电压为4 000 V；毛细管出口电压为100 V；干燥气温度为325 ℃；干燥气流速为8 L·min^-1；雾化器压力为35 psig；碰撞能量为10 v；扫描范围为100~1 000 m/z。

2.3.3 专属性实验

取2.1项下808猩红对照品溶液和2.2项下供试品溶液各1 mL，置于20 mL量瓶中，按照2.3.1项下的色谱条件和2.3.2项下质谱条件进样。结果显示，清肺供试品溶液与808猩红对照品溶液在同一保留时间下出现相同的离子峰，且一级、二级质谱均与808猩红对照品一致。见图1、图2和表1。

2.4 HPLC法测定808猩红

2.4.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱为Phenomenex Gemini C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈-体积分数0.1%甲酸（80∶20）；检测波长为518 nm；柱温为30 ℃；进样体积为10 µL。理论板数按808猩红计算不低于2 000^［10］。

2.4.2 专属性实验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，结果显示阳性供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间出现色谱峰，而阴性供试品溶液则无相应的对照品色谱峰。见图3。

2.4.3 精密度实验

精密吸取2.1项下808猩红对照品溶液10 μL，按照2.4.1项下色谱条件连续进样6次，测得808猩红峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.63%，表明仪器的精密度良好。

2.4.4 重复性实验

取同一批号（A厂，批号20190104）样品6份，精密称定，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.4.1项下色谱条件测定。测得808猩红峰面积的RSD为1.41%，表明该方法的重复性良好。

2.4.5 稳定性实验

取同一批号（A厂，批号20190104）样品6份，精密称定，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h按照2.4.1项下色谱条件测定，测得808猩红峰面积的RSD为1.02%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 线性关系考察

取808猩红对照品约14 mg，精密称定，置于200 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品母液。分别精密量取对照品母液1、1、1、2、3、2、5、5 mL，分别置于100、50、20、20、20、10、20、10 mL量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，即得系列梯度浓度对照品工作液。按照2.4.1项下色谱条件进样分析。以808猩红的质量（ng）为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，得回归方程：y=3 005.6x+2 481.7（r=0.999 6）。808猩红含量在6.875~343.75 ng范围内线性关系良好。通过信号与噪声的比值即信噪比（signal-noise ratio，S/N）来确定检测限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），S/N为3时即为LOD，S/N为10时即为LOQ。该方法的LOD为1.2 ng，LOD为5.0 ng。

2.4.7 加样回收实验

取已知808猩红含量的同一批样品（A厂，批号20180919）约0.1 g，精密称定，共6份。分别精密加入0.011 52 mg·mL^-1 808猩红对照品溶液10 mL。按照2.2项下方法制备供试品溶液，测定808猩红含量，计算回收率。见表2。

2.4.8 样品测定

取5家生产企业15批次清肺十八味丸样品，按照2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，检出批次样品再用LC/MS进行确认，共检出6批（涉及1个厂家），结果见表3。

3 讨论

在808猩红含量测定过程中，本文分别考察了3种流动相：乙腈-0.02 mol·L^-1醋酸铵体系、乙腈-水体系、乙腈-体积分数0.1%甲酸体系，结果表明，以乙腈体积分数-0.1%甲酸体系为流动相进行洗脱分离时所得色谱峰的峰形对称，分离度大，理论塔板数较高。

考虑到清肺十八味丸的包衣材料为银朱，分别以甲醇、乙醇、三氯甲烷作为提取溶剂，以加热回流、超声进行提取。超声提取时间分别为30、40、50 min。结果显示，选用乙醇作为提取溶剂，超声提取30 min，清肺十八味丸中808猩红已经提取完全。

针对染色来源问题，涉及808猩红染色的药材主要集中在西红花、血竭和朱砂三味药材^［11-14］。本研究在A厂生产的清肺十八味丸中检出808猩红成分，同时收集该企业药品处方中含银朱药材的其他制剂，在同期生产的其他药品中，多批次样品也检出808猩红成分，在市售银朱药材中也检出多批次含有808猩红，基本可以确定银朱药材染色是808猩红来源。《本草纲目》中记载“银朱，乃硫黄同汞升炼而成，其性燥烈，亦能烂龈挛筋，其功过与轻粉同也。”《上海市中药材标准（1994年版）》收载银朱药材，银朱为人工合成的赤色硫化汞。无机化合物，分子式为HgS，鲜红色粉末，有毒。目前银朱主要是蒙药制剂用得较多。收集了安徽亳州药材市场和河北安国药材市场23批次的市售银朱药材并进行实验分析。结果表明，808猩红检出率高达60.8%，808猩红含量在0.069 9~5.358 9 mg·g^-1范围内。

HPLC法测定清肺十八味丸中808猩红，必要时用LC-MS确认，该方法准确度高且专属性很强。在开展清肺十八味丸中808猩红的方法学验证时，严格按照《中华人民共和国药典》（2020年版）通则9101项分析方法验证，认真考察专属性、精密度、检测限、耐用性等指标。液质联用技术是以液相色谱为分离系统、以质谱为检测系统的检测技术。样本在质谱系统和流动相分离，再经离子化处理后，通过质谱的质量分析器能将离子碎片依据质量进行分离，经过检测器后得到质谱图。液质联用体现了色谱技术与质谱技术的优势互补，同时具有色谱对复杂检测对象的分离能力与质谱检测的高选择性、高灵敏度优势，在药物检测、食品分析等领域中具有重要的作用。HPLC-DAD-MS联用法具有专属性强、灵敏度高、分离能力强、适应性广泛等优点，是目前相对直接、有效的分离分析检测方法，以确保清肺十八味丸中808猩红检验方法的专属性、科学性。

本研究建立的HPLC法操作简便，专属性强，重复性好，可用于清肺十八味丸中808猩红的初步确认，LC/MS法操作快速，可对清肺十八味丸中808猩红进行进一步确认，上述2种方法结合可用于清肺十八味丸的质量控制。

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基金资助

国家药品监督管理局药品补充检验方法项目(2022020)