青蒿抗炎部位提取工艺的优化

Optimization of the extraction process of anti-inflammatory part from Artemisia caruifolia Buch.-Ham. ex Roxb.

摘要

目的 优化青蒿抗炎有效部位的提取工艺，并评价其抗炎活性。 方法 采用正交实验设计考察料液比、乙醇体积分数、提取温度和提取时间对从青蒿中提取抗炎有效部位的影响，确定最佳提取工艺参数；建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW 264.7细胞炎症模型，通过测定一氧化氮（nitric oxide，NO）含量体外评价青蒿提取物的抗炎活性；通过建立二甲苯致小鼠耳肿胀模型体内验证青蒿提取物的抗炎作用。 结果 从青蒿中提取抗炎有效部位的条件是料液比为1∶5、乙醇体积分数为80%、提取温度为70 ℃、提取时间为2 h。青蒿提取物能够显著降低RAW 264.7炎症细胞的NO、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，同时可减轻二甲苯致小鼠耳肿胀的程度。 结论 确定了从青蒿中获得最佳抗炎提取物的制备工艺，为拓宽青蒿药材的药效应用提供科学依据。

Abstract

Objective To optimize the extraction process of anti-inflammatory components of Artemisia caruifolia Buch.-Ham. ex Roxb. and to evaluate their anti-inflammatory activity. Methods First， orthogonal experiments were conducted to investigate the effects of solid-liquid ratio， ethanol concentration， extraction temperature and extraction time on the preparation of anti-inflammatory extracts， and thereby confirming optimal parameters of the extraction process. Then， inflammatory model was established on RAW 264.7 cell with lipopolysaccharide （LPS）. Nitric oxide （NO） content was measured to evaluate the anti-inflammatory effect of the extract from Artemisia caruifolia. Finally， the anti-inflammatory activity was in-vivo validated on the mouse model of ear swelling induced by xylene. Results The optimal extraction parameters of anti-inflammatory effective part from Artemisia caruifolia were determined as follows： A solid-liquid ratio of 1∶15， an ethanol concentration of 80%， an extraction temperature of 70 ℃ and an extraction time of 2 hours. The active components from this plant with this extraction process can significantly reduce the concentrations of NO， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in RAW 264.7 inflammatory cells， and reduce the degree of ear swelling induced by xylene in mice. Conclusion This study established the preparation procedure for the optimally anti-inflammatory extract from Artemisia caruifolia， providing a scientific basis for expanding the medicinal application of this plant.

Graphical abstract

关键词

青蒿 / 抗炎活性 / 单因素实验 / 正交实验 / 体内外验证

Key words

Artemisia caruifolia Buch.-Ham. ex Roxb / anti-inflammatory active / single factor experiments / orthogonal experiments / verification in vivo and in vitro

青蒿为菊科蒿属植物青蒿Artemisia caruifolia Buch.-Ham.ex Roxb.的干燥地上部分，主要分布于陕西南部、山东、江苏以及安徽等地。青蒿具有清退虚热、凉血解暑、治疗疟疾的功效，用于疟疾、炎症及心血管疾病的治疗^［1-2］。研究发现，青蒿中含有倍半萜、二萜、黄酮、生物碱、香豆素、木脂素和挥发油等活性成分，可用于抗炎、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒以及调节免疫等^［3-7］。

青蒿富含萜类成分，尤其是以倍半萜类青蒿素为代表。张书滔等^［8］报道了青蒿素可能通过瞬时受体电位香草醛亚家族1（transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1）通路在星形胶质细胞炎症中发挥抗炎作用。朱溶月等^［9］建立了一种以己二酸二酰肼（adipic dihydrazide，ADH）为连接臂的透明质酸-青蒿琥酯聚合物胶束，从而特异性靶向杀伤脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症巨噬细胞。殷少杰等^［10］报道了青蒿琥酯（artesunate，ARS）通过调控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的磷酸化水平和炎症细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达，抑制内质网应激及其下游信号通路的过度激活，进而抑制结肠炎症。上述研究表明青蒿具有潜在的抗炎作用，但关于提取青蒿抗炎活性部位工艺的研究尚未见报道。因此，本研究建立以LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞的炎症模型，探讨不同参数提取青蒿抗炎活性部位的差异，从而确定青蒿抗炎部位的最佳提取工艺，再通过体外和体内实验确定青蒿提取物的抗炎活性，为拓宽青蒿药材的应用范围提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HH-6型恒温水浴锅（杭州旌斐仪器科技有限公司）；AS 220.X2型电子天平（苏州培科实验仪器科技有限公司）；BJ-88A型多功能粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）；R213B型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；SHZ-ⅢA型真空泵（西安莫吉娜仪器制造有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UMR-9600型全自动酶标仪（杭州优米仪器有限公司）；3111型二氧化碳培养箱、Protect-2F0-S型细胞超净台，均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 试药

一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒、脂多糖均购自碧云天生物技术有限公司；小鼠TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，均购自江苏晶美生物工程有限公司；改良的Eagle培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清、质量分数0.25%胰酶，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；地塞米松（dexamethasone，DXMS）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

青蒿于2023年6月购自安徽亳州中药材市场，经西安交通大学药学院郭增军教授鉴定为菊科蒿属植物青蒿Artemisia caruifolia Buch.-Ham. ex Roxb.的地上部分。

1.3 细胞与动物

小鼠巨噬细胞系RAW264.7，购自武汉普诺赛生命科技有限公司；无特定病原体（specific pathogen free，SPF）雄性昆明小鼠25只，购自西安交通大学医学部实验动物中心，体质量为（20±0.2） g，饲养在温度20~25 ℃，相对湿度40%~70%，光照12 h的SPF环境中，期间自由进食和饮水。垫料每2~3 d更换1次，饲料、垫料和饮水均经高温灭菌后使用，动物于实验前适应实验室环境1周。

2 方法与结果

2.1 青蒿提取物的制备

对青蒿原药材进行粗筛，挑选无腐烂、无变质的茎段，粉碎，过2号筛，备用。青蒿提取物制备方法参照文献^［11］并加以改进，采用乙醇回流提取技术，取青蒿药材约1 g，精密称定，遵循单一变量对照原则，在控制其余因素水平不变的情况下，分别对料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）；提取温度（40、50、60、70、80 ℃）；提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）和乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）进行考察。对药材采用回流提取处理，提取液过滤后，经旋转蒸发仪浓缩，取青蒿提取物适量，加入乙醇配置成质量浓度为10 mg·mL^-1的青蒿提取物母液，避光保存，备用。

2.2 提取工艺单因素考察

将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7置于温水中复苏，以1 000 r·min^-1离心 5 min，用PBS缓冲液清洗沉淀残留物，离心后再用完全培养基混悬。随后转移至25 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂细胞培养箱中孵育。采用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基进行传代培养，隔天对细胞形态进行观察。传至2~3代后，取对数生长期细胞进行实验。

选取生长状态良好的RAW 264.7细胞，按照1×10⁴个·孔^-1接种于96孔板，置于37 ℃、体积分数5% CO₂细胞培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后，分为空白组、对照组、LPS组、LPS+地塞米松组及青蒿提取液Ⅰ~Ⅴ组^［12］。空白组仅加入培养基；在空白组基础上，对照组进行细胞铺板处理； LPS组给药50 µL质量浓度2 mg·mL^-1的LPS进行炎症造模，LPS+地塞米松组在LPS组给药基础上给予50 µL质量浓度2 mg·mL^-1地塞米松，各药物干预组分别给予50 µL质量浓度2 mg·mL^-1不同提取工艺制备的青蒿提取液。每组均设置3个复孔。细胞孵育24 h后，于540 nm波长处测定吸光度值，重复3次。同时根据试剂盒方法建立NO释放量标准曲线，通过标准曲线计算各因素水平下RAW 264.7细胞NO的释放量^［13］。

2.2.1 料液比

分别考察料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30时青蒿提取物对细胞体外抗炎活性的影响。结果显示，随料液比增大，NO释放量呈先降低后升高，而后再降低的变化趋势。当料液比为1∶15时，NO释放量最低。料液比为1∶20~1∶30时，NO释放量降低可能是因为该条件下提取物中毒性成分的含量增加，细胞存活率降低，从而影响NO释放量。因此，选择料液比1∶10、1∶15、1∶20进行正交实验。见图1。

2.2.2 乙醇体积分数

分别考察乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%时，提取物对RAW 264.7细胞体外抗炎活性的影响。结果显示，当乙醇体积分数为70%时，NO释放量最低，此时抗炎效果最好。随着提取液中乙醇体积分数增大，其他脂溶性物质溶出体积分数增大，影响NO释放量。因此，选择乙醇体积分数60%、70%、80%进行正交实验。见图2。

2.2.3 提取温度

分别考察提取温度为40、50、60、70、80 ℃时，提取物对RAW 264.7细胞体外抗炎活性的影响。结果显示，随着提取温度的升高，NO释放量缓慢降低，当提取温度为70 ℃时，NO释放量最低，此时青蒿提取物的抗炎效果最佳，进一步升高温度后，NO释放量明显升高。因此提取温度选择60、70、80 ℃进行正交实验。见图3。

2.2.4 提取时间

分别考察提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时，提取物对RAW 264.7细胞体外抗炎活性的影响。结果显示，提取时间对NO释放量的影响较大，随着提取时间增大，NO释放量呈先降低后升高趋势，当提取时间为1.5 h时NO释放量最低，此时抗炎效果最好。因此选取1.0、1.5、2.0 h进行正交实验。

2.3 正交实验

在单因素实验结果的基础上，以NO释放量为响应值，最优单因素实验结果为中值变量设计L₉（3⁴）正交实验^［14］，实验设计见表1，按照2.2项下方法进行实验，从而优选出最佳提取工艺。

正交实验结果显示，各处理因素对青蒿提取物的抗炎作用均有影响，其中料液比：K₂<K₁<K₃，提取温度：K₂<K₁<K₃，提取时间：K₃<K₁<K₂，乙醇比例：K₃<K₁<K₂，K值越小表示该水平对青蒿提取物的抗炎作用影响越大，因此最佳提取工艺为A₂B₂C₃D₃，即当料液比为1∶15，提取温度为70 ℃，提取时间为2.0 h、乙醇体积分数为80%时，青蒿提取物的抗炎活性最好。见表2。

方差分析结果显示，提取时间显著影响青蒿提取物的抗炎作用（P<0.05），而料液比、提取温度和乙醇体积分数影响不显著，表明在实际生产过程中需要严格控制提取时间，避免因长时间过度提取或提取不完全而对青蒿提取物的抗炎活性产生影响。见表3。

通过各因素对青蒿抗炎活性影响程度的均值响应分析，旨在明确各因素对提取物抗炎效果的重要程度。排秩结果显示，各影响因素对青蒿提取物抗炎作用的影响排序为：提取时间（C）>提取温度（B）>料液比（A）>乙醇比例（D），这一结果与单因素考察结果基本吻合。见表4。

2.4 验证实验

2.4.1 体外验证实验

以正交实验结果为最优提取工艺进行体外抗炎活性验证，按照2.2项下方法进行实验，平行进行3组。按照文献报道方法^［15］，检测RAW 264.7细胞中NO、TNF-α、IL-6的释放量。结果显示，此工艺下得到的青蒿提取物对LPS诱导产生的炎症具有显著抑制效果（P<0.01），NO释放量为8.02 μmol·L^-1，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.08%；TNF-‍α释放量为205.10 pg·mL^-1，RSD为0.84%；IL-6释放量为51.06 pg·mL^-1，RSD为0.20%。

2.4.2 体内验证实验

以正交实验结果为最优提取工艺进行体内抗炎活性验证，小鼠适应性饲养2 d后，按照生理盐水组（20 mg·mL^-1）、地塞米松阳性药组（3 mg·mL^-1）、青蒿低剂量组（20 mg·mL^-1）、青蒿中剂量组（40 mg·mL^-1）和青蒿高剂量组（60 mg·mL^-1）进行随机分组，灌胃给药0.2 mL，每日1次，连续7 d。末次给药0.5 h后将0.05 mL二甲苯均匀涂抹于小鼠左耳两面诱导产生炎症^［16］，其右耳不做处理，作为对照，30 min后脱颈椎处死，沿小鼠耳廓剪下双耳，用直径6 mm打孔器在左、右耳相同位置处冲下圆形耳片，分别称质量，计算肿胀度和肿胀抑制率。肿胀度（mg）=左耳质量（肿胀耳）-右耳质量（对照耳）；肿胀抑制率（%）=［（对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/对照组平均肿胀度］✕100%。

2.4.3 统计学方法

实验结果数据用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计量资料以（\overline{x}±s）表示，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

与生理盐水组小鼠相比，地塞米松阳性对照组小鼠耳朵肿胀度最小，其肿胀抑制率可达到64.84%（P<0.01）；而青蒿低、中、高剂量组对小鼠耳肿胀呈现不同程度抑制作用，低剂量组肿胀抑制率为43.96%（P<0.05），中剂量组为49.45%（P<0.01），高剂量组为57.14%（P<0.01），结果表明该优化工艺下青蒿提取物具有显著抗炎作用，且表现出浓度依赖的特点，随着青蒿提取物浓度的增加，其抗炎作用显著增强。相较于地塞米松组，青蒿提取物低剂量组的抗炎效果较弱，青蒿提取物高剂量组的抗炎作用相对较强，表明一定浓度的青蒿提取物可产生类似阳性药地塞米松的作用。见表5。

3 讨论

青蒿作为一种传统中药材，《神农本草经》中记载其具有“主疥瘙痂痒，恶疮，杀虱，留热在骨节间，明目”等功效^［17］。本研究针对青蒿抗炎活性开展研究，以体外抗炎活性为导向，NO释放量为指标开展工艺优化实验，分别以料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度进行单因素实验，并在单因素实验基础上设计了L₉（3⁴）正交实验。体外研究结果表明，当料液比为1∶15，提取温度为70 ℃，提取时间为2.0 h和乙醇比例为80%时，青蒿提取物的抗炎活性最好。

在验证实验中，细胞实验表明最佳工艺下的青蒿提取物能显著抑制LPS诱导RAW 264.7细胞炎症的发生（P<0.01）：NO释放量为8.02 µmol·L^-1，RSD为2.08%；而TNF-α释放量为205.10 pg·mL^-1，RSD为0.84%；IL-6释放量为51.06 pg·mL^-1，RSD为0.20%。体内验证实验表明，与生理盐水组相比，各剂量青蒿提取物均对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著抑制作用（P<0.05），随着青蒿提取物浓度增大，二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制程度增强，具有明显的浓度依赖特性。其中高剂量青蒿提取物组的耳肿胀抑制率达到57.14%，炎症抑制效果显著。

作为一种临床常用中药，青蒿在抗炎、抗疟以及抗肿瘤等方面应用广泛。通过确定青蒿抗炎部位的最佳工艺，为青蒿资源的开发并推动其抗炎药物研发提供科学基础和理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81603267)

陕西省秦创原“科学家+工程师”队伍建设项目(2022KXJ-131)

中医药防治新冠病毒科研攻关项目(ZYJXG-Y23008)