GC-MS指纹图谱结合化学模式识别评价不同种类苍术的质量

Quality evaluation of different kinds of Atractylodis Rhizoma by GC-MS fingerprinting with chemical pattern recognition

摘要

目的 建立不同种类苍术的气相色谱-质谱联用（ gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指纹图谱，并结合化学计量学方法评价苍术药材的质量。 方法 色谱条件为HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），采用程序升温，质谱条件为电子轰击电离（electron impact ionization，EI）离子源，电子能量为70 eV，在GC-MS图谱的基础上采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统及聚类分析、主成分分析进行化学模式识别方法分析。 结果 通过指纹图谱相似度发现，43批苍术药材的GC-MS指纹图谱中发现17个共有峰及5个差异峰，不同品种苍术组内相似度均达到0.823。指纹图谱可以区分不同品种苍术，聚类分析与主成分分析的结果一致，且共有模式也能区分茅苍术、北苍术和关苍术。 结论 建立的苍术药材质量评价方法操作简便，重复性好，结果可靠，可用于苍术药材的质量控制和评价。

Abstract

Objective To establish gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） fingerprints of various types of Atractylodis Rhizoma， and to utilized chemometrics for quality evaluation. Methods GC-MS analysis was conducted using an HP-5MS column （30 m×0.25 mm， 0.25 μm） with an electron impact ionization （EI） ion source and a 70 eV electron multiplier alongside the similarity evaluation system of Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprints， cluster analysis， and principal component analysis software to analyze the chemical pattern recognition methods. Results By calculating the similarity of the fingerprints， 17 common peaks and 5 uncommon peaks were identified across 43 sample batches， achieving a similarity score of 0.823. The fingerprints effectively discriminated between different varieties of Atractylodis Rhizoma. Consistent results were obtained from both principal component analysis and cluster analysis， enabling the clear distinction among Atractylodes lancea， Atractylodes chinensis， and Atractylodes japonica. Conclusion The proposed method is straightforward， reproducible， and reliable， making it suitable for the quality control and evaluation of various types of Atractylodis Rhizoma.

Graphical abstract

关键词

苍术 / 气相色谱-质谱联用 / 指纹图谱 / 化学计量学 / 质量评价 / 化学模式识别

Key words

Atractylodis Rhizoma / gas chromatography-mass spectrometry / fingerprint / chemometrics / quality evaluation / chemical pattern recognition

苍术为菊科苍术属多年生草本植物茅苍术Atractylodes lancea （Thunb.） DC.或北苍术Atractylodes chinensis （DC.） Koidz.的干燥根茎^［1］。近年来，随着对苍术的研究逐步深入，其在临床上的应用越来越广泛，使市场需求量不断增大，药材价格逐年上升，苍术野生资源锐减^［2］。然而，市面上出现同为苍术属的关苍术，但未被《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）收载，被视作苍术的伪品。其有效成分与正品苍术存在差异，这直接影响苍术的药理作用和临床疗效^［3］。其外观与茅苍术、北苍术相似，靠肉眼难以识别，出现真伪混卖的现象。若临床上出现混用或误用，会影响疗效，耽误患者病情，更甚者造成其他严重后果。因此，对苍术进行鉴别和质量控制尤为重要，以保证患者的用药安全。

苍术药理活性多样，药理活性成分主要是丰富的挥发油^［4］。其药效不是由单一活性成分产生，而是靠多种成分的协同作用^［5-6］。仅对1个或几个成分进行质量评价是不科学的，需要从宏观的角度分析中药的真伪和优劣。中药指纹图谱是中医药学领域重要的质量评价方法，是评价中药优劣、对中药进行分类鉴定和保证其化学成分稳定性和一致性的有效方法，是中草药产品评估和质量控制普遍认可的技术^［7-9］。气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是在气相色谱与质谱的基础上，结合气相色谱高效分离与质谱对化合物的结构鉴定能力的优势，是目前药物挥发性成分的常用测定方法，广泛用于复杂物质的分离和鉴定^［10-12］。本研究采用GC-MS法在相同色谱条件下建立3种苍术的特征性指纹图谱，并运用指纹图谱相似度评价软件，结合主成分分析、系统聚类分析等化学计量学方法，分析3种苍术间的内在差异，完善苍术的质量评价系统，以确保其临床疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器

7890B/5977A型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；BT125D型电子天平（德国赛多利斯公司）；SK5200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

正己烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。本研究收集了不同产地的43批苍术药材，所有样品均由上海中医药大学赵志礼教授鉴定为菊科植物茅苍术A.lancea （Thunb.） DC.，北苍术A.chinensis （DC.） Koidz.及关苍术A. japonica Koidz.ez Kitam.的干燥根茎，见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用HP-5MS气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气，流量为1 mL·min^-1；进样口温度为250 ℃；分流比为20∶1；升温程序：柱温80 ℃保持3 min；以20 ℃·min^-1的速率升至90 ℃，保持5 min；以15 ℃·min^-1的速率升至100 ℃，再以5 ℃·min^-1的速率升至155 ℃，保持5 min；以10 ℃·min^-1的速率升至200 ℃，再以5 ℃·min^-1的速率升至250 ℃，保持5 min；进样量为1 μL，传输线温度为250 ℃。

2.2 质谱条件

采用电子轰击电离（electron impact ionization，EI）离子源；离子源温度为230 ℃；电子能量为70 eV；质量扫描范围为35~550 amu；容积延迟为5 min。

2.3 参照峰的确定

按照2.1项下色谱条件和2.2项下质谱条件进行实验，苍术素色谱峰（16号峰）保留时间适中，峰面积稳定，与相邻色谱峰基线分离良好，故选苍术素色谱峰（16号峰）为指纹图谱内参照峰。

2.4 供试品溶液的制备

取苍术粉末约2.0 g，过60目筛，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入10 mL正己烷，称定质量，超声30 min，取出放冷，再次称定质量，用正己烷补足减失的质量，滤过，将滤液全部转移至10 mL量瓶中，用正己烷定容至刻度线，摇匀，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验

取供试品（编号为S1）粉末适量，按照2.4项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件连续测定6次，以苍术素色谱峰（16号峰）为参照峰，计算17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）范围为0.002 6%~0.013 0%，相对峰面积RSD范围为0.73%~1.90%，表明该方法的精密度良好。

2.5.2 重复性实验

取供试品（编号为S1）粉末6份，按照2.4项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，以苍术素色谱峰（16号峰）为参照峰，计算17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD范围为0.024%~0.080%，相对峰面积RSD范围为0.57%~1.70%，表明该方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性实验

取供试品（编号为S1）粉末适量，按照2.4项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，以苍术素色谱峰（16号峰）为参照峰，计算17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。计算得各共有峰相对保留时间RSD范围为0.003 1%~0.023 0%，相对峰面积RSD范围为0.58%~1.90%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 GC-MS分析

取供试品粉末适量，按照2.4项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 μL，注入气相色谱质谱联用分析仪，按照2.1项下色谱条件和2.2项下质谱条件测定，得43个苍术药材样品的总离子流图（total ion chromatogram，TIC）。见图1。

对43个苍术样品的GC-MS结果进行分析，对检出的每个色谱峰经惠普质谱检测仪（Hewlett-Packard mass selective detector，HP-MSD）化学工作站检索质谱图库并结合有关文献确定化合物。从43个GC-MS结果中共检识出17个主要的共有成分。见图2，表2。

2.7 指纹图谱相似度评价

将所得43批茅苍术样品的GC-MS图谱依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，经多点校正，进行自动色谱峰匹配，分别建立12批茅苍术，23批北苍术及8批关苍术样品的色谱指纹图谱，并生成共有模式图谱，同时进行相似度评价。结果显示，12批茅苍术样品与对照图谱的相似度为0.962~1.000，23批北苍术样品与对照图谱的相似度为0.823~0.974，8批关苍术样品与对照图谱的相似度为0.979~0.993。见表3至表5，图3至图6。

2.8 数据处理

选取茅苍术、北苍术、关苍术的17个共有峰及5个主要的差异峰（18~22号峰），见图2。基于峰面积，形成22×43阶数据矩阵，运用SIMCA 13.0软件进行主成分分析及系统聚类分析。

2.8.1 主成分分析（principal component analysis，PCA）

PCA是数据分析中一种无监督模式识别方法，在保留尽可能多的原有指标信息的基础上，把多指标转化成少数几个彼此不相关但又包含原有指标大部分信息的综合性指标（即主成分），从而快速实现不同样品间相互关系的可视化识别^［13-15］。按照主成分的提取原则，提取特征值大于1的主成分，结果得到3个主成分，其特征值分别为14.9、3.79、2.68，方差贡献率分别为59.643%、15.147%、10.716%，累积方差贡献率为85.506%（>85%），表明提取的3个主成分可以代表原始色谱峰峰面积的大部分信息。主成分分析的样本得分图见图7。由图7可见，43批苍术被分为3类：第1类S11、S33、M1-M10号样品为茅苍术，第2类S13、S19、S24-S26、S28、S30和S32号样品为关苍术，第3类S1-S10、S12、S14-S18、S20-S23、S27、S29、S31为北苍术。该结果与样品原始类别信息一致，表明本文所建立的指纹图谱可靠。

2.8.2 系统聚类分析（hierarchial-cluster analysis，HCA）

HCA是一种事先选定相似性或非相似性的度量和类间距离，经过计算建立谱系图，再根据谱系图决定分类结果^［16］。本文选择离差平方和法（Ward’s method）进行聚类分析。结果显示，43批苍术样品被聚为3类，第1类为茅苍术，第2类为关苍术，第3类为北苍术，其结果与主成分分析结果一致，并且在主成分分析的基础上，更全面地展示了所有样品存在的谱系关系。见图8。

3 讨论

通过比较茅苍术、北苍术和关苍术指纹图谱的共有模式发现，3种苍术之间化学成分差异明显，尤其《中国药典》（2020年版）中苍术的指标成分苍术素及文献^［17-21］中提到的主要药理活性成分（茅术醇、β-桉叶醇和苍术酮）的含量差异较大。通过相似度评价3种苍术，结果显示，茅苍术与关苍术的组内相似度均在0.95以上，有较好的相似性；而北苍术相似度虽较高，但波动较大，原因可能是北苍术来源广泛，不同产地对北苍术所含化学成分有所影响，因此针对北苍术的质量控制是有必要的。

从所建立的指纹图谱可以看出3种苍术所含化学成分的差别多为挥发油成分。从挥发油生物合成路径的角度分析，其影响因素既有内在遗传因素，又有外在环境因素。内在遗传因素主要为种源因素，其对药材质量的影响较大，但随着种植时间的推移，这种影响会日益减弱，外在环境因素逐渐成为主导因素^［22］。外在环境因素主要包括气候（温度、光照、湿度等）、水分、肥料、微生物环境等，其中以气候因素与土壤因素为主^［23-24］。在以上因素的综合影响下，不同产地苍术间成分及含量有所差异，该差异直接影响苍术药效的强弱，进而影响临床疗效，因此在临床用药中区分不同来源、不同种类苍术尤为重要。

本文在43批苍术样品的图谱中对3种苍术的共有峰分别进行检视，结果标定出茅苍术共有峰17个，北苍术共有峰21个，关苍术共有峰22个，3种苍术共计标定22个色谱峰。对43批样本的22个色谱峰的峰面积进行主成分分析及聚类分析，实现了茅苍术、北苍术和关苍术的区分，并从聚类结果中发现地理差异对苍术质量的影响，表明苍术药材具有一定的产地适应性。因此，将聚类分析与主成分分析结合综合评价苍术指纹图谱的差异性及相似性，不仅可以对苍术药材进行质量控制，还可以为苍术生产区划研究提供理论支持。

本研究建立了不同种类苍术的GC-MS特征性指纹图谱，并结合化学计量学对不同种类的苍术药材质量进行评价。指纹图谱提供的信息较为丰富，结论较之单独几个成分的含量测定更为全面、准确，可作为3个不同种类苍术药材区别的模式。该方法用于苍术药材质量的评价和控制，对苍术的临床应用具有指导意义。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部 ［S］. 北京： 中国医药科技出版社， 2020.

[2] 高鑫媛， 白茹玥， 魏金月， 等. 中药材苍术种质资源及栽培技术研究进展［J］. 承德医学院学报， 2022， 39（3）： 237-241.

[3] GAO Xinyuan， BAI Ruyue， WEI Jinyue， et al. Research progress on germplasm resources and cultivation techniques of Chinese medicinal herb Atractylodes macrocephala‍ ［J］. Journal of Chengde Medical College， 2022， 39（3）： 237-241.

[4] 刘欣侗. 苍术质量评价体系研究［D］. 合肥： 安徽中医药大学， 2023.

[5] 秦聪聪， 杜沁圆， 张义敏， 等. 苍术挥发油化学成分及药理作用研究进展［J］. 中成药， 2023， 45（6）： 1944-1952.

[6] QIN Congcong， DU Qinyuan， ZHANG Yimin， et al. Research progress on chemical composition and pharmacological effects of volatile oil from Atractylodes macrocephala‍ ［J］. Chinese Traditional Patent Medicine， 2023， 45（6）： 1944-1952.

[7] 冯佳鑫， 吴玉柱， 李思雨， 等. 基于色差原理分析茅苍术、北苍术有效成分含量与颜色的相关性［J］. 中国中药杂志， 2023， 48（8）： 2086-2091.

[8] FENG Jiaxin， WU Yuzhu， LI Siyu， et al. Correlation between active component content and color of Atractylodes Lancea and A.chinensis based on color difference principle［J］. China Journal of Chinese Materia Medica， 2023， 48（8）： 2086-2091.

[9] 翁丽丽， 曾行调， 王孟聪， 等. HPLC指纹图谱结合网络药理学预测北苍术功效关联物质［J］. 中成药， 2023， 45（2）： 463-469.

[10] WENG Lili， ZENG Hengdiao， WANG Mengcong， et al. Prediction of effective related substances of Atractylodes chinensis by HPLC fingerprint combined with network pharmacology‍［J］. Chinese Traditional Patent Medicine， 2023， 45（2）： 463-469.

[11] 范鑫玉， 吉田， 笔雪艳， 等. 中药指纹图谱分类及评价概述［J］. 黑龙江医药， 2023， 36（6）： 1254-1258.

[12] FAN Xinyu， JI Tian， BI Xueyan， et al. Overview of the classification and evaluation of fingerprints of traditional Chinese medicines‍［J］. Heilongjiang Medicine Journal， 2023， 36（6）： 1254-1258.

[13] LIU X， JIANG W， SU M， et al. Quality evaluation of traditional Chinese medicines based on fingerprinting［J］. J Sep Sci， 2020， 43（1）： 6-17.

[14] 肖会敏， 杨旭， 黄新文， 等. 基于HPLC指纹图谱及多成分含量的化学模式识别法评价小血藤质量［J］. 西北药学杂志， 2022， 37（5）： 1-7.

[15] XIAO Huimin， YANG Xu， HUANG Xinwen， et al. Quality evaluation of Schisandra propinqua var. sinensis based on HPLC finger-print and multi-component content determination‍［J］. Northwest Pharmaceutical Journal， 2022， 37（5）： 1-7.

[16] 张伟， 黄金林. 现代分析技术在中药药效成分检测中的应用进展［J］. 化学分析计量， 2023， 32（9）： 116-120.

[17] ZHANG Wei， HUANG Jinlin. Application of modern analytical techniques in the detection of pharmacodynamic components in traditional Chinese medicines‍［J］. Chemical Analysis and Meterage， 2023， 32（9）： 116-120.

[18] WANG D， LU F， AI L， et al. Discovery of active ingredients in traditional Chinese medicine based on the analysis of odor and flavor of compounds‍［J］. Curr Pharm Des， 2022， 28（34）： 2771-2784.

[19] 王方杰， 蒋志平， 王婷， 等. 气相色谱-质谱联用结合化学计量学分辨法分析甘松的挥发油成分［J］. 西北药学杂志， 2020， 35（1）： 9-14.

[20] WANG Fangjie， JIANG Zhiping， WANG Ting， et al. Analysis of the volatile oil from Nardostachys chinensis Batal by gas chromatography-mass spectrometry and chemometric resolution methods‍‍［J］. Northwest Pharmaceutical Journal， 2020， 35（1）： 9-14.

[21] LIU Q， KONG D， LUO J， et al. Quantitative and fingerprinting analysis of Atractylodes rhizome based on gas chromatography with flame ionization detection combined with chemometrics‍［J］. J Sep Sci， 2016， 39（13）： 2517-2526.

[22] 谢灿， 惠博平， 左亚杰， 等. 基于化学计量学方法和指纹图谱技术研究乌药不同炮制品的质量控制［J］. 湖南中医杂志， 2023， 39（11）： 152-158.

[23] XIE Can， HUI Boping， ZUO Yajie， et al. Research on quality control of different processing products of Wu Yao based on chemometric methods and fingerprint technology［J］. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine， 2023， 39（11）： 152-158.

[24] 赵鸿宾， 谢星腾， 张秋瑾， 等. 基于指纹图谱和主成分分析的苗药蛇莓质量评价［J］. 中药材， 2023， 46（8）： 2004-2006.

[25] ZHAO Hongbin， XIE Xingteng， ZHANG Qiujin， et al. Quality evaluation of Chinese medicine snake berry based on fingerprint spectrum and principal component analysis［J］. Journal of Chinese Medicinal Materials， 2023， 46（8）： 2004-2006.

[26] 张戴英， 吴梦玫， 庄冬苗， 等. 不同基原枳实中挥发油GC-MS指纹图谱的建立及其化学模式识别研究［J］. 海峡药学， 2023， 35（12）： 20-25.

[27] ZHANG Daiying， WU Mengmei， ZHUANG Dongmiao， et al. GC-MS fingerprints and chemical pattern recognition of volatile oil in Aurantii fructus immaturus with different origins［J］. Strait Pharmaceutical Journal， 2023， 35（12）： 20-25.

[28] 王艺萌， 王知斌， 孙延平， 等. 苍术属植物中倍半萜类化合物化学结构和生物活性研究进展［J］. 中草药， 2021， 52（1）： 299-309.

[29] WANG Yimeng， WANG Zhibin， SUN Yanping， et al. Research progress on chemical structure and biological activity of sesquiterpenes from Atractylodes‍ ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2021， 52（1）： 299-309.

[30] THIENGSUSUK A， PLENGSURIYAKARN T， NA-BANGCHANG K. Modulatory effects of atractylodin and β‍-eudesmol on human cytochrome P450 enzymes： Potential drug-drug interactions‍［J］. Molecules， 2023， 28（7）： 3140.

[31] ZHANG Wenjin， ZHAO Zhenyu， CHANG Likun， et al. Atractylodis rhizoma： A review of its traditional uses， phytochemistry， pharmacology， toxicology and quality control［J］. J Ethnopharmacol， 2021， 266： 113415.

[32] 余国鑫， 李子璐， 陈君. 基于功效关联的苍术质量标准研究［J］. 药学与临床研究， 2023， 31（4）： 295-300.

[33] YU Guoxin， LI Zilu， CHEN Jun. Study on quality standard of atractylodis rhizome based on efficacy related components‍［J］. Pharmaceutical and Clinical Research， 2023， 31（4）： 295-300.

[34] 刘思佳， 姚杰， 宋雪， 等. 苍术属药用植物的化学成分、药理作用、临床应用概况［J］. 中华中医药学刊， 2023， 41（1）： 151-154.

[35] LIU Sijia， YAO Jie， SONG Xue， et al. Overview of chemical composition， pharmacological effects and clinical application of medicinal plants of atractylodes DC［J］. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine， 2023， 41（1）： 151-154.

[36] 谢景. 产地和种源因素对黄芩苍术生长及药材质量的影响研究［D］. 北京： 北京中医药大学， 2015.

[37] 李建， 黄宇思， 赖慧， 等. ICP-MS法用于不同产地大叶茜草中9种微量元素的含量测定及质量评价［J］. 西北药学杂志， 2022， 37（5）： 8-14.

[38] LI Jian， HUANG Yusi， LAI Hui， et al. Determination of 9 trace elements and quality evaluation of the root of Rubia schumanniana Pritz. from different origins by ICP-MS‍［J］. Northwest Pharmaceutical Journal， 2022， 37（5）： 8-14.

[39] 孙金， 翁丽丽， 肖春萍. 药用植物苍术挥发油合成及积累影响因素的研究进展‍［J］. 中药材， 2021， 44（5）： 1259-1265.

[40] SUN Jin， WENG Lili， XIAO Chunping. Research progress on factors affecting the synthesis and accumulation of volatile oil from medicinal plant Atractylodes macrocephala‍ ［J］. Journal of Chinese Medicinal Materials， 2021， 44（5）： 1259-1265.