基于多成分定量测定的3种芍药属中药同源异用的内涵阐释

Interpretation of the connotation of homologous dissimilarity among 3 Chinese medicines derived from Paeonia based on multi-component determination

摘要

目的 从成分-功效关联性角度阐释3种芍药属中药同源异用的科学内涵。 方法 用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定赤芍、白芍、牡丹皮3种芍药属中药饮片中5个成分（芍药内酯苷、没食子酸、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚）的含量，考察其内含组分“质与量”的共性与差异。 结果 赤芍、白芍、牡丹皮中没食子酸和芍药内酯苷含量的差异可能是导致3种芍药属中药疗效产生差异的主要原因之一。 结论 初步揭示来源相同或相近、物质基础相似的赤芍、白芍、牡丹皮3种芍药属中药在临床上同源异用的科学内涵，为临床更好地理解和应用芍药属中药提供了理论依据。

Abstract

Objective To elucidate the scientific connotation of homologous dissimilarity among 3 Chinese medicines derived from Paeonia， focusing on the correlation between their components and efficacy. Methods High performance liquid chromatography （HPLC） method was used to determine the content of 5 components （albiflorin， gallic acid， paeoniflorin， benzoic acid， and paeonol） in Paeoniae Radix Rubra， Paeoniae Radix Alba and Moutan Cortex. The commonalities and differences in the quality and quantity of the intrinsic components of these medicines were investigated. Results The differences of the content of gallic acid and albiflorin in Paeoniae Radix Rubra， Paeoniae Radix Alba and Moutan Cortex may be one of the main reasons for the differences in the therapeutic effects of the 3 Chinese medicines of Paeonia. Conclusion This study highlights the scientific implications of the homologous dissimilarity among PaeoniaeRadix Rubra， Paeoniae Radix Alba， and Moutan Cortex， which share similar sources and foundational materials within traditional Chinese clinical practice.

Graphical abstract

关键词

芍药属 / 同源异用 / 没食子酸 / 芍药内酯苷 / 芍药苷 / 苯甲酸 / 丹皮酚

Key words

Paeonia / homologous dissimilarity / gallic acid / albiflorin / paeoniflorin / benzoic acid / paeonol

芍药属是毛茛科植物的一个种属，分为牡丹组sect.Moutan、芍药组sect.Paeonia和北美芍药组sect.Onaepia^［1］。我国是芍药属植物的起源地及多样化中心，分布有芍药P.lactiflora Pall.、川赤芍P.veitchii Lynch、凤丹P.ostii T.Hong et J.X.Zhang、牡丹P.suffruticos Andr.，其中凤丹和牡丹是我国独有的特种植物^［2］。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）记载赤芍的正品来源为芍药和川赤芍的根，白芍的正品来源为芍药的根，牡丹皮的正品来源为牡丹的根皮^［3］，3味中药均属于大宗中药品种，使用历史悠久，临床运用广泛。

3味中药的生物基源相近甚至相同，决定了其具有相同或相似的化学成分，均含有氧化芍药苷、芍药苷等单萜苷类成分，以及没食子酸、丹皮酚等酚酸类成分^［4-7］。然而由于赤芍、白芍、牡丹皮不同的基源、产地、加工方法等，导致3味芍药属中药的功效存在显著差异。

造成来源相同或相近、物质基础相似的中药在临床功效主治上存在显著差异的原因，首先体现在各药材内含物质基础种类的不同，即所含成分“质”的不同；其次与各药材内含成分的含量及组成比例存在密切关系，因此各药材之间“量”的不同也是物质基础组成的关键^［8］。本研究从“成分-功效”关联性角度探究赤芍、白芍、牡丹皮化学组成的质量差异对临床药效的影响，阐述3种芍药属中药“同源异用”的科学内涵，为临床更好地理解和应用芍药属中药提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（photo-diode array，PDA，美国沃特世公司）；XP-205型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HHW-4型水浴锅（江苏金坛仪器有限公司）；KQ-500DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；干燥箱（上海博讯仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品：没食子酸（批号110831-201204）、芍药苷（批号110753-201314）、丹皮酚（批号110821-201112），均购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷（批号B21149）、苯甲酸（批号65-85-0），均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）、磷酸（色谱纯），均购于美国TEDIA试剂公司；甲醇（分析纯，无锡市展望化工试剂有限公司）；超纯水（优普医疗纯水制造系统自制）；赤芍、白芍、牡丹皮饮片均采购于安徽亳州，经徐斌副主任中药师鉴定为各品种的正品饮片。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用安捷伦C₁₈反相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸水溶液（B），洗脱程序为，0~10 min：10% A~12% A；10~15 min：12% A~16% A；15~25 min：16% A~18% A；25~40 min：18% A~42% A；40~45 min：42% A~90% A；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为215 nm（没食子酸）、230 nm（芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸）、274 nm（丹皮酚）；柱温为25 ℃；进样量为10 µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

取没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酸、丹皮酚5种对照品适量，精密称定，分别置于5个20 mL量瓶中，加甲醇溶解后，摇匀，定容至刻度线，得到质量浓度分别为2 962.2、3 134.4、8 382.9、524.9、8 092.5 µg·mL^-1的5种对照品储备液。依次量取上述5种质量浓度对照品储备液1、1、1、1、2 mL，置于同一个10 mL量瓶中，加甲醇定容得到没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酸、丹皮酚质量浓度依次为296.2、313.4、838.3、52.5、1 618.5 µg·mL^-1的混合对照品母液。精密量取1 mL混合对照品母液，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀释定容后得到混合对照品溶液，混合对照品溶液中没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酸、丹皮酚的质量浓度依次为14.81、15.67、41.92、2.63、80.93 µg·mL^-1。

2.2.2 供试品溶液

分别取赤芍、白芍、牡丹皮饮片适量，粉碎成细粉，分别称取0.5、0.1、0.5 g，置于3个不同的锥形瓶中，分别加入25、35、50 mL甲醇，称定质量，超声处理30 min，用甲醇补足减失的质量，轻摇混匀后滤过，留取续滤液，得到赤芍、白芍、牡丹皮供试品溶液。

2.3 系统适用性与专属性实验

吸取2.2.1项下制备的对照品溶液和2.2.2项下制备的供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定。经测定3种供试品溶液色谱图中除牡丹皮中未检测到芍药内酯苷外，其他所有供试品中5种待测成分在相应保留时间位置均有色谱峰出现；且所有待测组分与其他无关组分的分离度良好，杂质峰无干扰。见图1。

2.4 线性关系考察

吸取2.2.1项下制备的混合对照品母液适量，加入甲醇稀释得到混合对照品母液质量浓度的1/100、1/20、1/5、2/5、4/5的系列质量浓度的实验对照品溶液。按照2.1项下色谱条件进样测定，以对照品的质量浓度（µg·mL^-1）为横坐标（x），以色谱峰面积为纵坐标（y），进行线性回归。结果显示在线性范围内，5个待测成分在本色谱条件下线性关系良好，相关系数均大于0.999 0。见表1。

2.5 精密度实验

量取没食子酸对照品储备液1 mL，芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚4种对照品储备液各2 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容后得到5个对照品的质量浓度依次为296.2、626.8、1 676.6、105.0、1 618.5 µg·mL^-1的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件重复进样6次，测定没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚的峰面积，计算得到各色谱峰峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）依次为0.7%、1.4%、1.1%、0.9%、1.3%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性实验

取赤芍饮片细粉适量，按照2.2.2项下方法制备赤芍供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚的峰面积RSD分别为0.7%、1.0%、0.5%、0.6%、1.0%，表明待测成分在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性实验

取赤芍饮片细粉适量，按照2.2.2项下方法制备赤芍供试品溶液6份，按照2.1项下色谱条件分别进样测定，计算得到赤芍饮片中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚的含量RSD分别为1.4%、0.9%、0.7%、1.4%、1.2%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率实验

取已知含量的赤芍样品细粉约0.25 g，共6份，分别精密加入5种对照品适量，置于具塞锥形瓶中，按照2.2.2项下赤芍供试品溶液制备方法制备得到6份供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样测定^［9］。计算得到没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚的平均加样回收率（RSD）分别为102.8%（1.0%）、102.5%（1.1%）、101.4%（1.8%）、99.4%（1.7%）、100.1%（1.6%）。见表2。

2.9 样品含量测定

分别称取3批赤芍、白芍、牡丹皮饮片细粉适量，按照2.2.2项下方法制备3种供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，分别计算得到3批赤芍、白芍、牡丹皮中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚的含量^［10］。见表3。

3 讨论

白芍和赤芍均含有上述5种化学成分，化学组成基本一致，赤芍与白芍中芍药苷的含量接近，但二者所含的没食子酸含量差异较大，芍药内酯苷的含量亦有显著差异。芍药苷的药理活性主要表现为活血化瘀、解痉止痛，与赤芍的功效相吻合，但与白芍补血滋阴的功效不相符。《中国药典》（2020年版）仅规定了赤芍、白芍中芍药苷的含量限度标准^［3］，且白芍的芍药苷含量只有下限，没有上限，可能难以有效表征赤芍和白芍的药效差异^［11］。文献报道，芍药苷与芍药内酯苷是白芍的潜在质量标志物（Q-marker）^［12］，分析导致赤芍与白芍2味中药临床疗效存在差异的原因为芍药内酯苷的含量差异，因此建议增加没食子酸、芍药内酯苷2种成分作为白芍的含量检测指标，从整体上评价白芍的质量，完善质量评价体系。

没食子酸、苯甲酸、丹皮酚等多元酚酸类成分表现出较强的抗血小板凝集、抗血栓等活性，具有溶解血栓的作用^［13］，而赤芍、白芍、牡丹皮中均含有上述几种酚酸类成分，且3种芍药属中药均具有活血化瘀的功效。丹皮酚表现出较强的抗炎、镇痛、解热活性^［14］，研究结果显示牡丹皮中丹皮酚的含量极高，其可能是牡丹皮独有的清虚热功效的根本原因。芍药属药材内含不同化学成分与药理活性的相关性，及具体不同化学组分的种类及组成比例对临床疗效不同的贡献度还需进一步研究。

《中国药典》（2020年版）中规定牡丹皮的正品为牡丹P. suffruticosa Andr.，而《安徽省中药饮片炮制规范》中规定牡丹皮的正品为凤丹P. ostii T. Hong et J. Z. Zhan，产自安徽铜陵凤凰山和芜湖南陵，二者存在明显的争议，应进一步加强牡丹皮2个基源的鉴定及内在组分的比较研究工作，以求正本溯源。

本实验通过HPLC法研究建立了赤芍、白芍、牡丹皮3个芍药属中药饮片中5种成分的含量测定方法，从“成分-功效”关联性探究赤芍、白芍、牡丹皮化学组成的质量差异对临床药效的影响，初步阐释了赤芍、白芍、牡丹皮3种芍药属中药在临床上“同源异用”的科学内涵，以便更好地开发和使用芍药属中药。

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基金资助

芜湖市“华佗计划”卫生高层次人才分层培养项目(芜卫组〔2023〕111号)

芜湖市科技计划项目(2022cg42)

芜湖市科技计划项目(2023yf109)

安徽中医药高等专科学校自然科学研究项目(ZRKXY2022F07)