民族药九子不离母质量标准的研究

Study on the quality standards of Dioscorea colettii Hook.f.

摘要

目的 建立九子不离母的质量控制方法，确保用药准确、质量可控，促进九子不离母的可持续发展。 方法 参照《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则》中的要求，采用基源鉴定、性状鉴定、显微鉴别、薄层色谱及高效液相色谱等方法，对九子不离母的原植物形态、性状特征、显微特征、薄层色谱进行研究，对水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物含量、薯蓣皂苷含量进行测定。 结果 九子不离母药材基源为叉蕊薯蓣，性状、显微特征及薄层色谱鉴别明显。10批样品中，水分为6.88%~8.61%，总灰分为3.16%~4.62%，酸不溶性灰分为0.21%~0.76%，醇溶性浸出物含量为22.3%~33.1%，薯蓣皂苷含量为1.56%~2.02%。限度为水分不得超过10.0%，总灰分不得超过5.0%，酸不溶性灰分不得超过0.7%，水溶性浸出物不得少于20%，含薯蓣皂苷按干燥品计不得少于1.4%。 结论 九子不离母标准中的性状、显微特征明显，薄层色谱分离效果较好，水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇浸出物测定方法可行，薯蓣皂苷含量测定方法简便、准确，重复性良好，为九子不离母的质量控制提供依据。

Abstract

Objective To establish a quality control method for Dioscorea collettii Hook.f.， ensure accurate medication and controllable quality， and promote the sustainable development of Dioscorea collettii Hook.f. Method In accordance with the requirements of the Technical Guidelines for Research on Quality Standards of Traditional Chinese Medicine （Ethnic Medicinal Materials） in Yunnan Province， methods such as original identification， trait identification， microscopic identification， thin-layer chromatography identification， and high-performance liquid chromatography （HPLC） were used to study the original plant morphology， trait characteristics， microscopic characteristics， and thin-layer chromatography （TLC） of Dioscorea collettii Hook.f. Water content， total ash content， acid insoluble ash content， alcohol extract content， and dioscin content were determined. Result The base source of Dioscorea collettii Hook.f.， was Dioscorea opposita， with obvious characteristics， microscopic features， and TLC spots. In the 10 batches of samples， the moisture content was 6.88%—8.61%， the total ash content was 3.16%—4.62%， the acid insoluble ash content was 0.21%—0.76%， the alcohol soluble extract content was 22.3%—33.1%， and the dioscin content was 1.56%—2.02%. The limit is that the moisture content \le10.0%， the total ash content \le5.0%， the acid insoluble ash content \le0.7%， the water-soluble extract \ge20%， and the dry content of dioscin \ge1.4%. Conclusion The characteristics and microscopic features in the standard of Dioscorea collettii Hook.f. are obvious， and the TLC separation has good effect. The determination method of moisture， total ash， acid insoluble ash， and alcohol extract is feasible. The determination method of dioscin content is simple， accurate， and has good repeatability， providing a basis for the quality control of Dioscorea collettii Hook.f.

Graphical abstract

关键词

九子不离母 / 显微鉴别 / 薄层色谱鉴别 / 含量测定

Key words

Dioscorea collettii Hook.f. microscopic identification / thin-layer chromatography identification / content determination

九子不离母（Dioscorea collettii Hook.f.）为薯蓣科薯蓣属植物叉蕊薯蓣，以根状茎入药，别名叉蕊薯蓣、黄姜。分布于云南、四川、贵州等地，常生于海拔1 000~3 200 m的箐边、山谷疏林下、灌丛中。味苦、微辛、性平，具有清热解毒、祛风利湿、通络止痛的功效。主要用于治疗风湿痹痛、拘挛麻木、跌打伤痛、胃气痛、湿热黄疸、白浊、淋痛、白带、湿疮肿毒、毒蛇咬伤等^［1］。《中华本草》^［2］记载，九子不离母块茎含薯蓣皂苷元和雅姆皂苷元，根茎含甾类化合物，还有薯蓣皂苷元棕榈酸酯等成分。薯蓣皂苷可用于治疗类风湿关节炎，并具有改善动脉粥样硬化症状，保护血管内皮功能，减轻心脏、脑、肾脏的缺血再灌注损伤，改善更年期的骨质疏松，缓解类风湿关节炎、溃疡性结肠炎病症等活性^［3-5］。九子不离母作为民族医药，临床疗效显著，并且该药材野生资源丰富，发展潜力大，但目前尚无相关的质量标准，对九子不离母药材饮片的生产、销售、质量控制、临床使用等问题均存在极大的制约。为更好地控制九子不离母药材的质量，从九子不离母的基原、性状、显微特征、理化性质等方面进行研究，并首次建立薄层色谱鉴别方法和指标成分薯蓣皂苷含量测定方法，制定合理的水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物以及指标性成分含量限度，建立九子不离母的药材质量控制标准，为九子不离母的质量监督提供参考和依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Infinity 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；CPX5800H-C型超声清洗仪（上海必能信超声有限公司）；MS204型电子天平（上海梅托勒-托利多仪器有限公司）；BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司）；BX53+DP73型显微成像系统（日本奥林巴斯株式会社）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，批号JB090130，德国默克公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙醇（体积分数≥99.7%，批号2012081，四川西陇科学有限公司）；硅胶薄层G板（批号20220902，青岛胜海精细化工有限公司）；硅胶薄层G板（批号20220411，烟台江友硅胶有限公司）；硅胶薄层G板（批号20230502）、硅胶薄层H板（批号20191105）、硅胶薄层GF254板（批号20151216），均购自青岛海洋化工有限公司。

薯蓣皂苷对照品（质量分数以96.1%计，批号111707-201703，中国食品药品检定研究院）；本研究所用的10批九子不离母药材，经中国科学院昆明植物研究所植物资源调查评估与鉴定中心鉴定为薯蓣科薯蓣属植物叉蕊薯蓣Dioscorea collettii Hook.f.的根茎。样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 本草考证

九子不离母最早记载于宋代苏颂编撰的《本草图经》，称为兴元府萆薢。《贵州草药》（1970年版）中记载为黄山药、蛇头草^［6］。《玉溪中草药》（1971年版）中记载为九子不离母，其别名为叉蕊薯蓣，在玉溪通海、华宁等地称黄姜^［7］。《云南中药资源名录》（1993年版）称萆薢、白山药、次黄山药、黄姑里^［8］。《中华本草》（1999年版）记载为九子不离母。

2.2 生长环境

九子不离母常生于海拔1 000~3 200 m的箐边、山谷疏林下和灌木丛中，主要分布于四川、贵州、云南等地，印度和缅甸也有分布^［9］。九子不离母生长环境见图1。

2.3 性状特征

通过对多个产地九子不离母药材的性状特征进行观察和测量发现，本品呈不规则块状，多具分枝，长5~25 cm，表面呈灰褐色或棕黄色，凹凸不平，有坚硬的须根残基，分枝顶端有凸起芽痕。质坚硬。切片呈不规则厚片，皱缩不平，呈白色或黄白色，质略韧。气微，味微苦、涩。见图2。

2.4 显微鉴别

通过对九子不离母的横切片和粉末的显微特征进行观察发现，本品横切面表皮有时残存。外层为多列木栓化细胞。皮层较窄，细胞多切向延长，壁略增厚，木化壁纹孔明显。黏液细胞散在，内含草酸钙针晶束。中柱散生周木型维管束和外韧型维管束。薄壁细胞壁略增厚，具纹孔，细胞中含淀粉粒。见图3。

本品粉末呈黄白色。淀粉粒众多，有圆形、卵圆形或长椭圆形，脐点点状或裂缝状。具缘纹孔导管40~50 μm。草酸钙针晶束长60~80 μm。厚壁细胞众多，壁木化，孔沟明显，有的类似石细胞，多角形、梭形或类长方形，直径为40~80 μm。薄壁细胞木化，呈淡黄色或黄色，呈长椭圆形、长方形或菱形，纹孔较小。见图4。

2.5 薄层色谱鉴别

取本品粉末0.25 g，加乙醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加2 mL乙醇使溶解，作为供试品溶液。另取薯蓣皂苷对照品适量，加乙醇制成质量浓度为0.1 mg·mL^-1的对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）四部通则0502薄层色谱法进行实验，吸取上述对照品和供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（10∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积分数10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。薄层色谱斑点清晰，分离效果好，方法可行。见图5。

2.6 水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定

参照《中国药典》（2020年版）四部通则0832第二法、2302测定水分、总灰分、酸不溶性灰分，所测10批样品中水分为6.88%~8.61%，平均值为7.84%；总灰分为3.16%~4.62%，平均值为3.68%；酸不溶性灰分为0.21%~0.76%，平均值为0.38%。根据测定结果，将本品水分限度定为10批样品结果平均值的120%，即不得超过10.0%；将本品总灰分限度定为10批样品结果平均值的120%，即不得超过5.0%；将本品酸不溶性灰分限度定为10批样品结果平均值的150%，即不得超过0.6%。见表2。

2.7 浸出物测定

根据《中国药典》（2020年版）四部通则2201浸出物测定法进行测定。所测10批样品中水分为22.2%~33.14%，平均值为26.15%，并将本品浸出物限度定为10批样品结果平均值的80%，即不得少于20%。见表2。

2.8 薯蓣皂苷含量测定

2.8.1 色谱条件与系统适应性实验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（50∶50）为流动相；检测波长为195 nm；进样量为10 μL；流速为1 mL·min^-1；柱温为30 ℃。理论塔板数按薯蓣皂苷色谱峰计算应不低于5 000。

2.8.2 对照品溶液的制备

取薯蓣皂苷对照品适量，精密称定，加体积分数70%乙醇制成质量浓度为1 mg·mL^-1的储备溶液。取储备溶液适量，加体积分数70%乙醇制成质量浓度为0.1 mg·mL^-1的对照品溶液，即得。

2.8.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过4号筛）约0.14 g，精密称定，加入体积分数70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，加体积分数70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取对照品和供试品溶液，按照2.8.1项下色谱条件进样，色谱图见图6。

2.8.4 线性关系考察

取2.8.2项下对照品储备溶液，加体积分数70%乙醇稀释后得到0.047、0.940、0.141、0.188、0.234、0.281 mg·mL^-1系列不同质量浓度的对照品溶液，按照2.8.1项下色谱条件测定。以薯蓣皂苷的浓度（mg·mL^-1）为横坐标（x），以薯蓣皂苷的峰面积为纵坐标（y），进行线性回归。得到薯蓣皂苷的回归方程为：y=6 159.3x－6.121，r=0.999 8。结果表明，薯蓣皂苷质量浓度在47~281 μg·mL^-1范围内线性关系良好。

2.8.5 精密度实验

取2.8.2项下制备的对照品溶液，按照2.8.1项下的色谱条件重复进样6次，测定峰面积。薯蓣皂苷峰面积的RSD为0.6%，表明方法的精密度良好。

2.8.6 重复性实验

取同一批九子不离母药材粉末6份，按照2.8.3项下方法制备6份供试品溶液，按照2.8.1项下色谱条件进行测定。测得薯蓣皂苷含量为1.77%、1.78%、1.79%、1.76%、1.76%、1.79%，RSD为0.8%，表明该方法的重复性良好。

2.8.7 稳定性实验

取2.8.3项下制备的供试品溶液，按照2.8.1项下的色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h时进行测定。薯蓣皂苷的峰面积RSD为1.1%，表明薯蓣皂苷在24 h内稳定。

2.8.8 加样回收实验

取已知含量的本品九子不离母药材（过4号筛）6 份，每份约0.07 g，精密称定，置于锥形瓶中，分别加入质量浓度为0.39 mg·mL^-1的薯蓣皂苷对照品溶液3 mL，再加入体积分数70%乙醇22 mL，按照2.8.3项下方法制备供试品溶液，按照2.8.1项下色谱条件进行测定，计算回收率。见表3。

2.8.9 样品测定

按照建立的方法测定10批不同产地的九子不离母药材样品，按干燥品计算含量^［10］。薯蓣皂苷含量为1.56%~2.04%，平均值为1.78%。根据测定结果，将九子不离母药材含量测定的限度定为10批样品结果平均值的80%，即按干燥品计算，含薯蓣皂苷不得少于1.40%。

3 讨论

薄层鉴别实验中，本文考察了不同的提取溶剂（甲醇、乙醇）、不同提取方式（超声、回流）、不同展开系统［三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）下层溶液、三氯甲烷-甲醇（10∶1）、三氯甲烷-甲醇（10∶5）］、不同显色方式［置紫外灯（365 nm）下检视、碘蒸气熏蒸显色、喷以体积分数10%硫酸乙醇溶液后在105 ℃加热至斑点显色清晰］、不同类型硅胶板（硅胶G、硅胶GF254、硅胶H薄层板）对薄层结果的影响，结果表明，采用本研究方法所得薄层色谱斑点清晰、明显、分离好。

浸出物测定时，本研究考察了不同提取溶剂（水、乙醇、稀乙醇）和不同提取方式（冷浸法及热浸法）对九子不离母浸出物含量的影响，结果表明，选用稀乙醇作溶剂以热浸法测定时浸出物含量最高。

药理研究结果表明，薯蓣皂苷具有抗肿瘤、抗癌、抗炎、抗焦虑、抗抑郁、改善心血管功能、调节免疫、改善骨质疏松等多种药理作用^［11-18］。薯蓣皂苷多广泛存在于百合科、石竹科、豆科、薯蓣科和蔷薇科等植物中，在薯蓣科植物根茎中的含量高^［19］。故本研究将薯蓣皂苷作为九子不离母药材含量测定的指标性成分。含量测定前处理实验中，本研究考察了不同超声时间（10、20、30、60 min）对供试品中薯蓣皂苷含量提取率的影响，结果表明，不同的超声时间对供试品中薯蓣皂苷峰的峰面积影响不大，为了节省操作时间和扩大供试品制备方法的适用范围，故选择了30 min作为超声提取时间。在色谱条件筛查过程中，本研究选择乙腈-水溶液为流动相，考察了55∶45、52∶48、50∶50、48∶42不同洗脱比例，以薯蓣皂苷峰的分离度、峰形、保留时间等作为评价指标，结果表明，以乙腈-水溶液比例为50∶50时，薯蓣皂苷峰形对称、基线分离良好、保留时间合适。

本研究以10批不同产地的九子不离母药材为研究对象，对其各项质控指标进行了考察，薄层色谱鉴别、检查、浸出物及含量测定项的制订完善了九子不离母的质量标准，对其质量控制具有重要意义，解决了该药材在生产及临床使用中缺失标准的问题，为民族医药的传承和可持续性发展提供了支持，同时为药品生产及临床用药安全、有效提供了保障。

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基金资助

云南省地方本科高校中医联合项目-面上项目(20200AZ070001-071)

云南省中医药大学校院联合基金项目(XYLH202204)