基于HPLC指纹图谱、多成分含量测定及化学计量学的痛痒消洗剂质量评价

Quality evaluation of Tongyangxiao Lotion by HPLC fingerprint and multicomponent content determination combined with chemometrics

摘要

目的 建立高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）指纹图谱与多成分含量测定方法，结合化学计量学分析评价痛痒消洗剂的质量。 方法 采用Agilent Extend-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^-1，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为230 nm（苦参碱、氧化苦参碱）、316 nm（黄柏碱）。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）进行相似度评价，确定共有峰，运用SPSS 22.0统计学软件进行聚类分析和主成分分析。采用一测多评法测定3种成分的含量。 结果 12批样品中HPLC指纹图谱中有13个共有峰，相似度均>0.907。各批次样品分为3类，4个主成分累积方差贡献率达88.67%，3种成分在各自范围内线性关系良好（R²>0.991），平均加样回收率为97.52%~102.35%。 结论 指纹图谱及含量测定方法准确、可靠，可用于痛痒消洗剂的质量控制及综合评价。

Abstract

Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint and multi-component content determination method， combined with chemometrics， to evaluate the quality of Tongyangxiao Lotion. Methods The chromatographic process was conducted on an Agilent Extend-C18 column （4.6×250 mm， 5 μm） with acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid solution （B） as the mobile phase. The gradient elution was performed at a flow rate of 1.0 mL·min^-1， a column temperature of 30 ℃ and a sample size of 10 μL. The detection wavelengths were set at 230 nm （matrine and oxymatrine） and 316 nm （phellodendrine）， respectively. Using arctiin as the reference peak， the HPLC fingerprints of 12 batches of Tongyangxiao Lotion were determined， and the similarity among the 12 batches of samples was evaluated using the Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System （2012 edition） to identify the common peak. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 22.0 statistical software. Results A total of 13 common peaks were identified in the HPLC fingerprints of the 12 batches， with a similarity greater than 0.907. The samples were categorized into 3 distinct groups. The cumulative variance contribution rate of the 4 principal components was 88.67%， and a good linear relationship was observed among the 7 components （R²>0.991）. The average recoveries ranged from 97.52% to 102.35%. Conclusion The fingerprint and content determination methods were accurate and reliable， which can be used for the quality control and comprehensive evaluation of Tongyangxiao Lotion.

Graphical abstract

关键词

痛痒消洗剂 / 高效液相色谱法 / 聚类分析 / 主成分分析 / 指纹图谱 / 质量评价

Key words

Tongyangxiao Lotion / HPLC / cluster analysis / principal component analysis / fingerprints / quality evaluation

近年来，国家相继出台了《关于加快中医药特色发展若干政策措施的通知》《关于促进中医药传承创新发展的实施意见》《关于中药注册分类及申报资料要求》等文件，明确提出要促进医疗机构制剂的研究与开发，提高医疗机构制剂的发展水平。痛痒消处方在河北省中医院有近30年的临床应用经验，是医院自主研发的医疗机构中药制剂，主要由黄柏、五倍子、苦参等药味组成，具有清热燥湿、活血止痛、杀虫止痒、敛疮生肌的功效，用于治疗混合痔、肛裂、肛窦炎以及肛瘘等^［1-2］。

痛痒消洗剂现行质量标准是对苦参和五倍子进行定性鉴别，缺少对制剂整体质量的评价方法。随着中医药现代化发展，“安全、稳定、可控”成为中药可持续发展的关键需求，建立中药复方制剂整体质量控制方法是大势所趋^［3］。本研究采用指纹图谱分析方法，将图谱中某些重要特征信息或整体信息用于中药制剂质量整体控制和评价^［4］，以完整、准确地反映中药制剂的复杂性和质量一致性^［5］，具有稳定性好、专属性强、重复性好等优点^［6］，广泛应用于中药制剂的质量控制及评价^［7］，为中药制剂的质量控制提供新的思路和方法^［8］。

化学计量学利用数学或统计学方法处理化学体系中的定性或定量数据，已逐渐成为质量标准研究中不可缺少的判断工具。统计方法主要包括层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等，通过分析大量数据、挖掘其内在关联，广泛应用于中药指纹图谱质量评价研究，客观反映中药制剂的整体质量，确保其内在质量的均一性和稳定性^［9］。本研究借助HCA和PCA化学模式识别技术对指纹图谱进行数据信息的挖掘和解析，旨在为痛痒消洗剂的质量综合评价分析提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，配备SPD-20A紫外检测器（日本岛津公司）；98-1B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；YP2002型电子天平（上海津平科学仪器有限公司）；RE-52型旋转薄膜蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

对照品：黄柏碱（质量分数为98.5%，批号PS000447，成都草源康生物科技有限公司）；苦参碱（质量分数为98.7%，批号110805-202010）、氧化苦参碱（质量分数为92.9%，批号110780-201909），均购自中国食品药品检定研究院。磷酸（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），均购自天津市康科德科技有限公司；实验所用原处方药材，经贾淑珍副主任药师鉴定均为正品，且符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）一部项下各中药饮片的相关规定。将所收集药材进行组方，形成12批次，并按照院内制剂相关办法制备洗剂，规格为200 mL·瓶^-1。见表1。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备

取痛痒消洗剂1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，混匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备

分别取苦参碱、氧化苦参碱、黄柏碱对照品适量，精密称定，置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，得到质量浓度分别为0.485、0.715、0.270 mg·mL^-1的单一对照品溶液。

2.2 色谱条件

使用Agilent Extend-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-体积分数0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0~16 min，10%A→16%A；16~40 min，16%A→18%A；40~44 min，18%A→19%A；44~55 min，19%A→24%A；流速为1.0 mL·min^－1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。配置二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD），检测波长为230 nm（苦参碱、氧化苦参碱）、316 nm（黄柏碱）。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

取2.1.1项下制备的痛痒消洗剂供试品溶液，按照2.2项下色谱条件，连续进样6次，计算在波长230、316 nm处共有色谱峰的相对保留时间及峰面积。各共有峰的峰面积与相对保留时间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性实验

按照2.1.1项下的方法制备痛痒消洗剂供试品溶液6份，按照2.2项下色谱条件进样测定，计算在波长230、316 nm处共有色谱峰的相对保留时间及峰面积。各共有峰的相对保留时间及峰面积RSD均小于2%，表明该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性实验

取2.1.1项下制备的痛痒消洗剂供试品溶液，按照2.2项下色谱条件，分别于0、3、6、9、12、24 h进样测定，计算在波长230、316 nm处共有色谱峰的相对保留时间及峰面积。各共有峰的相对保留时间及峰面积RSD均小于3%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 HPLC指纹图谱的建立与相似度评价

取12批样品适量，按照2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样测定，记录色谱图，将数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版），以样品共有模式为对照，对S1~S12样品色谱图进行多点矫正，使用的方法为平均数相关系数法和时间宽度0.1，生成叠加图谱。见图1。

在进行指纹图谱构建时，特征峰的选择是关键环节。通常情况下，特征峰是所有样品所共有的谱峰，但如果其数量较少，为了提高构建的准确性，可以考虑选择90%以上样品所共有的特征峰。在样品的特征峰分布较为分散的情况下，为了保证构建的可靠性，可以考虑采用80%以上样品所共有的特征峰。基于上述原则，通过对比230、316 nm波长处各个色谱峰的分离度，在230 nm波长处筛选出8个分离度较好的共有峰，在316 nm波长处筛选出5个分离度较好的共有峰，与标准品比对指认出3个共有峰，在230 nm波长处指认出苦参碱（峰1）、氧化苦参碱（峰2），在316 nm波长处指认出黄柏碱（峰6）。见图2。

在指纹图谱中选择峰面积较大、出峰时间适中且分离度较高的11号峰为参照峰，计算其他色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。见表2、表3。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 年版）计算相似度，12批样品与对照图谱相似度结果显示，在230 nm波长处，S1~S12样品的相似度范围为0.907~0.997；在316 nm波长处，样品相似度范围0.915~0.992。见表4。

由表2、表3可知，以11号峰为参照，测得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.14%~1.81%、0.20%~4.34%。总体来看，不同批次间样品的差异较小，所含成分差别不大，但成分含量稍有差异。

2.3.2 HCA

HCA 是一种可使复杂的多维数据标准化的分析方法，通过使用适当的度量和连接准则，计算相异度，实现对象的归类^［10］。运用数据分析软件 SPSS 26.0，采用离差平方和法（Ward法），以平方欧氏距离为测度，以12批样品的13个共有峰的相对峰面积为变量进行HCA。结果显示，当平方欧氏距离为15时，12批痛痒消洗剂样品主要可以分为3类，第1大类包括S9、S11、S5、S1、S7，第2大类包括S10、S12、S2、S3、S4，剩余S6和S8各为两小类，可合并作为第3类。因此，采用HPLC指纹图谱，结合聚类分析和相似度分析，可以初步判断痛痒消洗剂不同批次间质量存在差异，但差异不明显，与相似度评价结果基本一致。见图3。

2.3.3 PCA

PCA是以相互联系的原始数据为基础，寻找几个能够对原有指标性成分保留其主要信息且相互不关联的综合性变量，对其进行综合评价的一种方法^［11］。将12批样品指认出来的13个特征共有峰峰面积导入SPSS 26.0软件中进行主成分分析。以主成分特征值λ>1作为标准，共提取出4个主成分。见表5。

前4个主成分方差累计贡献率达到88.867%，具有统计学意义。第1主成分约占总方差贡献率的50%，对主成分的方差贡献较大；第2、第3和第4主成分特征值占10%以上，分别为17.218%、11.349%、10.394%，表明前4类主成分可以代表全样品中13个共有峰中88.867%的性质。主成分贡献率呈逐级递减的趋势，第5到第7主成分的方差贡献率较低，第8到第13成分的方差贡献率趋于零，对整体性质的评价未作出贡献，暂不纳入主成分分析范围。见图4。

采用具有Kaiser标准化的正交旋转法，对提取出的主成分色谱峰进行分析，得到旋转成分载荷因子矩阵。见表6。

根据主成分载荷矩阵，推测12批样品的差异不是单一成分影响的结果，而是多成分协同作用。载荷图用于表示每个色谱峰对于主成分综合作用的贡献，每1个点代表1个色谱峰，权重越大，表示该色谱峰对样本整体分布起的作用越大。由表6可知，色谱峰M8、M9、M11、M13对第1类主成分的贡献度较高，色谱峰M3、M4对第2类主成分的贡献度较高，色谱峰M6对第3类主成分的贡献度较高，色谱峰M7对第4类主成分的贡献度较高。前3类主成分中，M8、M9、M11、M13、M3、M4、M6（黄柏碱）等7个色谱峰可能是造成不同批次痛痒消洗剂质量差异的主要化学成分。以前3类主成分的得分为x、y、z坐标，绘制三维空间立体图，结果与载荷因子矩阵评价表一致。前3类主成分可对药物的整体质量起主要作用。因此，可以利用主成分分析方法对痛痒消洗剂的质量进行评价和控制，以提高其质量的稳定性和一致性。见图5。

2.3.4 综合评价

根据4个主成分的载荷因子得分除以相应特征值的算术平方根，得到12批样品的综合得分F。综合得分F=方差贡献率×相应的因子得分=0.499 05×F1+0.172 18×F2+0.113 49×F3+0.103 94×F4。将得分相近的归为一类，即将S9、S11、S7、S1、S6归为一类，S5、S4、S12 、S10、S2归为一类，S3和S8归为一类，结果与相似度及聚类分析的结果基本一致。综合得分结果显示，S9号样品综合排名第一，其次为S11、S7、S6，S1、S5、S4、S12排在中间位置，S10、S2、S3、S8排在最后。并且S9号样品相应的指纹图谱中3个标志性色谱峰的峰面积较大，表明山西的苦参和四川的黄柏质量较好，在制备该院内制剂选饮片时可优先考虑使用。

2.4 含量测定

2.4.1 线性关系考察

取2.1.2项下制备的对照品溶液，逐级稀释成不同质量浓度梯度的对照品溶液，按2.2项下色谱条件测定，并以苦参碱、氧化苦参碱、黄柏碱对照品峰面积为纵坐标（y），含量（μg）为横坐标（x）进行线性回归，线性回归方程、R²及线性范围见表8。

2.4.2 加样回收率实验

精密吸取已知含量的供试品溶液6份，置于5 mL量瓶中，按照含量1∶1加入对照品溶液，用甲醇定容，混匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按照2.2项下色谱条件进样测定，计算得到上述3个成分的平均加样回收率分别为98.94%、102.35%、97.52%，表明该方法的准确性良好。

2.4.3 样品的含量测定

取12批痛痒消洗剂样品，按照2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样测定，计算样品中3个成分的含量。见表9。

3 讨论

3.1 流动相的选择

痛痒消洗剂中的有效成分，如苦参碱、黄柏碱等均为生物碱类，同时含有当归中阿魏酸等有机酸和花椒挥发油中的乙酸芳樟酯、芳樟醇等小极性类成分。本研究首先探讨了甲醇-水和乙腈-水2种流动相系统对于痛痒消洗剂中各种化学成分的分离效果。结果表明，乙腈-水流动相较甲醇-水具有更好的分离效果，但存在基线漂移的问题。通过比较加入不同类型及比例的酸溶液后各个色谱峰的分离效果发现，加入体积分数0.1%磷酸后，各个色谱峰分离效果较佳、基线稳定，故最终确定以乙腈-体积分数0.1%磷酸水溶液为分离痛痒消洗剂样品的流动相系统。

3.2 检测波长的确定

成分复杂的中药样品在构建指纹图谱时，需选择最佳检测波长，使得该波长下样品主要成分的吸收强度较大，同时排除干扰成分^［12］，以保证建立的指纹图谱具有较好的稳定性，进而保证饮片、中间体和制剂的指纹图谱具有高度一致性^［13-14］。本研究在200~400 nm范围内对痛痒消洗剂样品进行扫描，结果发现，在230、316 nm波长处，色谱峰信息较多，且这2个波长处的分离度良好，可以有效地分离各个成分。各色谱峰与相邻色谱峰分离完全，基线平稳，而目标成分苦参碱、氧化苦参碱、黄柏碱在该波长下的色谱峰响应值适中。因此，本研究选择230、316 nm作为痛痒消洗剂指纹图谱的检测波长。

3.3 指标成分的选择

痛痒消洗剂处方中苦参主治湿热内生，可杀虫止痒；黄柏主治下焦湿热，可解毒疗疮；两者同为君药，具有清热燥湿、解疮生肌的作用。苦参、黄柏药中的生物碱等生物活性成分具有抗炎^［15］、抑菌^［16］、镇痛^［17］等作用，可以缓解发病时伤口的细菌感染、发炎及疼痛症状，加快疾病的恢复。因此，以苦参总碱（苦参碱+氧化苦参碱）和黄柏碱的含量为指标进行含量测定。经测定发现，氧化苦参碱、苦参碱、黄柏碱的含量均较高，可为痛痒消洗剂制定更具体的质量标准提供参考。

3.4 痛痒消洗剂指纹图谱的评价

本研究首次对痛痒消洗剂进行了质量评价，以HPLC法对制备的样品进行了指纹图谱考察，所得的相似度大于0.900，表明在定性方面各批次样品特征峰稳定，也间接表明该院内制剂的制备工艺稳定。指纹图谱标记了13个共有峰，指认了苦参碱、氧化苦参碱、黄柏碱3个有效成分。通过对指纹图谱数据进行化学计量学分析包括聚类分析、主成分分析，筛选出M8、M9、M11、M13、M3、M4、M6（黄柏碱）7个色谱峰可能是造成不同批次痛痒消洗剂质量差异的主要化学成分，其中1个成分已被指认，后期将继续深入研究并指认更多成分，对该院内制剂进行更为全面的质量评价。

本研究采用指纹图谱结合化学模式识别技术对不同产地不同批次的痛痒消洗剂的质量进行深入探索，较系统、整体、全面地评价了中药复杂指纹图谱。根据HCA与指纹图谱的相似度评价结果可初步判断痛痒消洗剂不同批次间质量存在差异，但差异不明显，与相似度评价结果基本一致，也间接表明该制剂制备工艺较为稳定。采用PCA共提取出4个主成分，可快速筛选该制剂质量控制过程中需重点关注的指标成分；通过综合评价得分结果可知，S9号样品综合排名第1，表明山西的苦参和四川的黄柏质量较好，在制备该院内制剂选饮片时可重点考虑。此外，本研究采用高效液相色谱多成分定量的方法控制痛痒消洗剂的质量，以更好地监测不同批次产品的质量，该方法操作简便、结果稳定，重复性好，可用于该制剂的质量控制。

综上所述，指纹图谱反映制剂整体特点，多成分含量测定方法可准确测定该制剂中主要成分的含量，两者结合有利于制剂整体的质量控制，从而进一步保证药品质量稳定，疗效可靠。

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基金资助

河北省中医药管理局科研计划项目(2021011)