瑞马唑仑对脑出血大鼠学习记忆障碍的影响及机制

Effect and mechanism of remimazolam on learning and memory impairment in rats with intracerebral hemorrhage

摘要

目的 探讨瑞马唑仑（remimazolam， Re）对脑出血（intracerebral hemorrhage， ICH）大鼠学习记忆障碍的影响及机制。 方法 右侧尾状核注射胶原酶Ⅶ构建ICH大鼠模型。将大鼠随机分为假手术（Sham）组、ICH组和ICH联合Re组。ICH组和ICH联合Re组大鼠右侧尾状核内注射0.4 IU胶原酶Ⅶ，Sham组注射相同剂量的生理盐水。ICH联合Re组在胶原酶Ⅶ注射前1 h按20 mg·kg^-1剂量腹腔注射1次Re，然后，在胶原蛋白Ⅶ注射后每12 h注射1次Re。用Morris水迷宫实验评价大鼠的学习记忆能力，用神经功能评分评估大鼠神经功能缺损情况；干湿比评估脑水肿情况；冠状切片分析血肿大小；苏木素-伊红（hematoxylin & eosin， HE）染色和Nissl染色检测组织病理变化。用免疫荧光染色和蛋白质印迹法（Western blotting）检测相关蛋白的表达水平。酶联免疫吸附试验测定炎症因子的含量。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， Tunel）-神经特异核抗原（neurospecific nucleoprotein， NeuN）双免疫荧光染色和Fluoro-Jade C（FJC）染色分别评价神经元细胞凋亡和神经元退化情况。 结果 ICH术后24、72 h大鼠神经功能缺损和脑含水量均显著高于Sham组，Re可降低神经功能评分并降低脑含水量。Re可显著缩小ICH后3 d的脑血肿体积，减轻组织病理学损伤，并提高脑出血大鼠的学习记忆能力。ICH导致大鼠脑组织中离子钙结合适配器分子1（ionized calcium-binding adapter molecule-1， Iba-1）、髓过氧物酶（myeloperoxidase， MPO）阳性细胞数、Iba-1、MPO、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素（interleukin， IL）-1β和IL-6的表达水平及大鼠血清和脑脊液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均显著增加，Re则可降低Iba-1、MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平。此外，Re可显著降低ICH大鼠脑组织中FJC和Tunel阳性细胞数量及促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）和剪切型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3， cl-caspase-3）的表达水平，提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。 结论 Re可通过抑制细胞凋亡和神经炎症改善脑出血引起的学习记忆障碍。

Abstract

Objective To investigate the influence and mechanisms of remimazolam （Re） on learning and memory impairment in rats with intracerebral hemorrhage （ICH）. Methods ICH rat model was constructed via injection collagenase Ⅶ into the right caudate nucleus. The rats were randomly divided into 3 groups， Sham， ICH and ICH combined with Re. The rats in the ICH group and ICH combined with Re group received 0.4 IU collagenase Ⅶ in the right caudate nucleus， while the sham group rats were injected with an equal volume of normal saline. In the ICH combined with Re group， Re was intraperitoneally injected into rats at a dose of 20 mg∙kg^-1 1 hour prior to collagenase Ⅶ injection， and then once every 12 hours after collagen Ⅶ injection. Morris water maze was performed to evaluate the learning and memory capacity of rats， and neural function deficit was evaluated by neural function score. The dry-wet ratio was used to assess cerebral edema and coronal sections were used to analyze hematoma volume. The histopathological changes were detected by Hematoxylin & eosin （HE） and Nissl staining. Immunofluorescence staining and Western blotting were conducted to determine protein expressions and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the levels of inflammatory factors. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （Tunel）‍-neuro-specific nucleoprotein （NeuN） double immunofluorescence staining and Fluoro-Jade C （FJC） staining were used to evaluate the apoptosis and degeneration of neuronal cells. Results The neurological impairment and brain water content of rats were significantly higher than that in sham group 24 hours and 72 hours post-ICH operation， which were attenuated by Re treatment. Re significantly reduced hematoma volume and histopathological damage， and improved the learning and memory capacity on day 3 after ICH. ICH enhanced ionized calcium-binding adapter molecule-1 （Iba-1）- and myeloperoxidase （MPO）-positive cells in brain tissues， as well as the expressions of Iba-1， MPO， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL-1β） and IL-6 in brain tissues and the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum and cerebrospinal fluid of rats， while Re decreased the levels of Iba-1， MPO， TNF-α， IL-1β and IL-6 mentioned above. In addition， Re significantly reduced the numbers of FJC- and Tunel-positive cells and the expressions of pro-apoptotic B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） associated X protein （Bax） and cleaved caspase-3 （cl-caspase-3）， but upregulated the anti-apoptotic Bcl-2 expression in ICH rats. Conclusion Re improved ICH-induced learning and memory impairment by inhibiting apoptosis and neuroinflammation.

Graphical abstract

关键词

瑞马唑仑 / 细胞凋亡 / 神经炎症 / 脑出血 / 学习记忆障碍

Key words

remimazolam / cell apoptosis / neuroinflammation / intracerebral hemorrhage / learning and memory impairment

脑出血（intracerebral hemorrhage， ICH）是由脑血管破裂，血液进入脑实质引起的一种中风类型，可引起神经功能障碍，具有高死亡和长期残疾的风险^［1］。由颅内血肿引起的炎症反应可导致神经细胞凋亡，当这种损伤发生在海马体时，会导致患者出现记忆障碍^［2］。研究发现，超过1/3的患者在中风后会出现记忆障碍^［3］。因此，有效的抗炎和抗细胞凋亡有助于促进脑出血患者记忆功能的恢复。

瑞马唑仑（remimazolam， Re）是一种新型超短效苯二氮䓬类药物，通过作用于γ-氨基丁酸-A受体而发挥镇静作用^［4］。Re复合全身麻醉可降低老年患者髋关节手术后的应激反应和认知障碍发生率^［5］。研究发现，Re对脑、心、肝、肺等多个器官具有保护作用^［6］。Re能有效改善大鼠脑缺血再灌注及由脂多糖诱导的神经功能障碍^［7-8］，对脓毒症小鼠的认知功能障碍和脑损伤也有改善作用^［9-10］。甲苯磺酸瑞马唑可延缓老年小鼠记忆功能的衰退^［11］。实验室和临床研究结果证实Re具有抗炎作用^［12］。此外，Re对蛛网膜下腔出血大鼠的神经具有保护作用^［13-14］。然而，目前尚不清楚Re是否对脑出血引起的学习记忆障碍有缓解作用。本研究探讨Re对脑出血引起的学习记忆障碍的影响及作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Robot脑立体定位仪（德国NeuroStar公司）；KDS310型微量注射器（美国KDS公司）；Morris水迷宫视频分析系统（V2.0，安徽正华生物仪器设备有限公司）；Image-Pro Plus 6.0软件（美国Media Cybernetics公司）；荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

瑞马唑仑（江苏恒瑞医药股份有限公司）；胶原酶Ⅶ（美国Sigma公司）；苏木素-伊红（hematoxylin & eosin， HE）染色试剂盒、4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）均购自北京索莱宝科技有限公司；Nissl染色液和增强型化学发光液均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serumal bumin， BSA，美国ThermoFisher公司）；兔抗离子钙结合适配器分子1（ionized calcium-binding adapter molecule-1， Iba-1）、兔抗髓过氧物酶（myeloperoxidase， MPO）、兔抗神经特异核抗原（neurospecific nucleoprotein， NeuN）、兔抗肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）、兔抗白细胞介素（interleukin， IL）-1β、兔抗IL-6、兔抗B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）、兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、山羊抗兔免疫球蛋白G重链&轻链（immunoglobulin G heavy chain & light chain， IgG H&L）（Alexa Fluor^® 488）均购自美国Abcam公司；兔抗剪切型caspase-3（cleaved caspase-3， cl-caspase-3）、兔抗β-肌动蛋白（β-actin）和抗兔辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）连接的IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒（武汉贝因莱生物科技有限公司）；RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜（美国Millipore公司）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling， Tunel）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）细胞凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Fluoro-Jade C（FJC）染色试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）；DPX封片剂［海德创业（北京）生物科技有限公司］。

1.3 动物

8周龄成年雄性SD大鼠（体质量为200~220 g）购自郑州大学实验动物中心（SYXK（豫）2020-0008），饲养条件为：温度（22±2） ℃，相对湿度（60%±5%），12/12 h明暗周期，自由饮食和饮水。所有动物实验遵循《实验动物护理与使用指南》，并经黄河三门峡医院伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 ICH模型的构建

用右侧尾状核注射胶原酶法建立ICH大鼠模型^［15］。用10 g·L^-1戊巴比妥钠（40 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定在Robot脑立体定位仪上。将前囟和后囟置于同一水平面，在前囟后0.2 mm、中线右侧3.5 mm处的颅骨上钻一个直径约3 mm的小孔，将溶解于2 μL生理盐水中的胶原酶Ⅶ（0.4 IU）以0.2 μL·min^-1的速度用KDS310微量注射器注射到右侧尾状核（前囟后1 mm，中线右侧3 mm，深度6 mm）。注射完毕后，针头在原处停留10 min。颅骨切口用骨蜡封闭。

2.2 动物分组及处理

将大鼠随机分为假手术（Sham）组、ICH组、ICH联合Re组。ICH组和ICH联合Re组大鼠在右侧尾状核内注射0.4 IU胶原酶Ⅶ，Sham组注射相同剂量的生理盐水。ICH联合Re组在胶原酶Ⅶ注射前1 h按20 mg·kg^-1剂量腹腔注射1次Re，然后，在胶原蛋白Ⅶ注射后每12 h注射一次Re。

2.3 Morris水迷宫实验

用Morris水迷宫视频分析系统评价大鼠的学习记忆能力。将大鼠置于直径150 cm，高60 cm，水面以下2 cm处有一个直径为20 cm的透明圆形平台的泳池中。从ICH后第21天开始，每日于固定时间段进行训练，每日4次，连续训练5 d，记录逃避潜伏期。第26天移除平台。记录60 s内大鼠的游泳速度、目标象限停留时间及穿越目标平台的次数。

2.4 神经功能评分

用改良的神经功能缺损评分法^［16］，分别于ICH后24 、72 h评估大鼠的神经功能缺损情况。测试项目包括运动测试、感觉测试、平衡木测试、反射缺失和运动异常等方面，神经功能评分为0~18分（正常评分=0分；最大缺陷评分=18分）。

2.5 脑水肿测量

在ICH后24、72 h，用干湿比评估脑的含水量。麻醉大鼠，收集大鼠脑组织，在分析天平上称定质量，即为湿质量。在100 °C下干燥48 h，得到干质量。脑含水量=［（湿质量-干质量）/湿质量］×100%。

2.6 血肿体积测量

在ICH后72 h，麻醉大鼠，用40 g·L^-1多聚甲醛心脏灌注后，收集脑组织，在40 g·L^-1多聚甲醛中固定3 d后，在入针部位前后进行连续冠状切片，厚度为2 mm。对连续切片进行拍照，并用Image-Pro Plus 6.0软件计算血肿面积。将每个切片的血肿面积相加，乘以切片厚度，计算总血肿体积。

2.7 HE和Nissl染色

脑组织在40 g·L^-1多聚甲醛中固定，石蜡包埋、组织脱水后，进行冠状切片（4 µm厚）。HE染色：脑组织切片，用二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，用HE染色试剂盒中的苏木素染色10 min，盐酸乙醇分化液分化30 s，再用伊红染色2 min。Nissl染色：脑组织切片脱蜡，水化，在0.01 mol·L^-1柠檬酸钠缓冲液中修复5 min。用Nissl染色液染色10 min。经HE和Nissl染色的切片经乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片，于显微镜下观察组织病理变化。

2.8 免疫荧光染色

石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水后，在50 g·L^-1 BSA中封闭1 h。加入兔抗Iba-1、兔抗MPO和兔抗NeuN，4 ℃孵育过夜，用山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor^® 488）在37 ℃黑暗条件下孵育1 h。细胞核用DAPI染色。在荧光显微镜下观察染色结果，并用Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析。

2.9 ELISA

ICH后72 h，麻醉大鼠，收集大鼠心脏血液和脑脊液。血液在室温下静置30 min，使血液凝固，在4 ℃下以3 000 r ·min^-1离心10 min，分离血清。脑脊液在4 ℃下以12 000 r·min^-1离心5 min，收集上清。血清和脑脊液样本于-80 °C保存。用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清和脑脊液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。所有步骤按说明书进行。

2.10 蛋白质印迹法（Western blotting）

用RIPA裂解缓冲液裂解脑组织。裂解液以10 000 r·min^-1离心5 min，取上清。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，蛋白质在120 g·L^-1 SDS-PAGE上电泳90 min，然后转移到PVDF膜上。用50 g·L^-1 BSA室温封闭1 h，然后用兔抗Iba-1、兔抗MPO、兔抗TNF-α、兔抗IL-1β、兔抗IL-6、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗caspase-3、兔抗cl-caspase-3和β-actin在4 ℃孵育过夜，然后用抗兔HRP连接的IgG室温孵育1 h，用增强型化学发光液检测免疫信号。通过Image-Pro Plus 6.0软件分析各蛋白的灰度值，蛋白相对表达量是目标蛋白与β-actin的灰度值之比。

2.11 Tunel-NeuN双免疫荧光染色

用NeuN和Tunel双荧光免疫染色检测神经元的凋亡情况。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水、50 g·L^-1 BSA封闭后，用NeuN抗体在4 ℃孵育过夜。然后用Tunel-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行Tunel染色。实验步骤按说明书进行。用荧光显微镜观察染色结果并用Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析。

2.12 FJC染色

用FJC染色试剂盒进行退化神经元染色。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，在10 g·L^-1 NaOH中浸泡5 min，然后在体积分数为70%的乙醇中浸泡2 min。用0.6 g·L^-1高锰酸钾溶液孵育10 min后，0.001 g·L^-1 FJC溶液/1 ml·L^-1醋酸孵育10 min，DAPI染色5 min。在50 ℃干燥5 min，二甲苯中浸泡1 min，最后用DPX封片剂封片。用荧光显微镜观察切片，Image-Pro Plus 6.0软件计数FJC阳性神经元，以“阳性细胞/mm²”表示。

2.13 统计学方法

所有数据用（\overline{x}±s）表示。用单因素方差分析进行统计学分析，用Tukey事后检验进行多重比较。用Prism 9.3软件进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Re减轻脑出血引起的神经功能缺损和脑水肿

ICH组大鼠在脑出血后24、72 h的神经功能缺损均显著高于Sham组，Re处理后，神经功能缺损明显好转。与Sham组比较，脑出血大鼠脑含水量明显升高，Re组脑含水量则显著减少。表明Re可减轻由脑出血引起的神经功能缺损和脑水肿。见表1。

3.2 Re减轻脑出血引起的脑损伤

ICH后第3天，Sham组大鼠脑切片无血肿出现，ICH大鼠脑切片中有大量的血肿组织；Re注射大鼠脑切片的血肿体积显著小于ICH组大鼠。见图1A和表2。HE染色结果表明，Sham组大鼠海马CA1区结构正常，神经元排列有序，细胞核清晰，核仁明显，胞质丰富；ICH组大鼠神经元大量肿胀，结构疏松，核固缩，形成一定的空泡结构；与ICH组比较，Re处理可明显改善由ICH诱导的海马神经元病理学改变，见图1B。Nissl染色结果显示，Sham组大鼠海马神经元中含有大量Nissl小体，ICH组Nissl小体数量明显减少，注射Re可显著增加Nissl小体数量，见图1B和表2。结果表明，Re可减轻由脑出血引起的脑损伤。

3.3 Re改善脑出血引起的学习记忆障碍

通过Morris水迷宫实验检测脑出血对大鼠学习及记忆能力的影响。有平台和无平台时各组大鼠的游泳路径见图2。在有平台时，ICH组大鼠逃避潜伏期较Sham组明显延长；ICH联合Re组大鼠逃避潜伏期较ICH组明显缩短，见表3。移除平台后，3组大鼠游泳速度无明显差异。但是，与Sham组比较，ICH组大鼠在目标象限的停留时间明显缩短，穿越目标平台的次数明显减少；Re可显著延长脑出血大鼠在目标象限的停留时间并增加穿越目标平台的次数，见表4。上述结果表明，Re可显著改善脑出血大鼠的记忆功能。

3.4 Re抑制脑出血引起的炎症反应

用免疫荧光染色检测大鼠脑组织中Iba-1和MPO阳性细胞数量。结果显示，与Sham组比较，ICH组Iba-1和MPO阳性细胞数量显著增加。与ICH组比较，Re处理后Iba-1和MPO阳性细胞数量明显降低，见图3A、图3B和表5。用Western blotting检测脑组织中Iba-1、MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平。结果表明，ICH大鼠脑组织中Iba-1、MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平明显高于Sham组，Re则明显下调上述蛋白的表达水平，见图3C和表6。此外，ICH能显著提高大鼠血清和脑脊液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，Re可抑制由ICH诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，见表7。上述结果表明，Re可抑制由脑出血引起的炎症反应。

3.5 Re抑制脑出血引起的神经细胞凋亡

FJC染色结果显示，ICH组大鼠脑组织中FJC阳性细胞数较Sham组明显增多；Re组脑出血引起的退化神经元数目则减少，见图4A。Tunel和NeuN双免疫荧光染色结果表明，ICH后，大鼠脑组织中Tunel阳性细胞数显著增多，与ICH组比较，ICH联合Re组Tunel阳性细胞数明显减少，见图4B。FJC和Tunel阳性细胞数定量结果见表8。此外，与Sham组比较，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平在ICH大鼠脑组织中明显降低，促凋亡分子Bax和cl-caspase-3水平则明显增加；Re可上调Bcl-2的表达水平而下调Bax和cl-caspase-3的表达水平，见图4C和表9。上述结果表明，Re可抑制脑出血大鼠神经元的退化和凋亡。

4 讨论

脑出血是第二常见的中风类型，约50%的患者在脑出血后存活超过1年，并且幸存者会出现后遗症^［1］。目前尚无特别有效的治疗方法。尽管脑出血的病理生理机制尚不完全清楚，但由神经炎症、细胞凋亡和氧化应激等介导的的继发性损伤是加重脑出血所致损伤的关键因素^［17］。因此，具有抗炎、抗氧化和抑制神经元凋亡作用的药物有助于减轻由脑出血引起的损伤。

脑出血引起的认知障碍和神经损伤严重影响患者的生活质量。中风患者普遍存在认知缺陷^［18］，认知障碍是脑出血后的常见症状，超过1/3的患者存在记忆障碍^［2］。由脑出血引起的神经损伤可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤。研究发现，原发性脑损伤是血肿的质量效应，而神经炎症是脑出血后导致继发性脑损伤的重要病理生理因素^［19］。神经炎症是脑实质内检测到血液成分后立即发生的宿主防御反应，脑出血后，血肿周围大量炎症因子释放，可募集更多外周免疫细胞向血肿周围区域浸润，进一步导致促炎细胞因子、趋化因子、自由基和其他潜在毒性化学物质的释放，引起炎症级联反应，加重血肿周围水肿，导致血脑屏障破坏和细胞死亡^［20］。脑水肿是血肿周围炎症和组织损伤重要的标志物之一，在脑出血后第3天达到峰值^［21］。本研究结果表明，脑出血后24、72 h，大鼠出现明显的神经功能缺损和脑内含水量增加；脑出血后3 d，脑组织出现明显的组织病理学损伤；脑出血后26 d，大鼠记忆能力明显下降。Re可明显改善脑出血大鼠神经功能缺损、脑水肿及学习记忆障碍，减轻脑组织病理学损伤。

小胶质细胞是典型的中枢神经系统的常驻免疫细胞，在神经炎症中发挥重要作用。脑出血后，静息的小胶质细胞被激活，从血液迁移至中枢神经系统，并在中枢神经系统实质中成熟为巨噬细胞，类似的细胞表面标志包括CD11b和Iba-1在脑源性小胶质细胞和外周巨噬细胞上表达^［22］。脑出血早期，小胶质细胞/巨噬细胞被激活为M1型并分泌促炎细胞因子，例如IL-1β、TNF-α等^［23］。脑出血动物模型显示，M1型小胶质细胞在脑出血开始后3 h内开始升高，3 d后达到峰值，1周后缓慢恢复正常范围^［24］。在脑出血继发性损伤过程中，小胶质细胞/巨噬细胞会分泌多种参与促炎反应的白细胞介素，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12和IL-6等，它们可以激活内皮细胞，通过趋化因子吸引外周淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞聚集，从而使炎症加剧^［25］。从外周血募集到脑出血区域的中性粒细胞可以分泌TNF-α、活性氧和基质金属蛋白酶等，进一步加剧脑损伤^［26］。本研究结果显示，与假手术组比较，脑出血后72 h脑组织中Iba-1阳性小胶质细胞和MPO阳性中性粒细胞数量显著增加，脑组织中Iba-1、MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平及血清和脑脊液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高。Re则显著减少Iba-1阳性小胶质细胞和MPO阳性中性粒细胞数量，降低Iba-1、MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平及TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。结果表明，Re可抑制由脑出血引起的炎症反应。

海马体是大脑中负责记忆形成的部分，海马神经元退化和丢失是导致记忆障碍的主要原因^［27］。脑出血可导致血肿周围和远端大脑区域的细胞死亡，细胞凋亡与脑出血诱导的神经细胞死亡密切相关。脑出血可导致凝血酶和活性氧的过量释放，触发由Bax介导的广泛线粒体外膜通透性的形成，从而启动脑出血后不可逆的凋亡途径。Bcl-2可通过直接结合Bax的BH1、BH2和BH3结构域拮抗这种线粒体外膜渗透作用^［28］。既往研究结果表明，脑出血小鼠Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平明显降低^［29］。Caspase-3的活化是出血性脑损伤后细胞凋亡的重要标志^［30］。海马中Tunel阳性和caspase-3阳性细胞数量的增加表明海马中凋亡神经元细胞死亡的增强^［31］。研究表明，Re可通过上调老年大鼠海马Bcl-2蛋白的表达而抑制神经元凋亡^［32］。本研究结果显示，脑出血后72 h，FJC和Tunel-NeuN阳性细胞数量显著增加，同时伴有Bax蛋白表达的上调及Bcl-2蛋白表达的下调。与上述结果相一致，Re则减少FJC和Tunel-NeuN的阳性细胞数量及降低Bax蛋白的表达水平，增加Bcl-2蛋白的表达水平。结果表明，Re可能通过抑制神经元凋亡而减轻脑出血引起的记忆功能下降。

综上所述，Re可改善脑出血大鼠神经功能缺损、脑水肿、记忆功能障碍及组织病理学损伤，减少神经炎症和神经元细胞凋亡。Re可能通过抑制神经炎症和神经元凋亡改善由脑出血引起的学习记忆障碍。

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基金资助

二〇二二年度河南省医学科技攻关计划项目(202202131)