生物活性脂类淫羊藿苷和卡里丁通过调节炎症基因和可塑性相关基因蛋白1促进脑卒中神经功能恢复的机制

Mechanism of bioactive lipids icariin and caridin on promoting neurofunctional recovery via regulating inflammatory genes and plasticity related gene 1 after stroke

摘要

目的 探讨生物活性脂类调节炎症基因和可塑性相关基因蛋白1（plasticity related gene 1，PRG-1）促进脑卒中神经功能恢复的机制。 方法 将小鼠（n=30）随机分为5组：假手术组、大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠模型组、MCAO联合依达拉奉组、MCAO联合淫羊藿苷（icariin，ICA）组和MCAO联合卡里丁（caridin，ICT）组。比较各组神经学评分，进行梗死体积的测定和组织病理学检测，用Tunel测定晚期凋亡细胞的DNA片段，用蛋白质印迹法分析凋亡蛋白（cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2和Bax）、炎症基因（catalase、SOD1、caveolin-1、e-NOS和i-NOS）和PRG-1，用TBARS检测试剂盒检测MDA的水平。 结果 MCAO组体质量（19.56%±2.65%）减轻、梗死体积（占对侧面积百分比）（63.12%±3.05%）和mNSS评分［（12.32±1.13）分］均显著增加，ICA治疗后，小鼠体质量（9.51%±1.61%）、梗死面积（6.51%±1.21%）、mNSS（3.51±1.01）显著降低；ICT治疗后，小鼠体质量（7.51%±1.61%）、梗死体积（5.55%±1.21%）、mNSS（3.01±1.21）显著降低。在MCAO小鼠的脑海马体和皮层中明显观察到Tunel阳性细胞，经ICA和ICT治疗均可有效逆转。MCAO组皮质和海马体中裂解半胱天冬酶-3（3.78±3.05）（16.72±2.19）、裂解PARP（4.12±3.11）（3.82±3.95）和Bax（5.92±2.15）（3.52±1.15）的蛋白表达水平均显著升高，而MCAO组皮质和海马体中Bcl-2蛋白（0.12±0.05）（0.31±0.09）的表达水平均显著降低。ICA治疗后，小鼠皮质和海马体中裂解半胱天冬酶-3（1.54±0.61）（6.21±1.01）、Bax（2.12±0.67）（0.98±0.85）显著降低、Bcl-2蛋白（0.51±0.11）水平显著升高。ICT治疗后，小鼠皮质和海马体中裂解半胱天冬酶-3［（1.31±1.11）（4.52±1.21）］、Bax［（2.12±0.85）（1.08±0.25）］均显著降低、Bcl-2蛋白（0.51±0.06）水平显著升高。MCAO小鼠皮层和海马体中过氧化氢酶（0.68±0.07）（0.42±0.19）和SOD-1［（0.44±0.08）（0.47±0.11）］的蛋白表达水平显著降低，用ICA和ICT处理均显著逆转了SOD-1蛋白表达水平的降低，同时部分逆转了过氧化氢酶蛋白表达水平的降低。与假手术组比较，MCAO组caveolin-1蛋白的表达水平［（0.48±0.07）（0.62±0.11）］降低，而eNOS［（3.45±1.05）（3.02±0.87）］和iNOS［（3.78±0.85）（2.72±1.01）］蛋白的表达水平均升高，ICT预处理有效逆转了MCAO小鼠皮层和海马体中eNOS和iNOS蛋白表达水平的变化。此外，MCAO小鼠大脑中脂质过氧化产物MDA的水平在MCAO小鼠中显著升高，ICA和ICT处理均可逆转。MCAO小鼠皮层和海马体中PRG-1的蛋白表达水平显著降低，ICA和ICT处理均显著逆转了PRG-1蛋白表达水平的降低，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 ICA和ICT治疗可以预防缺血性卒中损伤相关的氧化/亚硝化应激、细胞凋亡和增加PRG-1表达，ICA和ICT可能具有神经保护作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which bioactive lipids regulate inflammatory genes and plasticity-related gene 1 （PRG-1） to promote neurofunctional recovery after stroke. Methods Mice （n=30） were randomly divided into 5 groups： sham surgery group， middle cerebral artery occlusion （MCAO） model group， MCAO combined with edaravone group， MCAO combined with icariin （ICA） group， and MCAO combined with caridin （ICT） group. Neurological scores were compared among the groups， infarct volume was measured， and histopathological examinations were conducted. Tunel staining was used to detect late apoptotic cells by DNA fragmentation. Western blotting was employed to analyze apoptotic proteins （cleaved-caspase-3， cleaved-PARP， Bcl-2， and Bax）， inflammatory genes （Catalase， SOD1， Caveolin-1， e-NOS， and i-NOS）， and PRG-1. The levels of malondialdehyde （MDA） were detected using a TBARS assay kit. Results The MCAO group exhibited significant increases in body weight loss （19.56%±2.65%）， infarct volume （63.12%±3.05% of contralateral area）， and modified neurological severity score （mNSS） ［12.32±1.13］. After ICA treatment， the body weight loss （9.51%±1.61%）， infarct area （6.51%±1.21%）， and mNSS （3.51±1.01） were significantly reduced. Similarly， ICT treatment led to significant reductions in body weight loss （7.51%±1.61%）， infarct volume （5.55%±1.21%）， and mNSS （3.01±1.21）. Tunel-positive cells were prominently observed in the hippocampus and cortex of MCAO mice， which were effectively reversed by ICA and ICT treatments. In the MCAO group， protein expression levels of cleaved-caspase-3 ［（3.78±3.05） in cortex， （16.72±2.19） in hippocampus］， cleaved-PARP ［（4.12±3.11） in cortex， （3.82±3.95） in hippocampus］， and Bax ［（5.92±2.15） in cortex， （3.52±1.15） in hippocampus］ were significantly elevated， while Bcl-2 protein levels ［（0.12±0.05） in cortex， （0.31±0.09） in hippocampus］ were significantly decreased. ICA treatment significantly reduced cleaved-caspase-3 ［（1.54±0.61） in cortex， （6.21±1.01） in hippocampus］ and Bax ［（2.12±0.67） in cortex， （0.98±0.85） in hippocampus］ levels， while increasing Bcl-2 protein levels （0.51±0.11）. ICT treatment also significantly reduced cleaved-caspase-3 ［（1.31±1.11） in cortex， （4.52±1.21） in hippocampus］ and Bax ［（2.12±0.85） in cortex， （1.08±0.25） in hippocampus］， and increased Bcl-2 protein levels （0.51±0.06）. Protein expression levels of catalase ［（0.68±0.07） in cortex， （0.42±0.19） in hippocampus］ and SOD-1 ［（0.44±0.08） in cortex， （0.47±0.11） in hippocampus］ were significantly decreased in MCAO mice， which were significantly reversed by ICA and ICT treatments. Compared with the sham group， caveolin-1 protein levels ［（0.48±0.07） in cortex， （0.62±0.11） in hippocampus］ were decreased in the MCAO group， while eNOS ［（3.45±1.05） in cortex， （3.02±0.87） in hippocampus］ and iNOS ［（3.78±0.85） in cortex， （2.72±1.01） in hippocampus］ protein levels were increased. ICT pretreatment effectively reversed the changes in eNOS and iNOS protein expression in the cortex and hippocampus in MCAO mice. Additionally， the levels of lipid peroxidation product MDA were significantly increased in the brains of MCAO mice， which were reversed by ICA and ICT treatments. PRG-1 protein expression levels were significantly decreased in the cortex and hippocampus of MCAO mice， which were significantly reversed by ICA and ICT treatments （P<0.05）. Conclusion ICA and ICT treatments can prevent oxidative/nitrosative stress， cell apoptosis， and increase PRG-1 expression associated with ischemic stroke injury， suggesting potential neuroprotective effects.

Graphical abstract

关键词

生物活性脂类 / 淫羊藿苷 / 卡里丁 / 炎症基因 / 可塑性相关基因蛋白1 / 脑卒中 / 神经功能

Key words

bioactive lipids / icariin / caridin / inflammatory genes / plasticity-related gene 1 / stroke / neurological function

据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计，脑卒中是世界第二大死亡原因，许多国家用于脑卒中的医疗保健支出占总支出的3%~4%^［1-2］。缺血性脑卒中是指由血栓或动脉粥样硬化引起血管堵塞，导致的大脑血液供应中断^［3］。在缺血性脑卒中，低水平的氧气被输送到大脑中，唤起缺氧反应信号，再灌注损伤相关网络^［4］。缺血性脑卒中期间梗死周围去极化次数增加，可扩大梗死区域，凋亡神经元细胞死亡和纤维化蛋白的积累会导致永久性脑损伤。传统溶栓剂（包括纤溶酶原激活剂）对缺血性卒中的治疗效果有限^［5］。因此，迫切需要探索缺血性脑卒中预防或治疗的医学策略。

淫羊藿苷（icariin，ICA）和卡里丁（caridin，ICT）均是从中药角质山羊草（也称为阴阳火和淫羊藿）中分离出的黄酮类化合物，具有多种生物活性，包括对β淀粉样蛋白诱导的神经毒性具有保护神经、调节免疫和抗癌作用^［6］。在实验性阿尔茨海默病模型中，ICA和ICT已被用于改善记忆和学习能力，ICT具有抗炎特性并可调节小鼠脑皮质细胞中的氯化物流入或作为抗氧化剂来防止神经元细胞的氧化应激^［7］。研究发现，ICA可以保护小鼠和大鼠的大脑免受缺血再灌注损伤。此外，也有研究报道，ICT对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的神经具有保护作用^［8］。然而，ICA和ICT对急性脑缺血性脑卒中的影响和机制尚不明确。本研究探究生物活性脂类调节炎症基因和可塑性相关基因（plasticity related gene 1，PRG-1）促进脑卒中神经功能恢复的机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PF6000型点式激光多普勒血流仪（瑞典Perimed公司）；TS2型荧光显微镜（日本Nikon公司）；GENESYS™ 40/50 Vis/UV-Vis分光光度计（Thermofisher赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药

依达拉奉（edaravone，E，Selleck Chemicals公司）；ICA、ICT、2，3，5-三苯基氯化四唑、苏木精和伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色试剂、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚、放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation，RIPA）试剂盒均购自Sigma-Aldrich公司；二辛可宁酸（dicinchoninic acid，BCA）蛋白质测定试剂盒（赛默飞世尔科技公司）；硫代巴比妥酸反应物质（thibarbituric acid reactive substances，TBARS）检测试剂盒（开曼化学公司）。

1.3 动物

雄性C57BL/6J小鼠购自河北北方学院附属第二医院动物房。

2 方法

2.1 分组

选择5~7周龄的雄性C57BL/6J小鼠进行实验，经医院动物伦理委员会审核、批准。将小鼠饲养在受控温度以及光周期条件（12 h光照/黑暗）下，自由获取食物和水。将小鼠（n=30）随机分为5组，分别为假手术组、MCAO组、MCAO联合E组（阳性对照）、MCAO联合ICA（60 mg∙kg^-1）组、MCAO联合ICT（60 mg·kg^-1）组。

2.2 脑缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤模型的构建

局灶性脑缺血前腹膜内注射（intraperitoneal injection，ip）给予药物E、ICA和ICT，后进行MCAO手术。通过吸入异氟醚的方式麻醉小鼠，颈部做中间切口手术，分离左颈总动脉。将6.0尼龙线从颈外动脉切口插入大脑中动脉闭塞50 min，用激光多普勒监测MCAO小鼠的脑血流，在无尼龙线插入的情况下，对假手术组也进行相同的操作。再灌注24 h后，对所有小鼠实施安乐死，并观察缺血性中风信号。在MCAO手术期间和手术后，通过温度控制加热垫使小鼠的直肠温度保持在37.0 ℃。

2.3 神经学评分的评估

用改良神经严重程度评分（improved neurological severity score，mNSS）评估神经损伤情况，评分范围为0~14分（正常分数为0分；最大缺陷评分为14分），11~14分为严重损伤，6~10分为中度损伤，1~5分为轻伤。

2.4 梗死体积的测定和组织病理学的检测

评估行为和神经元功能后，对小鼠实施安乐死，分离大脑并切成2 mm厚的冠状切片。组织切片用体积分数为20 mL·L^-1的2，3，5-三苯基氯化四唑（triphenyltetrazole chloride，TTC）在37 ℃下染色20 min。在活体脑组织中，TTC被线粒体酶还原为红色，而无色区域被判定是梗死区域。拍摄TTC染色切片，并通过ImageJ软件分析梗死体积百分比，将梗死区域相加并除以切片的总体积，切片总体积以对侧半球体积的百分比表示。制备脑组织并检测组织病理学，将石蜡包埋的4 μm切片用H&E染色以检查组织学。

2.5 末端脱氧核苷酸转移酶 （terminal deoxynucleotide transferase，TdT） dUTP缺口末端标记 （TdT-mediated dUTP nick-end labeling，Tunel）测定

Tunel测定由死胡同™荧光Tunel系统测定，该程序遵循制造商的说明来检测晚期凋亡细胞的DNA片段，将脑载玻片在60 ℃下脱蜡30 min，转移到二甲苯缓冲液中进行洗涤，用含8.5 mL·L^-1 NaCl的乙醇/盐水缓冲液进行再水化，切片用多聚甲醛固定15 min，用盐水缓冲液洗涤载玻片，并在37 ℃的黑暗湿度室中用100 μL TdT孵育缓冲液孵育1 h，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）切片，用荧光显微镜检测荧光素-12-dUTP标记的DNA。

2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）

收集皮层和海马体的脑组织，用RIPA缓冲液处理，以13 000 r·min^-1离心30 min，用BCA蛋白质测定试剂盒定量蛋白质后，将10 μg上清液与十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）缓冲液在95 ℃下加热10 min，用体积分数10%~15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白质样品，转膜，用50 mL·L^-1的脱脂牛奶封闭膜，将其溶解在1 mL·L^-1 TBST［50 mmol·L^-1 Tris-HCl（pH 7.5），150 mmol·L^-1 NaCl，1 mL·L^-1吐温20］缓冲液中1 h，将样品与CD31一抗在4 ℃下过夜，用10 mL·L^-1TBST洗涤样品3次，每次10 min。然后与HRP偶联的二抗孵育1 h，用Image J软件对蛋白质表达水平进行密度定量，并通过β-肌动蛋白进行标准化。

2.7 脂质过氧化物TBARS水平的测量

测量丙二醛（malondialdehyde，MDA）脂质过氧化产物的水平，用TBARS检测试剂盒进行MDA的比色测量，收集皮层和海马体的脑组织，在组织匀浆中进行硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）和MDA之间的反应，用赛默飞分光光度计（Thermofisher公司）检测在540 nm处的吸光度。

2.8 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行处理。所有资料以（\overline{x}±s）表示，多组间差异通过单因素方差分析，数据表示来自3个独立实验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ICA和ICT对脑卒中小鼠神经功能和脑病理变化作用

为了评估神经保护效果，在小鼠MCAO手术前对ICA、ICT和依达拉奉进行了预处理。研究结果表明MCAO组体质量（19.56%±2.65%）减轻、梗死体积（占对侧面积百分比）（63.12%±3.05%）和mNSS评估（12.32±1.13）均显著增加，ICA治疗后，小鼠体质量（9.51%±1.61%）、梗死体积（6.51±1.21%）、mNSS（3.51±1.01）显著降低；ICT治疗后，小鼠体质量（7.51%±1.61%）、梗死体积（5.55%±1.21%）、mNSS（3.01±1.21）显著降低。依达拉奉治疗后，体质量（16.53%±1.91%）、梗死体积（5.01%±1.24%）（3.79±1.13）显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。MCAO小鼠大脑皮层和海马的组织病理学改变表现为局部广泛神经元坏死，神经元细胞丢失伴神经皮细胞质空泡化，不规则萎缩神经元细胞数量增加及细胞核萎缩，MCAO手术后，脑皮层中也出现了出血点，表明MCAO小鼠大脑皮层和海马体中的组织病理学变化可以通过ICA和ICT治疗有效逆转。见图1。

3.2 ICA和ICT对脑卒中小鼠大脑中的神经元细胞的凋亡作用

本研究为了评估缺血脑中凋亡细胞的数量，进行了Tunel染色以检测凋亡细胞的片段DNA。Tunel阳性细胞显示为绿色，而细胞核被DAPI染色为蓝色。在MCAO小鼠的脑海马体和皮层中明显观察到Tunel阳性细胞，通过ICA和ICT治疗，Tunel阳性细胞显著降低。通过Western blotting确定的大脑海马体和皮层中细胞凋亡相关信号分子的蛋白表达水平。MCAO组皮质和海马体中裂解半胱天冬酶-3（3.78±3.05）（16.72±2.19）、裂解PARP（4.12±3.11）（3.82±3.95）和Bax（5.92±2.15）（3.52±1.15）的蛋白表达水平显著升高，而MCAO组Bcl-2蛋白（0.12±0.05）（0.31±0.09）表达显著降低，而ICA预处理后，小鼠皮质和海马体中裂解半胱天冬酶-3（1.54±0.61）（6.21±1.01）、Bax（2.12±0.67）（0.98±0.85）表达水平显著降低、Bcl-2蛋白（0.51±0.11）表达水平显著升高；ICT预处理后，小鼠皮质和海马体中裂解半胱天冬酶-3（1.31±1.11）（4.52±1.21）、Bax（2.12±0.85）（1.08±0.25）表达水平显著降低、Bcl-2蛋白（0.51±0.06）表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

3.3 ICA和ICT对脑卒中小鼠大脑中炎症基因的作用

MCAO小鼠皮层和海马体中过氧化氢酶（0.68±0.07）（0.42±0.19）和SOD-1（0.44±0.08）（0.47±0.11）的蛋白表达水平显著降低，ICT处理后SOD-1蛋白（0.78±0.11）（0.82±0.19）和ICA处理后，SOD-1蛋白（0.82±0.08）（0.72±0.12）显著升高，同时部分过氧化氢酶蛋白表达升高。MCAO组小鼠皮层和海马体中caveolin-1的蛋白表达水平（0.48±0.07）（0.62±0.11）降低，而eNOS（3.45±1.05）（3.02±0.87）和iNOS（3.78±0.85）（2.72±1.01）蛋白表达水平均升高，ICT预处理有效升高了MCAO小鼠皮层和海马体中eNOS（1.18±0.45）（0.92±0.29）和iNOS（1.08±0.05）（0.82±0.19）蛋白表达水平。此外，MCAO小鼠大脑中脂质过氧化产物MDA的水平（1.32±0.45）显著升高，ICA处理后MDA（0.73±0.15）显著升高；ICT处理后，MDA（0.78±0.09）显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3.4 ICA和ICT对脑卒中小鼠大脑中PRG-1的作用

观察了急性缺血性中风小鼠中PRG-1蛋白质表达水平的变化，MCAO小鼠皮层和海马体中PRG-1（0.35±0.15）（0.32±0.17）的蛋白表达水平显著降低，ICT处理后，小鼠皮层和海马体中PRG-1（0.45±0.12）（0.62±0.14）表达水平升高；ICA处理后，小鼠皮层和海马体中PRG-1（0.56±0.14）（0.42±0.15）表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

4 讨论

脑卒中会导致长期残疾，而重组组织纤溶酶原激活剂作为FDA批准的第一种用于脑卒中的溶栓剂，已经在临床应用了十年，目前的治疗脑卒中的药物仍然存在问题和争议^［9］。本研究结果发现ICA和ICT在脑卒中治疗中具有神经保护功能，主要是通过降低脑卒中炎症基因表达水平以及提高PRG-1表达水平实现的。

研究表明，脑卒中的治疗策略包括寻找神经保护剂，如抗氧化剂、抗炎药和抗动脉粥样硬化药物^［10］。ICA和ICT是来自淫羊藿的生物活性化合物，已被证明具有抗氧化和抗动脉粥样硬化的生物学特性，给予ICA可缓解MCAO小鼠缺血再灌注诱导的脑损伤^［11-12］。近期，有研究表明再灌注前腹膜内注射剂量为3 mg·kg^-1·d^-1的ICT对I/R小鼠具有神经保护作用^［13］。在这项研究中，腹腔注射60 mg·kg^-1剂量的ICA和ICT均能有效改善急性脑缺血卒中小鼠的脑损伤，ICT的疗效似乎略优于ICA^［12］。相关研究显示，在阿尔茨海默病的细胞模型中，ICT在降低GSK-3β和磷酸化Tau水平方面的效果略优于ICA^［14］。综上所述，ICA和ICT对脑卒中患者可能具有神经保护功能。

缺血性卒中的进展可诱导应激信号的激活、缺氧、氧-葡萄糖剥夺和氧化/亚硝化应激，导致大脑进一步出现神经炎症和纤维化^［15］。研究显示脑损伤再灌注损伤可能表现为活性氧（active oxygen，ROS）/活性氮（active nitrogen，RNS）反应，EMC蛋白表达及其相关蛋白如基质金属蛋白酶变化、基底膜改变和炎症诱导等^［16］。研究表明ICT预处理可有效防止脑缺血再灌注小鼠大脑的神经炎症反应和氧化损伤。另一方面，脑缺血卒中诱导的细胞凋亡是神经元死亡的重要原因^［17］。在急性脑缺血中，自由基的过量产生、Ca²⁺过载和兴奋性毒性可能是启动细胞凋亡的关键因素，凋亡蛋白和抗凋亡蛋白均被认为在缺血性脑卒中后半暗区同时过表达^［18］。在本研究中，ICA和ICT可减轻MCAO小鼠海马和皮层中病理变化、减少Tunel阳性神经元细胞数量、降低抗凋亡蛋白表达和ROS/RNS相关信号分子的失衡。综上所述，ICA和ICT可以预防缺血性卒中损伤相关的氧化/亚硝化应激和大脑凋亡。

研究显示，海马PRG-1通过调节谷氨酸能连接在维持突触稳态中发挥重要作用，小鼠PRG-1缺失导致癫痫发作和兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic current，EPSC）增加，这进一步证实了PRG-1在调节海马兴奋性中的重要作用^［19］。研究发现PRG-1在临床和组织学证实的癫痫发作和帕金森病患者的黑质中存在差异调节^［20］。目前，对PRGs家族的研究主要集中在神经精神疾病和癫痫等神经损伤方面^［21］。在本研究中，ICA和ICT也可提高MCAO小鼠海马和皮层中PRG-1的表达水平。

综上所述，ICA和ICT可预防缺血性卒中损伤相关的氧化/亚硝化应激、大脑凋亡和增加PRG-1表达，ICA和ICT对脑卒中患者可能具有神经保护功能。为脑卒中的有效治疗提供一定的策略。

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基金资助

河北省中医药管理局科研计划项目(2024325)