基于鼠类肉瘤病毒癌基因信号通路探究\mathit{\alpha }-番茄碱对肝癌细胞糖酵解的机制

Exploring the mechanism of \mathit{\alpha }-tomatine on glycolysis in hepatocellular carcinoma cells based on KRAS signaling pathway

摘要

目的 探讨α-番茄碱基于鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene， KRAS）信号通路作用于肝癌细胞糖酵解的机制。 方法 将肝癌细胞系随机均分为对照组、α-番茄碱低剂量（1 μmol·L^-1）组、α-番茄碱中剂量（2 μmol·L^-1）组、α-番茄碱高剂量（5 μmol·L^-1）组，经过多实验筛选，最终确定5 μmol·L^-1的α-番茄碱作为人肝癌细胞干预浓度。将Huh7细胞随机均分为对照组、α-番茄碱组、LY294002抑制剂组（25 μmol·L^-1）、α-番茄碱（5 μmol·L^-1）联合LY294002（25 μmol·L^-1）抑制剂组。用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide， MTT］法测定细胞活力，用穿越小室（Transwell）实验测定细胞的侵袭能力，用划痕实验测定细胞的迁移能力；用蛋白质印迹法（Western blotting）分析B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X， Bax），KRAS和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）蛋白的表达情况；用邻甲苯胺法检测葡萄糖含量，用对羟基联苯比色法检测乳酸释放量，用比色法检测细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）含量。 结果 MTT实验结果表明，α-番茄碱对Huh7细胞增殖有明显的抑制作用。同时，α-番茄碱能抑制细胞侵袭和迁移，抑制葡萄糖消耗、乳酸释放和降低ATP含量，促进细胞凋亡。α-番茄碱在Huh7细胞中激活mTOR/PI3K信号通路，并通过mTOR/PI3K信号通路促进细胞凋亡，抑制细胞的侵袭和迁移能力，进一步抑制糖酵解。 结论 α-番茄碱通过mTOR/PI3K信号通路抑制糖酵解，降低肝癌细胞的活性及侵袭和迁移能力。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of α-tomatine based on the kirsten rat sarcoma viral oncogene （KRAS） signaling pathway in the glycolysis of hepatoma cells. Method Hepatocellular carcinoma cell lines were randomly divided into 4 groups： control， low （1 μmol·L^-1）， medium （2 μmol·L^-1）， and high （5 μmol·L^-1） dose groups. 5 μmol·L^-1 of α-tomatine was finally chosen to treat Huh7 cells basing on several experiments. Huh7 cells were also randomly assigned to a control group， an α-tomatine group， a LY294002 inhibitor （25 μmol·L^-1） group， and an α‍-tomatine （5 μmol·L^-1） combined with LY294002 inhibitor （25 μmol·L^-1） group. Cell viability was assessed using the 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） assay， invasion ability was evaluated through the Transwell assay， and migration ability was measured using the scratch assay. Western blot analysis was conducted to assess the protein expressions of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X （Bax）， kirsten rat sarcoma viral oncogene （KRAS）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）. Glucose content was measured using the o-toluidine method， lactic acid release was quantified via p-hydroxy biphenyl colorimetry， and adenosine triphosphate （ATP） content was determined through colorimetric analysis. Results The MTT assay results indicated that α-tomatine significantly inhibited the proliferation of Huh7 cells. Additionally， α‍-tomatine reduced cell invasion and migration， glucose consumption， lactic acid release， and ATP production， but promoted apoptosis. It was found that α‍-tomatine activated the mTOR/PI3K signaling pathway in Huh7 cells. The pro-apoptotic capacity， anti-invasive and anti-migratory abilities， and thereby anti-glycolysis ability of α-tomatine were dependent on the activation of mTOR/PI3K signaling pathway. Conclusion α-tomatine inhibited glycolysis， and the proliferation， invasion and migration of hepatoma cells through activating mTOR/PI3K signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

α-番茄碱 / 肝癌 / 肉瘤病毒癌基因 / 糖酵解

Key words

α-tomatine / liver cancer / kirsten rat sarcoma viral oncogene / glycolysis

最新的全球癌症统计数据显示，原发性肝癌的发病率排名第6，死亡率排名第3^［1］。在中国，肝癌的发病率和死亡率分别排名第5和第2^［2］。癌症有6个特征，包括持续增殖信号转导、逃避生长抑制、抵抗细胞死亡、复制永生、诱导血管生成以及侵袭和转移激活^［3］，均会导致癌症呈现出恶性生物学特性。最近，有新的理论提出，能量代谢重编程可能是癌症的另一个标志^［4］。研究发现，与正常细胞通过线粒体中的氧化磷酸化分解代谢葡萄糖不同，肿瘤细胞即使在常氧下，也倾向于将葡萄糖转化为乳酸，这种现象称为“Warburg效应”或“有氧糖酵解”。已有研究将靶向癌细胞异常能量代谢的有氧糖酵解抑制剂用于癌症治疗^［5］。肝脏是主要的代谢器官，靶向需氧糖酵解的治疗可能对肝癌的治疗有效。

α-番茄碱是西红柿中天然存在的甾体配糖生物碱，在西红柿的花、叶、花萼和未成熟果实中含量丰富（鲜质量分别为1.10、0.98、0.80、0.47 g·kg^-1）^［6］。在植物中，α-番茄碱可以防御病原真菌、细菌和病毒^［7］。近年来，研究发现α-番茄碱具有多种生物活性，如抗癌、抗病毒和抗炎活性。α-番茄碱还可以抑制几种培养癌细胞系的生长，如人前列腺癌细胞（lymph node carcinoma of the prostate，LNCaP）、人慢性粒细胞（K562 cell，K562）和人急性早幼粒细胞（leukemia myeloid cells，HL60）细胞^［8］。此外，番茄碱还具有抗菌、抗炎、抗氧化、心血管保护和免疫调节作用，但这些作用的机制需要进一步研究^［9］。目前，没有关于α-番茄碱对肝癌细胞糖酵解影响的研究。肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）作为一种信号传感器，可将上游信号分子的刺激信号传递至细胞内，进而调控细胞的增殖、分化、存活和凋亡等活动^［10］。KRAS蛋白可被生长因子、趋化因子、Ca²⁺或酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）激活，活化的KRAS蛋白可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，mTOR）信号通路^［11］。激活的KRAS信号通过提供促进细胞增殖、阻止细胞死亡、抑制细胞分化和诱导血管生成的分子信号来促进致癌转化，但对于肝癌细胞糖酵解的机制有待进一步研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PowerWaveHT型微孔板分光光度计（美国BioTek公司）；XSP-63XDV型倒置荧光显微镜（上海光学仪器一厂）；CheniDoc XRS+型化学发光成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

α-番茄碱（批号22BP1726，成都普瑞法科技开发有限公司）；改良Eagle培养基（dulbecco’s modification of Eagle’s medium， DMEM，批号 C12430500BT）、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS，批号GB-2020）和青霉素/链霉素（批号15140148）均购自美国Gibco公司；LY294002（HY-10108，美国MedChemExpress公司）；3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2-四唑溴化物［3-‍（4，5-dimethylthiazol-2-yl）‍-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT，批号475989］和二甲基亚砜（批号34869）均购自美国Sigma-Aldrich公司；穿越小室（Transwell，批号3415，美国Corning公司）；葡萄糖测定试剂盒（批号F006-1-1）、乳酸测定试剂盒（批号A019-3-1）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量测定试剂盒（比色法）（批号A095-1-1）均购自南京建成生物工程研究所；一抗，包括抗B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2，批号ab182858）、抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax，批号ab32503）、抗KRAS（批号ab275876）、抗mTOR（批号ab134903）、抗PI3K（批号ab283852）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase， GAPDH，批号ab8245）和抗辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP，批号ab6721）连接的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均购自美国Abcam公司；增强化学发光试剂（批号P0018S，上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3 细胞

人肝癌细胞系Huh7、Hep3B、SNU-449细胞由中科院上海生科院细胞库提供。

2 方法

2.1 细胞培养和处理

将细胞在100 mL·L^-1FBS和10 mL·L^-1青霉素/链霉素DMEM中培养，放置在温度37 ℃、95%空气和5%CO₂的条件下，在实验前2 d将细胞接种在玻璃盖玻片上，以达到≥90%的汇合度。

将Huh7、Hep3B、SNU-449细胞平均分为4组，分别为对照组、α‍-‍番茄碱低剂量（1 μmol·L^-1）组、α‍-‍番茄碱中剂量（2 μmol·L^-1）组、α‍-‍番茄碱高剂量（5 μmol·L^-1）组，最终选用浓度5 μmol·L^-1的α-番茄碱和Huh7细胞做后续实验；将Huh7细胞均分为对照组、α-番茄碱组，LY294002抑制剂组（25 μmol·L^-1），α-番茄碱（5 μmol·L^－1）联合Y294002（25 μmol·L^-1）抑制剂组。

2.2 MTT检测细胞活力

通过MTT测定法检测各种处理对细胞活力的影响。用MTT测定法分析肝癌细胞活力。将细胞以每孔6 000个的密度接种在96孔板中过夜。用不同浓度的α-番茄碱（0、1、2、5 μmol·L^-1）在2 ℃处理37 h。加入20 μL MTT（PBS溶液为 5 mg·mL^-1），将细胞再孵育4 h。弃去每孔中的培养基，并加入二甲基亚砜（150 μL）。在Eppendorf摇床上在黑暗中搅拌10 min后，在微孔板分光光度计中读取在波长490 nm处的吸光度（A）值，A值表示为设置为100%的对照组中细胞活力的百分比。

2.3 Transwell

根据制造商的方案使用24孔、8.0 μm的孔膜。每孔以1×10⁵个细胞接种在上室的100 μL无血清培养基中，同时将600 μL完全培养基作为化学引诱剂添加到下室中。在37 ℃孵育24 h后，用棉签除去膜上表面残留的细胞，膜下表面的细胞为迁移细胞。用40 g·L^-1多聚甲醛固定并用1 g·L^-1结晶紫溶液染色后，用倒置荧光显微镜对通过过滤器的细胞进行拍照。

2.4 划痕实验

用伤口划痕测定法检测细胞迁移能力。将细胞接种到六孔板中并在正常生长培养基中孵育。24 h后，将无菌的200 μL移液器吸头置于孔的中心，在单层中轻轻创建划痕的伤口。去除浮动细胞后，用10 mL·L^-1血清培养基培养细胞，在治疗后0、24 h测量细胞迁移距离。用显微镜拍摄照片，并用Image J软件分析图像。

2.5 葡萄糖消耗量、乳酸释放量和ATP含量的检测

将细胞接种到六孔板中，密度为5×10⁵个细胞·孔^-1。每孔加入2 mL DMEM培养过夜。然后将细胞处理12 h。收集培养基并以1 000 r·min^-1离心5 min。按照说明书要求，分别用市售的葡萄糖测定试剂盒、乳酸测定试剂盒和ATP含量测定试剂盒（比色法）检测上清液中的葡萄糖消耗量、乳酸释放量和ATP含量，并进行细微修改。新鲜培养基中葡萄糖水平减去培养基中葡萄糖水平为葡萄糖消耗量。用不同稀释度的标准溶液绘制标准曲线，计算培养基中乳酸和ATP的含量，计算乳酸和ATP释放量，所有数据均按细胞数进行归一化。

2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）

用RIPA缓冲液制备细胞蛋白提取物，用80 g·L^-1聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏氟乙烯-氟化物（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用含50 g·L^-1无脂牛奶的PBS封闭，在4 ℃下与一抗孵育过夜。将PVDF膜与HRP偶联的山羊抗兔或小鼠IgG二抗一同孵育，用增强化学发光法将信号可视化，再通过Image J进行分析。

2.7 统计学方法

用GraphPad Prism7分析数据，并以（\overline{x}±s）表示，多组数据进行比较用单因素方差分析（ANOVA），方差分析后进一步2组差异比较用LSD方法进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 α-番茄碱抑制肝癌细胞增殖

α-番茄碱的化学结构式见图1。用不同浓度的α-番茄碱处理人肝癌细胞Huh7、Hep3B、SNU-449细胞72 h，通过MTT测定法测定细胞活力，见图2。用α-番茄碱处理不同的肝癌细胞，导致活细胞数量的浓度依赖性减少。2、5 μmol·L^-1的α-番茄碱可显著抑制Huh7、Hep3B、SNU-449细胞的生长。用5 μmol·L^-1α-番茄碱处理Huh7，导致活细胞数量减少约90%。

3.2 α-番茄碱促进Huh7细胞凋亡的能力

用Western blotting检测不同剂量的α-番茄碱对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的蛋白表达水平的影响，见图3。结果显示，随着α-番茄碱剂量的增大，Bax的蛋白表达量增高，Bcl-2的蛋白表达量降低，表明Huh7细胞的凋亡能力与α-番茄碱的剂量具有依赖性，且随着剂量的增加凋亡能力逐渐增强。

3.3 α-番茄碱减弱Huh7细胞的侵袭和迁移能力

细胞侵袭图像见图4，细胞迁移图像见图5。用0、1、2、5 μmol·L^-1的α-番茄碱处理Huh7细胞，Transwell实验和划痕实验结果表明，随着α-番茄碱剂量的增加，侵袭细胞数量越来越少，细胞的迁移率越来越低。与对照组比较，1 μmol·L^-1α-番茄碱处理后的侵袭细胞数量和迁移率明显降低（P<0.05）；2、5 μmol·L^-1α-番茄碱处理后的侵袭细胞数量和迁移率显著降低（P<0.01），表明Huh7细胞的侵袭和迁移能力与α-番茄碱的剂量呈负相关。

3.4 α-番茄碱对PI3K/mTOR信号通路的作用

用Western blotting检测KRAS、PI3K、mTOR蛋白的表达情况，见图6。与对照组比较，α-番茄碱组KRAS、PI3K、mTOR蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）；用LY294002处理后，KRAS、PI3K、mTOR蛋白的表达水平显著降低，α-番茄碱联合LY294002组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3.5 α-番茄碱通过PI3K/mTOR信号通路对Huh7细胞生长的影响

用MTT法检测各组的细胞活力，见图7A。与对照组比较，α-番茄碱组的细胞活力显著降低（P<0.01）；LY294002组的细胞活力与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组比较，α-番茄碱联合Y294002组细胞活力降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，α-番茄碱组的Bax蛋白表达量明显增加，Bcl-2的蛋白表达量显著降低，Y294002组的Bax蛋白表达量明显降低，Bcl-2的蛋白表达量显著增加，α-番茄碱联合Y294002组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图7B。

3.6 α-番茄碱通过PI3K/mTOR信号通路抑制Huh7细胞的侵袭和迁移

细胞的侵袭和迁移图像见图8。与对照组比较，α-番茄碱能明显减少侵袭细胞数量，并抑制细胞的迁移能力。LY294002抑制PI3K/mTOR信号通路的转导后，Huh7细胞的侵袭和迁移能力明显增加（P<0.01）。α-番茄碱联合LY294002组侵袭和迁移能力与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3.7 α-番茄碱通过PI3K/mTOR信号通路对Huh7细胞的糖酵解的影响

Huh7细胞内葡萄糖含量的检测结果见图9A，Huh7细胞内乳酸释放量的检测结果见图9B，Huh7细胞内ATP的含量检测结果见图9C。结果表明，α-番茄碱可降低葡萄糖利用率、乳酸释放和细胞内ATP的产生，抑制PI3K/mTOR信号通路后，Huh7细胞内葡萄糖利用率、乳酸释放和ATP的产生显著增加。结果表明，α-番茄碱可通过PI3K/mTOR信号通路抑制糖酵解代谢，抑制肝癌细胞的生长。

4 讨论

本研究将肝癌细胞系随机均分为不同剂量组，发现用α-番茄碱（5 μmol·L^－1）处理Huh7导致活细胞数量减少约90%，因此选择用5 μmol·L^-1的α-番茄碱干预Huh7细胞。MTT实验结果表明，α-番茄碱对Huh7细胞的增殖有明显的抑制作用，同时可抑制细胞的侵袭和迁移，抑制葡萄糖消耗、乳酸释放和降低ATP含量，促进细胞凋亡。α-番茄碱在Huh7细胞中激活mTOR/PI3K信号通路，并通过激活mTOR/PI3K信号通路促进细胞凋亡，抑制细胞侵袭和迁移，进一步抑制糖酵解。结果表明，α-番茄碱通过激活mTOR/PI3K信号通路抑制糖酵解，降低肝癌细胞的活性及侵袭和迁移能力。α-番茄碱是番茄中的主要皂苷，具有抗菌、抗真菌、抗炎和增强免疫等活性^［12］。其可预防虹鳟鱼中二苯并［a，l］芘诱导的肝胃肿瘤生成，还可抑制人结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7和胃癌细胞AGS的生长^［13］，但其抗增殖机制需要进一步研究。本研究基于KRAS信号通路探究α-番茄碱对肝癌细胞糖酵解的机制。KRAS突变发生在约30%的肿瘤中，其是肺癌、结直肠癌和胰腺癌的常见诱因。携带KRAS突变的肿瘤患者治疗难度较大。靶向突变RAS下游信号通路的个别抑制剂（如PI3K/AKT/mTOR和RAF/MEK/ERK等）在临床试验中获得了低于20%的有限缓解率^［14］。PI3K/mTOR信号通路被认为在细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等细胞生理活动中具有重要作用，同时与肿瘤耐药性的产生也有一定关系^［15］。KRAS蛋白与膜受体结合激活PI3K的p85亚基，再与p110亚基结合使PI3K活化，激活的PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇转化成第二信使三磷酸磷脂酰肌醇^［16］。

目前，肝癌缺乏有效的治疗靶点和预后指标，肝癌细胞的糖酵解是介导肝癌发生的关键机制，可能是治疗肝癌潜在的靶点，Warburg效应是几种恶性肿瘤的代谢特征，即在富氧肿瘤微环境中也更容易糖酵解。有氧糖酵解是葡萄糖被一系列酶代谢的过程，例如溶质载体家族2成员1（SLC2A1），也称为葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter type 1， GLUT1）、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA），并且还受缺氧诱导因子‍-1α（hypoxia-inducible factor-1， HIF-1α）的调节^［17］，GLUT1对葡萄糖具有高亲和力，在GLUT亚型中的红细胞、内皮细胞和癌细胞中呈高表达^［18］。癌细胞依赖于有氧糖酵解提供的ATP存活，并且通过GLUT1的过表达以获得足够的葡萄糖摄取^［19］。此外，过度表达的GLUT1与分化不良、淋巴结转移、肿瘤大小以及总生存期和无病生存期显著相关^［20］。癌症伴随着PI3K、HIF-1A、RAS、MYC和其他途径的异常激活，这些途径通过上调GLUT1表达参与细胞增殖、转移和化疗耐药性，并激活核因子κB亚基（nuclear factor κB， NF-κB）和mTOR^［21］。

番茄碱可抑制多种类型的人类癌细胞的生长，如结肠癌、乳腺癌、白血病、肺癌和前列腺癌^［22］，与化疗联合使用时，番茄碱具有增强雄激素非依赖型人前列腺癌细胞凋亡的能力。番茄碱已被证明可以通过触发未折叠蛋白反应的磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶/真核起始因子2α（phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase/eukaryotic initiation factor 2α， p-ERK/eIF2α）分支，诱导神经母细胞瘤细胞系中线粒体细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor， AIF）从线粒体转移到细胞核来激活半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡^［23］。体外研究发现，α-番茄碱可抑制不同人类癌细胞的生长^［24］。研究表明，α-番茄碱对小鼠乳腺和前列腺肿瘤的生长具有抑制作用^［25］。研究发现，α-番茄碱和紫杉醇的组合可协同增强人前列腺癌细胞的凋亡^［26］。α-番茄碱的抗癌活性在体内也得到了证实，例如，通过腹膜内给药α-番茄碱（26 mg·kg^-1体质量）可抑制小鼠结肠癌细胞（CT-5）的荷瘤小鼠肿瘤形成^［27］。本研究发现，α-番茄碱能显著抑制Huh7细胞活力、抑制细胞侵袭和迁移能力及葡萄糖利用率、乳酸产生和细胞内ATP产生，促进Huh7细胞凋亡。在抑制PI3K/mTOR信号通路后，Huh7细胞的葡萄糖利用率、乳酸产生量、细胞内ATP产生量则显著增加。结果表明，α-番茄碱对肝癌细胞具有促凋亡作用，抑制细胞侵袭和迁移能力是基于KRAS介导的PI3K/mTOR信号通路实现的。

研究发现，α-番茄碱能够抑制肝癌细胞的生长并诱导细胞凋亡，与KRAS介导的PI3K/mTOR信号通路有关。此外，α-番茄碱通过PI3K/mTOR信号通路抑制Huh7细胞的糖酵解，基于KRAS信号通路探究肝癌细胞糖酵解，可能为肝癌患者的治疗提供潜在的治疗靶点。

总之，KRAS信号通路在肝癌细胞糖酵解过程中扮演着重要的角色，尤其是通过调控HK1的表达和功能，进而影响肿瘤细胞的糖代谢。KRAS是一种癌基因，能够通过多种方式改变肿瘤细胞的代谢过程，包括增强肿瘤细胞摄取葡萄糖和糖酵解，即使在肿瘤组织中含有大量氧气的情况下也是如此。研究显示，KRAS对肿瘤代谢的影响能通过转录调控葡萄糖转运蛋白以及糖酵解酶系来实现，但KRAS是否直接调控代谢相关酶系的具体机制仍需进一步研究。这也为我们理解KRAS信号通路在肝癌细胞糖酵解中的影响提供了新的思路。α-番茄碱可能通过调节KRAS介导的PI3K/mTOR信号通路影响肝癌细胞的糖酵解和凋亡过程，未来的研究可以进一步探索这一机制的具体细节，以及α-番茄碱在肝癌治疗中的潜在应用价值。

参考文献

[1] SUNG H， FERLAY J， SIEGEL RL， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries‍‍［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-249.

[2] SUN D， LI H， CAO M， et al. Cancer burden in China： Trends， risk factors and prevention‍［J］. Cancer Biol Med， 2020， 17（4）： 879-895.

[3] FENG J， LI J， WU L， et al. Emerging roles and the regulation of aerobic glycolysis in hepatocellular carcinoma‍［J］. J Exp Clin Cancer Res， 2020， 39（1）： 126.

[4] SCHWARTZ L， SUPURAN C T， ALFAROUK K O. The warburg effect and the hallmarks of cancer‍［J］. Anticancer Agents Med Chem， 2017， 17（2）： 164-170.

[5] QI Y， ZHANG C， WU D， et al. Indole-3-carbinol stabilizes p53 to induce miR-34a， which targets LDHA to block aerobic glycolysis in liver cancer cells‍［J］. Pharmaceuticals （Basel）， 2022， 15（10）： 1257.

[6] FUJIMAKI J， SAYAMA N， SHIOTANI S， et al. The steroidal alkaloid tomatidine and tomatidine-rich tomato leaf extract suppress the human gastric cancer-derived 85as2 cells in vitro and in vivo via modulation of interferon-stimulated genes‍［J］. Nutrients， 2022， 14（5）： 1023.

[7] HUANG H， CHEN X， LI D， et al. Combination of α‍-tomatine and curcumin inhibits growth and induces apoptosis in human prostate cancer cells‍［J］. PLoS One， 2015， 10（12）： e0144293.

[8] CHAO M W， CHEN C H， CHANG Y L， et al. α‍-tomatine-mediated anti-cancer activity in vitro and in vivo through cell cycle- and caspase-independent pathways‍［J］. PLoS One， 2012， 7（9）： e44093.

[9] SERRATÌ S， PORCELLI L， GUIDA S， et al. Tomatine displays antitumor potential in in vitro models of metastatic melanoma‍［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（15）： 5243.

[10] SPENDER L C， INMAN G J. Developments in burkitt’s lymphoma： Novel cooperations in oncogenic MYC signaling‍［J］. Cancer Manag Res， 2014， 6： 27-38.

[11] YU G， HUANG B， CHEN G， et al. Phosphatidylethanolamine-binding protein 4 promotes lung cancer cells proliferation and invasion via PI3K/Akt/mTOR axis‍［J］. J Thorac Dis， 2015， 7（10）： 1806-1816.

[12] CHIU F L， LIN J K. Tomatidine inhibits iNOS and COX-2 through suppression of NF-kappaB and JNK pathways in LPS-stimulated mouse macrophages‍［J］. FEBS Lett， 2008， 582（16）： 2407-2412.

[13] LEE S T， WONG P F， CHEAH S C， et al. Alpha-tomatine induces apoptosis and inhibits nuclear factor-kappa B activation on human prostatic adenocarcinoma PC-3 cells‍［J］. PLoS One， 2011， 6（4）： e18915.

[14] STINCHCOMBE T E， JOHNSON G L. MEK inhibition in non-small cell lung cancer‍［J］. Lung Cancer， 2014， 86（2）： 121-125.

[15] ZHU K， WU Y， HE P， et al. PI3K/AKT/mTOR-targeted therapy for breast cancer‍［J］. Cells， 2022， 11（16）： 2508.

[16] ZOU Z， CHEN J， LIU A， et al. mTORC2 promotes cell survival through c-Myc-dependent up-regulation of E2F1‍［J］. J Cell Biol， 2015， 211（1）： 105-122.

[17] LI Y， SONG Z， HAN Q， et al. Targeted inhibition of STAT3 induces immunogenic cell death of hepatocellular carcinoma cells via glycolysis‍［J］. Mol Oncol， 2022， 16（15）： 2861-2880.

[18] DING X， LIU J， LIU T， et al. miR-148b inhibits glycolysis in gastric cancer through targeting SLC2A1‍［J］. Cancer Med， 2017， 6（6）： 1301-1310.

[19] BARRON C C， BILAN P J， TSAKIRIDIS T， et al. Facilitative glucose transporters： Implications for cancer detection， prognosis and treatment‍［J］. Metabolism， 2016， 65（2）： 124-139.

[20] YU M， YONGZHI H， CHEN S， et al. The prognostic value of GLUT1 in cancers： A systematic review and Meta-analysis‍［J］. Oncotarget， 2017， 8（26）： 43356-43367.

[21] GOU Q， DONG C， JIN J， et al. PPARα agonist alleviates tumor growth and chemo-resistance associated with the inhibition of glucose metabolic pathway‍［J］. Eur J Pharmacol， 2019， 863： 172664.

[22] JIANG Q W， CHEN M W， CHENG K J， et al. Therapeutic potential of steroidal alkaloids in cancer and other diseases‍［J］. Med Res Rev， 2016， 36（1）： 119-143.

[23] SILVA D C DA， ANDRADE P B， VALENTÃO P， et al. Neurotoxicity of the steroidal alkaloids tomatine and tomatidine is RIP1 kinase- and caspase-independent and involves the eIF2α branch of the endoplasmic reticulum‍［J］. J Steroid Biochem Mol Biol， 2017， 171： 178-186.

[24] SHIEH J M， CHENG T H， SHI M D， et al. α-Tomatine suppresses invasion and migration of human non-small cell lung cancer NCI-H460 cells through inactivating FAK/PI3K/Akt signaling pathway and reducing binding activity of NF-‍κB‍［J］. Cell Biochem Biophys， 2011， 60（3）： 297-310.

[25] LEE S T， WONG P F， HE H， et al. Alpha-tomatine attenuation of in vivo growth of subcutaneous and orthotopic xenograft tumors of human prostate carcinoma PC-3 cells is accompanied by inactivation of nuclear factor-kappa B signaling‍［J］. PLoS One， 2013， 8（2）： e57708.

[26] LEE S T， WONG P F， HOOPER J D， et al. Alpha-tomatine synergises with paclitaxel to enhance apoptosis of androgen-independent human prostate cancer PC-3 cells in vitro and in vivo‍［J］. Phytomedicine， 2013， 20（14）： 1297-1305.

[27] KIM S P， NAM S H， FRIEDMAN M. The tomato glycoalkaloid α-tomatine induces caspase-independent cell death in mouse colon cancer CT-26 cells and transplanted tumors in mice‍［J］. J Agric Food Chem， 2015， 63（4）： 1142-1150.

基金资助

山东省老年医学学会2021年科技攻关计划项目(LKJGG2021W057)

济南市卫生健康委员会科技计划项目(2021-1-10)