纳米材料在核酸药物递送中应用的进展

Progress on the application of nanomaterials in nucleic acid drug delivery

摘要

随着生物信息学技术和遗传学的发展，使用基因递送技术来识别、诊断和治疗疾病成为可能。目前开发并在体外和体内试验了几种基于核酸药剂的治疗体系，包括裸核酸基础治疗、靶向微小核糖核酸治疗、溶酶体病毒疗法、自杀基因治疗、细胞介导的基因治疗和基于规律成簇的间隔短回文重复序列关联蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9）的治疗系统。近年来，核酸药剂在许多治疗领域针对各种特定细胞群体取得了一定突破。目前，开发安全、有效的功能载体是提高基因治疗中核酸药物输送的热点。为此，该文综述了近年来各种核酸药剂在基因治疗方面的研究进展，并且涵盖了非病毒载体研究和制剂方面的最新研究进展、面临的挑战以及未来的发展方向。

Abstract

The integration of bioinformatics technology and genetic science has revolutionized the field of gene delivery， making it possible to use nucleic acid-based therapies for the identification， diagnosis， and treatment of various diseases. Over the past few decades， numerous therapeutic systems based on nucleic acid agents have been developed and tested both in vitro and in vivo. These include naked nucleic acid-based therapies， microRNAs-targeted therapies， lysosomal viral therapies， suicide gene therapies， cell-mediated gene therapies， and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 （CRISPR/Cas9）-based therapeutic systems. In recent years， nucleic acid agents have achieved significant breakthroughs in multiple therapeutic areas， targeting diverse specific cell populations. Currently， the development of safe and effective functional vectors is a major focus to enhance the delivery of nucleic acid agents in gene therapy. To this end， this review provides an overview of the research progress of various nucleic acid agents in gene therapy in recent years， covering recent advances， challenges， and future perspectives in non-viral vector research and formulation.

Graphical abstract

关键词

核酸药物 / 纳米载体 / 基因治疗

Key words

nucleic acid drugs / nanocarriers / gene therapy

在现代生物医学技术领域，医学在预防、诊断和治疗包括遗传异常在内的致命疾病方面取得了一定进展。然而，药物、生物制剂和基于肽的治疗手段并不能应用于所有疾病。许多由于基因层面的改变而发生的疾病，不能通过常规的药物进行治疗。随着新型治疗手段的发展，基因治疗作为一种强大的工具，它通过改变这些疾病中的遗传变异来治疗遗传疾病。基因组中的突变和缺失导致许多疾病的发生，这些疾病可能干扰正常的代谢途径、细胞周期、细胞骨架、配体/受体功能和细胞外蛋白质，针对以上问题只有基因治疗可以提供解决方案^［1-3］。

基因治疗是通过插入、去除或纠正致病基因，从根源上改善由基因改变导致的疾病^［4］。早在1972年，理查德·罗布林便提出使用“良好”的脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）替换缺陷的DNA作为遗传病的治疗方法，之后明确提出了针对人类疾病的基因治疗概念^［5-6］。基因治疗通过替换致病基因或引入修改过的基因使功能不正常的致病基因失活以治疗疾病。目前基因治疗已经发展成为分子医学领域的一个新平台，未来可以治疗不同的遗传疾病，如血友病、帕金森病、癌症和阿尔茨海默病等疾病^［7］。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）将用于人类基因治疗的药剂定义为基因治疗药，亦可称作核酸药物^［8-9］。基因治疗由于其巨大的治疗潜力，已经迅速发展。然而，直接在体内递送裸露的核酸药物是不现实的，且充满挑战^［10-11］。基因易受血浆中核酸酶降解，对目标细胞缺乏特异性，带负电荷的基因无法进入同样带负电荷的细胞膜。目前已有近2 600种基因治疗药物完成或正在进行临床试验，但在国外只有6种基因治疗药物获得批准^［12-14］。鉴于以上问题，无论是系统性地还是局部地给予裸露基因都是无效的。因此，开发安全和有效的基因转染载体是基因治疗的基本挑战。

纳米技术的发展使多种具有独特结构的纳米材料得以发展，并为纳米药物作为有前途的下一代治疗药物奠定了基础^［15-18］。通过利用模板纳米材料的独特结构特征，包括治疗基因、生物分子和小分子试剂等各种分子已被加载到多种纳米颗粒中，并最终被输送到独特环境的目标区域^［19-20］。由于一些疾病的根源受遗传基因影响而受到了极大关注，因此，纳米医学中使用的治疗基因构成了下一代治疗药物^［21-22］。此外，纳米材料可以多功能修饰，具有靶向能力的纳米材料易于合成^{［23- 24］}。也就是说，用特定配体功能化纳米材料，这些配体可以与目标细胞表面选择性相互作用，使其能够主动靶向特定组织^［25-26］。除了这些特性外，增强渗透和保留（enhanced permeability and retention，EPR）特性使纳米材料能够选择性穿透疾病组织，进一步支持了纳米材料在疾病治疗中的应用。纳米材料除了输送功能外，还有其他功能，如生物成像、光动力治疗和光热治疗。目前，脂质纳米粒子、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒和仿生纳米颗粒是常用的核酸治疗剂递送平台^［27］。其中脂质体（lipid nanoparticle，LNPs）是相对成熟的平台，在新型冠状病毒肺炎疫情期间被验证用于信使RNA（mRNA）疫苗的递送。尽管基因治疗和纳米材料在靶向治疗方面显示出巨大潜力，但两种策略都面临复杂问题，如治疗效果较差和治疗转移性癌症困难^［28］。

本文全面综述了纳米材料在核酸药物递送中的应用现状，包括不同类型的纳米载体系统及其特性、面临的挑战以及潜在的临床应用，系统性地总结了当前纳米材料在核酸药物递送中的研究进展、面临的挑战以及未来的发展方向。以期促进跨学科合作，加速科研成果转化，为未来的临床应用和科学研究提供指导，推动这一领域的科学研究和技术创新。

1 核酸药物分类

1.1 DNA药物

由于裸质粒DNA治疗癌症具有一定的安全性，且易操作，故受到极大的关注^［29］。ZHAO N等^［30］研究表明，裸DNA载体在人血清中的存活时间表现出长度依赖性，载体越长越重，存活时间越短。因此，研究人员开发了微型载体，以提高其在人血清中的存活能力。KODAMA Y等^［31］开发了基于裸DNA的黑色素瘤疫苗，实验小鼠吸入后表现出良好的转染效果，且在肺部显示出强烈的基因表达，通过多色深度成像技术，观察并确认了这一结果。吸入的DNA显著抑制了小鼠肺癌细胞系的转移，由于增加了包括干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）在内的炎症细胞因子的产生，显著增强了辅助1型T淋巴细胞的反应。

反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）是由15~25个核苷酸组成的单链DNA^［32］。自从1978年ZAMECNIK和STEPHENSON首次使用ASOs抑制劳氏肉瘤病毒复制以来，ASOs的作用机制已被广泛研究^［33-34］，大致可以分为2种类型。①核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）阻断：ASOs可以通过与特定序列结合，抑制RNA与其他核酸的结合，影响翻译和剪接过程。②RNA切割：ASOs与RNA形成RNA-DNA双链，在细胞内的内源性RNase H作用下消除RNA-DNA双链中的RNA^［35-36］。目前ASOs已广泛应用于治疗各种癌症、糖尿病、肌营养不良症和神经退行性疾病。同时，几种基于ASOs的制剂已在临床试验中使用^［37-38］。

脱氧核酶（deoxyribozyme，DNAzyme）是单链DNA分子，可以催化各种反应，包括RNA或DNA的切割或连接。基于独特的辅因子依赖性和序列特异性催化特性，DNAzyme已被广泛用作生物传感器，甚至作为基因沉默的有效治疗剂。最近，治疗性RNA水解脱氧核酶已被认为是一种有效的抗癌药物，通过对癌基因底物进行有效细胞内生物催化裂解来抑制多种致瘤过程。与ASOs相比，DNAzyme具有较好的生物稳定性，且不会劫持内源RNA诱导的沉默复合物。

1.2 RNA药物

RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术利用小分子RNA，包括短干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）^［39-41］和微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）^{［42- 43］}通过翻译抑制、染色质重塑或信使RNA（messenger RNA，mRNA）降解有效调节基因表达（见图1）。经过转录后修饰，内源性成熟miRNAs的结构与外源性siRNAs相似^［44］。siRNAs和miRNAs都由共同的酶Dicer处理，并被纳入一个活跃的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），当引导链序列与mRNA互补序列配对时，Argonaute 2（Ago2）会切割目标mRNAs。随后，miRNAs和siRNAs共享相同的处理机制以实现基因沉默效果。然而，siRNAs是外源性双链RNA，通过完美的序列匹配与目标mRNA序列结合。miRNAs是内源性单链RNA，通过不完美的配对针对多个序列，能同时抑制多个目标基因。这在应用于癌症基因治疗时具有诸多优势。

近年来，mRNA疗法在治疗遗传病中已成为一种有前景的方法，其具有多种优势：生物相容性好、剂量精确、表达短暂、基因组整合风险小^［45-49］。mRNA的化学修饰可以显著降低免疫原性，同时增加蛋白质产量，克服了以往核酸疗法的关键限制^［50］。此外，mRNA疗法的模块化设计和成熟的制造过程能够为个别患者快速开发、定制个体化治疗方案，这对异质性罕见遗传病的治疗至关重要。更重要的是，mRNA疗法能通过短暂表达安全地恢复缺失或有缺陷的蛋白质，而不改变基因组序列，从而纠正潜在的遗传缺陷，同时避免了由病毒载体介导的基因治疗的安全隐患，如不受控制的基因表达。最新的研究已证明mRNA疗法在罕见遗传病的治疗中具有巨大潜力，包括糖原贮积病（glycogen storage disease，GSD）、丙酸血症（propionic acidemia，PA）、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症（ornithine transcarbamylase deficiency，OTCD）、甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）、囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）和家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）^［51］。递送材料和mRNA分子设计策略的持续进步也将继续改善mRNA疗法在临床的应用^［52-53］。

最早关于哺乳动物细胞中环形RNA功能的报告描述了miRNA海绵。研究发现，通过miR-671的结合，直接由argonaut 2（AGO 2）介导的人类小脑退化相关蛋白1（cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1）位点内源性环形RNA的切割可以调节CDR1蛋白的水平^［54］。这是第一个关于反义转录本通过后转录调控基因的报道。随后有研究发现被称为ciRS-7（circular RNA sponge for miR-7）的环形RNA包含了超过60个miRNA结合位点，针对第2个miRNA，即miR-7^［55］。第2个环形RNA海绵来自小鼠性别决定区Y（sex-determining region Y，Sry）基因，其调节miR-138的水平。目前研究已发现了更多具有miRNA海绵活性的天然环形RNA，有可能成为一种强大的治疗手段^［56-57］。最近一项关于环形RNA的合成和利用的研究，即一种针对致癌miR-21的miRNA海绵在3种胃癌细胞系中的潜力。结果发现，体外合成的环形RNA（miR-21）海绵治疗胃癌比线性海绵对照组产生了更大的效果^［58］。研究者将此归因于环形RNA稳定性的增加，而不是miRNA隔离机制的任何差异。

锤头核酶在癌症的治疗中具有很大潜力，可特异性下调细胞基因表达^［59］。Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，H-ras）是致癌基因之一，研究发现，其在肿瘤发生、侵袭和转移中起着关键作用。研究者设计、合成了核酶核酸药物，其能特异性下调突变H-ras致癌基因的表达。H-ras致癌基因的激活是由点突变引起，核酶被设计只为切割突变的转录本，点突变创建了一个假定的核酶切割位点。研究发现，使用抗H-ras核酶可以降低肿瘤的发生率，并逆转恶性表型，其他参与癌症的分子也被作为靶标并利用锤头状核酶药物进行治疗^［60］。在癌症化疗中，多药耐药（multidrug resistance gene，MDR）已经被下调。针对在乳腺癌生长中起关键作用的分子，如HER-2/neu^［61］和ErbB-4^［62］，也已经合成了相应的锤头状核酶药物。研究者还试图下调参与脑瘤发生和发展的基因的表达。在其中一项尝试中，一个耐核酸酶的锤头状核酶在下调蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα，PKCα）基因表达后，成功地阻止了胶质瘤的生长并触发了凋亡^［63］。

1.3 基因编辑核酸药物

随着基因编辑技术的发展，基因编辑核酸药物在疾病治疗领域备受关注（见图2）^［64］。1996年，KIM Y G等^［65］首次引入锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN），是第1个可编程的核酸酶，ZFN能靶向切割DNA中的特定位点。ZFN由两部分组成，第一部分是锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP），其在识别三联体碱基方面表现出高特异性。编程模块化的ZFP，可以靶向基因组DNA中的特定位置。第二部分是FokI内切酶（FokI restriction endonuclease，FokI），负责DNA切割。利用细胞内DNA损伤修复机制，可以对目标基因进行修改^［66］。此外，GUO J等^［67］通过实验室指导的蛋白质进化，开发出了具有高特异性和高效性的改良版FokI切割域（FokI cleavage domain，FCD），利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和DNA洗牌技术在FokI催化结构域产生突变，筛选出含有2个氨基酸取代（S418P和K441E）的突变体，催化活性比野生型FCD提高了15倍以上。2007年，MILLER J C等^［68-69］开发了一种具有异源二聚体活性的FokI变体，以减少脱靶效应。但ZFP的设计、测试和筛选仍然存在障碍。

2009年，BOCH J等^［70］分别在独立的研究工作中开创了类转录激活因子核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）技术。他们用类转录激活因子（transcription activator-like effector，TALEs）替换了ZFP。每个TALE可以结合1个单独的DNA碱基，其模块化蛋白在编程后可以结合特定的DNA序列。由于各种构建方法的发展和进步，DNA结合重复序列的组装变得更容易和更高效。与ZFN技术相比，TALENs技术也利用蛋白质进行DNA识别，显示出更高的效率和特异性，而且设计和实施起来更容易^［71］。TALENs技术在功能基因组学研究中仍然是一个重要的遗传工具，并在线粒体基因编辑中占据关键地位。然而，必须承认TALENs技术仍然容易受到脱靶效应的影响，并且由于其较大的分子结构，故面临递送挑战。

规律成簇的间隔短回文重复序列关联蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9）系统的功能由其结构决定。HNH和RuvC结构域在切割目标位点中起着至关重要的作用，从而决定了整个系统的效率和结果^［72］。研究人员在努力提高其效率的同时，发现了该系统的其他应用。通过修改蛋白质结构并使HNH和RuvC结构域中的1个或2个失活，创造了Cas9核酸内切酶（Cas9 nickase，nCas9）和失活Cas9蛋白（Dead Cas9，dCas9）系统^［73-75］。这种修改使它们能够产生单链断裂，甚至在期望的位置失去切割DNA的能力。因此，这一进步为其各种应用铺平了道路，如精确基因编辑、碱基编辑、基因组成成像和表观遗传调控。

虽然，核酸类药物在各种疾病中均展现出巨大的优势和广阔的应用前景。但是，裸露基因无法局部或系统性地给予病灶精准高效治疗。首先，是因为核酸药物带负电荷无法进入同样带负电荷的细胞膜；其次无论是人体内体液环境亦或是细胞内基质中均具有核酸酶，会降解核酸药物，降低其对目标细胞的特异性。因此，需要合适的载体材料递送核酸药物，实现其高效、高特异性地治疗疾病。

2 纳米材料的基本概念与分类

2.1 纳米材料的定义及特性

纳米技术是一门基于化学、生物学、物理学和材料科学的多学科科学，在医学领域具有巨大效用，主要包括药物输送、基因治疗、诊断成像、生物传感和靶向治疗^［76］。纳米粒子是三维尺寸在纳米级（100 nm）的颗粒，通常由无机或有机分子组成的周围整体界面层^［77］。此外，纳米载体通过细胞内吞内化（见图3），从而逃避MDR^［78］。纳米颗粒具有以下优势：在血液中具有稳定性和持久性，可在病理部位积累；纳米载体表面附有特定的配体，能够靶向某些疾病或器官；纳米载体表面细胞穿透因子使其细胞内渗透性更好；载体包装了多种不同元素，能够直接进行体内成像（载体可视化）；刺激响应特性使得药物在特定生理状态下从载体中释放。纳米材料主要包括外来体、阳离子聚合物［如超支化聚（氨酯）［hyperbranched poly （amine） ester，HPAE］、聚乙二醇修饰的聚酰胺胺（PEG modified polyamidoaraine，PAMAM）和聚乙烯亚胺［poly（ethylenimine） ，PEI］等］、多糖大分子［（壳聚糖、环糊精和葡聚糖等）、无机纳米粒子（量子点、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和碳纳米管）。仿生纳米材料是通过模仿自然界生物体的结构、功能或原理，结合纳米技术设计制备的一类新型材料。这类材料在纳米尺度（1~100 nm）上模拟生物体的微观组成、动态响应或宏观性能，从而赋予材料优异的功能特性，如自修复、自适应、高效催化、超疏水等。目前，LNP作为类细胞膜仿生纳米载体和基于阳离子聚合物的载体是最有潜力的载体候选物。

2.2 纳米材料在核酸药物递送中的应用

2.2.1 仿生纳米材料——LNPs

LNPs作为类细胞膜仿生纳米材料包括可电离脂质、中性脂质（胆固醇、磷脂）以及聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）接枝脂质。其中，对阳离子脂质的研究较多，其由3部分组成，包括阳离子头部、连接部分和疏水尾部（见图4）^［79］。由于其高载荷能力、可降解性、灵活的结构和电荷以及可设计性，广泛用于DNA、mRNA和siRNA的递送（见表1）^［80］。研究发现，电荷密度、头部与尾部的组成和数量、亲疏水性、连接基团以及形状（杆状或球形）都对基因转染起着重要作用。YIN H等^［81］开发了3组分反应来优化连接基团、脂质尾巴和可电离脂质的头部，以合成用于吸入递送mRNA和CRISPR-Cas9基因编辑的可电离脂质。结果表明，这些可电离脂质具有优异的生物降解性和安全性，并能高效、反复地在肺上皮细胞中递送mRNA进行基因编辑。此外，为了促进相变、内体逃逸和有效载荷的释放，DU S等^［82］通过结合胆固醇、磷脂和胺的优点，创建了胆固醇-氨基-磷酸（cholesterol-amino-phosphate，CAP）脂质RNA递送系统（见图4）^［79］。最终，CAP-LNPs在小鼠睾丸中高效地介导了编码DNA减数分裂重组酶1蛋白的mRNA转染，以恢复染色体重组和减数分裂以及精子生成。尽管LNP具有很好的临床应用前景，但也存在以下缺点：①LNPs的4个组分的分布未知，这也是一个限制其应用的重要因素；②PEG的强生物惰性降低了LNP的细胞摄和mRNA转染。

2.2.2 聚合物纳米粒

许多聚合物具有良好的生物相容性，可在体内降解为无毒产物（如乳酸、羟基乙酸），避免长期毒性。同时，可通过调节聚合物组成、交联度或纳米结构（如胶束、微球），实现药物在特定时间或位置（如pH值、温度响应）的缓释或靶向释放。其中聚合物纳米粒主要包括HPAE、PAMAM和PEI。见图5^［88］。

2.2.2.1 聚β-氨基酯

聚β-氨基酯载体包含小型线性聚β-氨基酯［linear poly（β‍-amino ester）s，LPAEs］与高度分支的聚β-氨基酯（树枝状聚合物）（HPAEs）两大类。2000年，LYNN D M等^［89］首次利用二胺和二丙烯酸酯单体通过A2+B2迈克尔加成反应成功制备LPAEs，并声明LPAEs是有效的核酸药物载体之一。与LPAEs相比，HPAEs具有三维结构和多个功能化位点，优化的HPAEs的基因转染效率显著增强了8 521倍^［90］。2015年，ZHOU D等^［91］首次利用一锅法“A2+B3+C2”迈克尔加成策略合成了一系列HPAEs，并证明HPAEs是有效的核酸药物载体之一，显示出优越的转染效率和巨大的临床治疗潜力。YONG H等^［92］使用“A2+B3+C2”迈克尔加成法设计了219种具有不同主链结构、末端基团和分支程度的HPAEs，通过调整其化学成分和拓扑结构，实现有效的器官选择性mRNA递送。HPAEs的分支拓扑结构增强了抗血清能力和更高的体内mRNA表达，其末端胺决定了mRNA递送的器官选择性——吗啉促进肝脏靶向，乙二胺有利于脾脏递送，而甲基戊烷能同时实现mRNA肝脏、脾脏和肺部递送。同时，优化的HPAEs转染效率比商业转染试剂（lipofectamine 3000）高20倍。这项研究还全面探索了结构-活性关系对HPAEs递送mRNA效率和器官选择性的影响，为治疗各种与器官相关的疾病提供了有效的参考依据。

2.2.2.2 PEI

PEI自1995年以来一直被认为是有前途的核酸药物载体之一。由于PEI中丰富的氮原子以及支链独特结构中具有大量的初级、次级和三级胺基，PEI可通过强电荷、质子缓冲能力触发内体逃逸，其卓越的转染特性表现出高基因凝聚性^［93］。实际上，线性PEI（25 kDa）通常被认为是转染的金标准，并作为体外转染的常用阳性对照，但其强大的正电荷和不可降解的结构导致高细胞毒性。低相对分子质量PEI的细胞毒性较低，但其转染率通常较差。基于以上缺陷，PEI的应用受到严重限制。为解决这些问题，科研人员探索了各种方法平衡转染效率和细胞毒性。例如：①在PEI骨架中引入可降解基团（如二硫键）以改善其生物降解性^［94］；②将低相对分子质量PEI交联以增强其转染性能^［95-96］；③将功能化单体共价接枝到末端氨基上以提高靶向性和释放；④将PEI与其他材料进行复合以开发高性能复合载体^［97］。CHEN B等^［98］通过羧基与氨基反应构建了一种高性能的PEI-氧化石墨烯（graphene oxide，GO）复合基因载体，PEI-GO表现出比PEI（25 kDa）更低的毒性和更高的转染率。单一的两相复合物很难满足各种应用要求，因此多组分的PEI复合系统是一个有前景的研究方向。

2.2.2.3 聚酰胺胺

PAMAM树枝状大分子是完全对称的球形或放射状聚合物^［99］。由于PAMAM树枝状大分子具有大量的二级和三级胺基，其展现出强烈的缩合和质子缓冲能力，从而具有优异的基因转染性能^［100］。研究发现，树枝状大分子的代数决定了其转染效率，而部分可降解的树枝状大分子常表现出更高的递送效率^［101］。PAMAM树枝状大分子由于其明确的树枝状结构和极低的聚分散性指数（polydispersity index，PDI），在精准治疗方面具有巨大潜力^［102］。然而，PAMAM树枝状大分子制备复杂、无法量产、生物降解性差和高生物毒性限制了其在临床上的应用。树枝状大分子的常见修饰方法包括末端功能化、构建不同拓扑结构和设计PAMAM树枝状大分子/纳米粒子复合系统^［103］。SONG Z等^［104］利用在PEG-PAMAM树枝状大分子上接枝苯硼酸递送miRNA，用于胃癌的治疗。体外实验表明，PEG-PAMAM树枝状大分子/miR-34a能够抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并展现出优越的抗肿瘤效果。

2.2.3 无机纳米颗粒

与有机基因递送系统相比，无机类基因递送系统仍处于发展阶段。无机纳米颗粒的一些特殊性质（磁性和生物稳定性）提供了独特的递送方式。金纳米颗粒（gold nanoparticles，Au NPs）在药物递送领域显示出一定的潜力，其内核无毒且具有惰性，化学修饰可赋予其更多功能，改进的Au NPs具有生物相容性和非免疫原性，可在医学领域用作放射增敏剂和光热剂^{［105-106］}。LI M等^［107］开发了低分子质量的聚乙烯亚胺修饰抗血管生成药物卡托普利（captopril-polyethyleneimine，CP）与金纳米粒子（gold nanoparticles，GNP）偶联负载siRNA复合物（siRNA/CP/GNP），用于递送卡托普利和siRNA治疗乳腺癌，其显示出有效的EPR效应和基因沉默特性。为提高神经内分泌（neuroendocrine，NE）癌症的治疗效果，XIAO Y等^［108］开发了一种基于金纳米棒（gold nanorod，Au NR）的纳米载体，可以使用奥曲肽（octreotide，Oct）作为主动靶向配体共同递送多柔比星（doxorubicin，DOX）和针对achaete-scute复合体同源物1（achaete-scute complex homolog 1，ASCL1）的核酸药物（siRNA），以靶向过度表达生长抑素受体（somatostatin receptors，SSTRs）的NE癌细胞，结果显示，其对胰腺癌细胞可产生强大的抗增殖效果。见图6^［108］。

介孔硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）因其高表面积被广泛用于递送核酸药物和各类化疗药物，此外化学涂层使其更易封装药物^{［109-110］}。YUAN Y等^［111］制造了一种纳米系统pH/氧化还原双响应纳米系统（pH/redox dual-responsive nanosystem，HPMSN），以共递送DOX和靶向通用控制非抑制蛋白5（general control non-repressed 5，GCN5）的siRNA核酸药物，并利用透明质酸（hyaluronic acid，HA）涂层作为触发（pH/氧化还原）药物释放的开关（见图7）。在乳腺癌模型CD44阳性耐药乳腺癌细胞（CD44-positive drug-resistant breast cancer cells，MCF7/ADR）实验中，核酸药物siRNA下调了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）水平并消除了P-gp介导的药物耐药性，有效抑制了77%的肿瘤生长。ZHANG C G等^［112］研究设计了基于介孔硅的交联聚乙烯亚胺涂层药物/siRNA共递送载体，其显示出良好的诊断灵敏度和药物递送效果。聚乙烯亚胺通过静电相互作用在带负电荷的表面上交联，并与带负电荷的siRNA结合。二硫键的引入提高了载体的生物降解性，同时使其具有谷胱甘肽（glutathione，GSH）响应药物释放特性。

其他无机基载体，如CO₃^2-可以促进Ca²⁺与DNA的共沉淀，在核酸药物递送中具有独特的优势^［113］。ZHAO D等^［114］制备了基于碳酸钙的纳米颗粒，并引入细胞穿透肽KALA，荧光素酶报告质粒被涂覆在系统表面。由于KALA的存在，CaCO₃-KALA-DNA在293T细胞中基因表达和细胞摄取显著增强。此外，p53表达质粒和DOX被封装在CaCO₃-KALA-DNA中以验证共递送效率。结果显示，CaCO₃-KALA-p53-DOX纳米颗粒显示出强大的递送效率，并能显著抑制HeLa细胞的增殖。碳酸磷灰石作为药物递送系统越来越受到关注，它可以通过碳酸氢盐与磷酸钙沉淀合成，其粒径为50~300 nm，这类载体在体内酸性条件下迅速溶解，从而有效释放治疗药物。FATEMIAN T等^［115］开发了无机碳酸磷灰石（carbonate apatite，CA）纳米颗粒，共封装对抗AKT/ERBB2的siRNA和紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于乳腺癌的治疗。与CA-PTX相比，CA-PTX-siRNA在4T1细胞中具有更大的抗癌效果。

2.2.4 MOF纳米载体

由DNA酶介导的基因沉默核酸药物在各种疾病治疗中的应用越来越广泛，但由于其细胞传递效果差和辅因子供应不足导致其细胞内DNA酶切割无效^{［116-117］}。因此，迫切需要一种多功能载体来提高DNA酶的治疗性能。金属-有机框架（metal-organic frameworks，MOFs）作为有机无机杂化纳米材料，因其高而可调的孔隙性、大表面积和易于功能化的特性，在气体分离储存、选择性催化和药物传递方面引起广泛关注^［118］。MOFs可通过静电吸附、共价结合或范德华相互作用锚定核酸药物，因此，MOFs常作为siRNA或DNA酶的载体。然而，大部分MOFs仅作为纳米载体使用，而没有考虑其解离的组分。ZIF-8纳米颗粒作为多功能纳米载体，通过静电和配位相互作用容纳功能性核酸药物。此外，ZIF-8纳米颗粒通过EPR效应实现DNA有效的病灶靶向积累，并促进细胞对DNA的摄取而不降解。此外，ZIF-8可在酸性条件下迫使Zn²⁺和咪唑的配位相互作用解离并控制DNA释放。重要的是，同时释放的Zn²⁺离子可以补充足够量的DNA酶辅因子，以实现Zn²⁺依赖性DNA酶的生物催化操作。因此，基于ZIF-8的纳米平台可以作为智能自驱动纳米载体，用于有效递送治疗性DNA酶进入细胞（见图8）^［119］。此外，MOFs的独特多孔特性可容纳其他诊疗剂，从而为疾病联合治疗和诊断提供可能。

2.2.5 基于DNA的药物递送载体

目前，基于纯DNA的药物递送系统展现出了巨大的潜力。首先，DNA是由磷酸骨架、核糖环和核苷酸碱基3种基本结构组成。常规的碱基相互作用（即A/T、G/C）能形成确定构象和几何形状。基于这一原理，DNA可以作为构建块来制造具有精确和可预测形状和大小的DNA纳米载体^{［120-122］}。随着固相合成技术的发展，通过自动化亚磷酰胺化学作用使得DNA可大规模的合成。此外，如滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和杂交链反应（hybridization chain reaction，HCR）等方法得到了有效性的发展，生产具有高重复性、高纯度和精确构象的各种DNA纳米结构成为可能。DNA具有多种结合位点，可加载不同的药物，后修饰可构建多功能药物递送系统，实现多种药物的靶向递送以及影像引导治疗（见图9）^［120］。许多化学基团和荧光团可以加在DNA的末端或插入到中间，显著提高了DNA的化学和生物学特性，如稳定性、药物加载效率、靶向性以及穿透生物屏障能力（血脑屏障）。基于DNA的载体是由内源性材料制成，具有出色的生物相容性、低免疫原性、可生物降解性和易于从体内消除的特点。LIU J B等^［123］构建了一个定制的DNA折纸，用于MDR肿瘤的协同治疗［RNA干扰（RNAi）/化疗］。通过DNA组装构建了带有可切割的二硫键捕获链和靶向适配器的三角形DNA折纸，随后加载多柔比星。针对MDR相关基因（P-gp和生存素）的线性小发夹RNA转录模板通过碱基配对固定在捕获链上。定制的DNA折纸通过粘蛋白1（mucin 1，MUC1）靶向适配器被内化到乳腺癌细胞中，随着细胞内pH值和GSH的反应，DNA折纸可控地释放多柔比星和基因药物，对MDR肿瘤具有显著的抗肿瘤效果。

多种类型的载体被用于提高基因治疗的稳定性和特异性。每种载体类型都有其独特的优势和面临的特殊挑战，因此选择合适的载体对疾病的治疗至关重要。用于核酸药物递送的不同载体的比较见表2，由表2可见，各载体的关键特点、优势和局限性。这一比较旨在为以核酸药物为基础的肿瘤或其他疾病治疗的递送系统的选择提供合适的参考依据。

3 展望

随着RNA干扰技术的发展，从基因水平治疗疾病正在成为现实，核酸（如siRNA、miRNA、shRNA等）被用作各种疾病治疗的药物。尽管单一药物递送取得了巨大成就，但受限于MDR机制复杂，故而联合治疗极为重要，但应谨慎考虑同时给予多种药物时增加不良事件发生风险和依从性差的可能性。为实现精准靶向递送，使用纳米载体进行药物的递送和释放是一种有前景的策略。由于各类药物具有不同的物理和化学性质，如亲水性和疏水性以及核酸药物和化疗药物的正负电荷差异性。因此，未来该领域的研究应侧重于使用合适的材料开发多功能纳米载体和递送机制来包装药物，并进行合理修饰以实现精准递送。由于目前大多数载体研究都侧重于细胞的转染效率，对转染机制的综合研究仍然缺乏。因此，了解载体的组分和结构与转染过程中各个阶段之间的关系至关重要，有助于设计高性能的多功能载体。其次，加强动物实验和临床试验可以促进纳米载体的临床应用，以确保基因治疗安全、有效地使用。此外，多学科设计对于特定遗传性疾病的基因治疗至关重要，需要整合包括分子生物学、聚合物化学、生物医学材料等在内的各个领域，以设计、定制个体化治疗方案的核酸药物递送系统。

参考文献

[1] MA C C， WANG Z L， XU T， et al. The approved gene therapy drugs worldwide： From 1998 to 2019［J］. Biotechnol Adv， 2020， 40： 107502.

[2] NALDINI L. Gene therapy returns to centre stage［J］. Nature， 2015， 526（7573）： 351-360.

[3] YAHYA E B， ALQADHI A M. Recent trends in cancer therapy：A review on the current state of gene delivery［J］. Life Sci， 2021， 269： 119087.

[4] WOLFF J A， LEDERBERG J. An early history of gene transfer and therapy［J］. Hum Gene Ther， 1994， 5（4）： 469-480.

[5] ARBER W， LINN S. DNA modification and restriction［J］. Annu Rev Biochem， 1969， 38： 467-500.

[6] LEHMAN I R. DNA ligase： Structure， mechanism， and function［J］. Science， 1974， 186（4166）： 790-797.

[7] SAYED N， ALLAWADHI P， KHURANA A， et al. Gene therapy： Comprehensive overview and therapeutic applications［J］. Life Sci， 2022， 294： 120375.

[8] DASGUPTA A， HERZEGH K， SPENCER H T， et al.Regulatory framework for academic investigator-sponsored investigational new drug development of cell and gene therapies in the USA［J］. Curr Stem Cell Rep， 2021， 7（4）： 129-139.

[9] ALEXANDER M S， ROBIN N H. Riding the gene therapy wave： Challenges and opportunities for rare disease patients and clinicians［J］. Curr Opin Pediatr， 2024， 36（6）： 619-623.

[10] ARABI F. MANSOURI V and AHMADBEIGI N. Gene therapy clinical trials，where do we go？ An overview［J］. Biomed Pharmacother， 2022， 153： 17.

[11] DELSHAD M， DAVOODI-MOGHADDAM Z， KHADEMI M， et al. Advancements in gene therapy for human diseases： Trend of current clinical trials［J］. Eur J Pharmacol， 2025， 986： 177143.

[12] MENDICINO M， FAN Y， GRIFFIN D， et al. Current state of US Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products： Potential cures on the horizon［J］. Cytotherapy， 2019， 21（7）： 699-724.

[13] LAPTEVA L， PUROHIT-SHETH T， SERABIAN M， et al. Clinical development of gene therapies： The first three decades and counting［J］. Mol Ther Methods Clin Dev， 2020， 19： 387-397.

[14] CORNETTA K， MATHESON L， LONG R， et al. The national gene vector biorepository： Eleven years of providing resources to the gene therapy community［J］. Hum Gene Ther， 2020， 31（3/4）： 145-150.

[15] MIRÓN-BARROSO S， DOMÈNECH E B， TRIGUEROS S. Nanotechnology-based strategies to overcome current barriers in gene delivery［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（16）： 8537.

[16] SCHUH R S. BALDO G， TEIXEIRA H F. Nanotechnology applied to treatment of mucopolysaccharidoses［J］. Expert Opin Drug Deliv， 2016， 13（12）： 1709-1718.

[17] LIU S Z， FENG D C， LIU Z H， et al. Development of nanotechnology in andrology［J］. Transl Androl Urol， 2020， 9（2）： 702-708.

[18] JIAO L， SUN Z， SUN Z， et al. Nanotechnology-based non-viral vectors for gene delivery in cardiovascular diseases［J］. Front Bioeng Biotechnol， 2024， 12： 1349077.

[19] KAUR G， ARORA J， SODHI A S， et al. Nanotechnology and CRISPR/Cas-mediated gene therapy strategies： Potential role for treating genetic disorders［J］. Mol Biotechnol， 2024.

[20] ZHU C， JI Z， MA J， et al. Recent advances of nanotechnology-facilitated bacteria-based drug and gene delivery systems for cancer treatment［J］. Pharmaceutics， 2021， 13（7）： 940.

[21] CHAUDHARY S， SINGH A， KUMAR P， et al. Strategic targeting of non-small-cell lung cancer utilizing genetic material-based delivery platforms of nanotechnology［J］. J Biochem Mol Toxicol， 2021， 35（7）： e22784.

[22] EMERICH D F， THANOS C G. Nanotechnology and medicine［J］. Expert Opin Biol Ther， 2003， 3（4）： 655-663.

[23] LIU L， MA Q， CAO J， et al. Recent progress of graphene oxide-based multifunctional nanomaterials for cancer treatment［J］. Cancer Nanotechnol， 2021， 12（1）： 18.

[24] LIEW S S， QIN X， ZHOU J， et al. Smart design of nanomaterials for mitochondria-targeted nanotherapeutics［J］. Angew Chem Int Ed Engl， 2021， 60（5）： 2232-2256.

[25] KIM J H， MOON M J， KIM D Y， et al. Hyaluronic acid-based nanomaterials for cancer therapy［J］. Polymers （Basel）， 2018， 10（10）： 1133.

[26] RABIEE N， CHEN S， AHMADI S， et al. Aptamer-engineered （nano） materials for theranostic applications［J］. Theranostics， 2023， 13（15）： 5183-5206.

[27] ZHANG Y， WEI W， DAS G K， et al. Engineering lanthanide-based materials for nanomedicine［J］. J Photochem Photobiol C： Photochem Rev， 2014， 20： 71-96.

[28] WANG J， ZHU M， NIE G. Biomembrane-based nanostructures for cancer targeting and therapy： From synthetic liposomes to natural biomembranes and membrane-vesicles［J］. Adv Drug Deliv Rev， 2021， 178： 113974.

[29] KITROU P， KARNABATIDIS D， BROUNTZOS E， et al. Gene-based therapies in patients with critical limb ischemia［J］. Expert Opin Biol Ther， 2017， 17（4）： 449-456.

[30] ZHAO N， FOGG J M， ZECHIEDRICH L， et al. Transfection of shRNA-encoding Minivector DNA of a few hundred base pairs to regulate gene expression in lymphoma cells［J］. Gene Ther， 2011， 18（3）： 220-224.

[31] KODAMA Y， NAKASHIMA M， NAGAHARA T， et al. Development of a DNA vaccine for melanoma metastasis by inhalation based on an analysis of transgene expression characteristics of naked pDNA and a ternary complex in mouse lung tissues［J］. Pharmaceutics， 2020， 12（6）： 540.

[32] ZHANG Y N， HOU X， PIAO J， et al. Delivery and controllable release of anti-sense DNA based on frame-guided assembly strategy［J］. Eur Polym J， 2022， 173： 111187.

[33] STEPHENSON M L， ZAMECNIK P C. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1978， 75（1）： 285-288.

[34] ZAMECNIK P C， STEPHENSON M L. Inhibition of rous-sarcoma virus-replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1978， 75（1）： 280-284.

[35] POTACZEK D P， GARN H， UNGER S D， et al. Antisense molecules： A new class of drugs［J］. J Allergy Clin Immunol， 2016， 137（5）： 1334-1346.

[36] CROOKE S T. Molecular mechanisms of antisense oligonucleotides［J］. Nucleic Acid Ther， 2017， 27（2）： 70-77.

[37] CIDECIYAN A V， JACOBSON S G， HO A C， et al. Durable vision improvement after a single treatment with antisense oligonucleotide sepofarsen： A case report［J］. Nat Med， 2021， 27（5）： 785-789.

[38] LIM K R Q， BITTEL A， MARUYAMA R， et al. DUX4 transcript knockdown with antisense 2’-O-methoxyethyl gapmers for the treatment of facioscapulohumeral muscular dystrophy［J］. Mol Ther， 2021， 29（2）： 848-858.

[39] MAHMOODI CHALBATANI G， DANA H， GHARAGOUZLOO E， et al. Small interfering RNAs （siRNAs） in cancer therapy： A nano-based approach［J］. Int J Nanomedicine， 2019， 14： 3111-3128.

[40] SAW P E， SONG E W. siRNA therapeutics： A clinical reality［J］. Sci China Life Sci， 2020， 63（4）： 485-500.

[41] ZHANG Q F， KUANG G Z， LI W Z， et al. Stimuli-responsive gene delivery nanocarriers for cancer therapy［J］. Nanomicro Lett， 2023， 15（1）： 33.

[42] ZHU K Y， PALLI S R. Mechanisms， applications， and challenges of insect RNA interference［J］. Annu Rev Entomol， 2020， 65： 293-311.

[43] CHEN Y C， GAO D Y， HUANG L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy： Challenges and strategies［J］. Adv Drug Deliv Rev， 2015， 81： 128-141.

[44] ZOTTI M， DOS SANTOS E A， CAGLIARI D， et al. RNA interference technology in crop protection against arthropod pests， pathogens and nematodes［J］. Pest Manag Sci， 2018， 74（6）： 1239-1250.

[45] HE Q， GAO H， TAN D， et al. mRNA cancer vaccines： Advances， trends and challenges［J］. Acta Pharm Sin B， 2022， 12（7）： 2969-2989.

[46] KON E， AD-EL N， HAZAN-HALEVY I， et al. Targeting cancer with mRNA-lipid nanoparticles：Key considerations and future prospects［J］. Nat Rev Clin Oncol， 2023， 20（11）： 739-754.

[47] XU S， YANG K， LI R， et al. mRNA Vaccine era-mechanisms， drug platform and clinical prospection［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（18）： 6582.

[48] KOWALSKI P S， RUDRA A， MIAO L， et al. Delivering the messenger：Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery［J］. Mol Ther， 2019， 27（4）： 710-728.

[49] KWON H， KIM M， SEO Y， et al. Emergence of synthetic mRNA： In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine［J］. Biomaterials， 2018， 156： 172-193.

[50] TANG L， CHEN H Y， HAO N B， et al. microRNA inhibitors： Natural and artificial sequestration of microRNA［J］. Cancer Lett， 2017， 407： 139-147.

[51] SHEN G， LIU J， YANG H， et al. mRNA therapies： Pioneering a new era in rare genetic disease treatment［J］. J Control Release， 2024， 369： 696-721.

[52] QU Y， XU J， ZHANG T， et al. Advanced nano-based strategies for mRNA tumor vaccine［J］. Acta Pharm Sin B， 2024， 14（1）： 170-189.

[53] SUNG Y K， KIM S W. Recent advances in the development of gene delivery systems［J］. Biomater Res， 2019， 23： 8.

[54] HANSEN T B， WIKLUND E D， BRAMSEN J B， et al. miRNA-dependent gene silencing involving ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA［J］. EMBO J， 2011， 30（21）： 4414-4422.

[55] HANSEN T B， JENSEN T I， CLAUSEN B H， et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges［J］. Nature， 2013， 495（7441）： 384-388.

[56] JIN H， JIN X， ZHANG H， et al. Circular RNA hsa-circ-0016347 promotes proliferation， invasion and metastasis of osteosarcoma cells［J］. Oncotarget， 2017， 8（15）： 25571-25581.

[57] ZHU X， WANG X， WEI S， et al. hsa_circ_0013958： A circular RNA and potential novel biomarker for lung adenocarcinoma［J］. FEBS J， 2017， 284（14）： 2170-2182.

[58] EBERT M S. NEILSON J R and SHARP P A. MicroRNA sponges： Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells［J］. Nat Methods， 2007， 4（9）： 721-726.

[59] MERDAN T， KOPEC̆EK J， KISSEL T. Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer［J］. Adv Drug Deliv Rev， 2002， 54（5）： 715-758.

[60] WANG C H， TSAI L J， TSAO Y P， et al. Recombinant adenovirus encoding H-ras ribozyme induces apoptosis in laryngeal cancer cells through caspase- and mitochondria-dependent pathways［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 298（5）： 805-814.

[61] SUZUKI T， ANDEREGG B， OHKAWA T， et al. Adenovirus-mediated ribozyme targeting of HER-2/neu inhibits in vivo growth of breast cancer cells［J］. Gene Ther， 2000， 7（3）： 241-248.

[62] TANG C K， CONCEPCION X Z， MILAN M， et al. Ribozyme-mediated down-regulation of ErbB-4 in estrogen receptor-positive breast cancer cells inhibits proliferation both in vitro and in vivo ［J］. Cancer Res， 1999， 59（20）： 5315-5322.

[63] SIOUD M， SORENSEN D R. A nuclease-resistant protein kinase Cα ribozyme blocks glioma cell growth［J］. Nat Biotechnol， 1998， 16（6）： 556-561.

[64] UDDIN F， RUDIN C M， SEN T. CRISPR gene therapy： Applications， limitations， and implications for the future［J］. Front Oncol， 2020， 10： 1387.

[65] KIM Y G， CHA J， CHANDRASEGARAN S. Hybrid restriction enzymes： Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1996， 93（3）： 1156-1160.

[66] PORTEUS M H， CARROLL D. Gene targeting using zinc finger nucleases［J］. Nat Biotechnol， 2005， 23（8）： 967-973.

[67] GUO J， GAJ T， BARBAS C F. Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases［J］. J Mol Biol， 2010， 400（1）： 96-107.

[68] MILLER J C， HOLMES M C， WANG J， et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing［J］. Nat Biotechnol， 2007， 25（7）： 778-785.

[69] SZCZEPEK M， BRONDANI V， BÜCHEL J， et al. Structure-based redesign of the dimerization interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases［J］. Nat Biotechnol， 2007， 25（7）： 786-793.

[70] BOCH J， SCHOLZE H， SCHORNACK S， et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type Ⅲ effectors［J］. Science， 2009， 326（5959）： 1509-1512.

[71] BHARDWAJ A， NAIN V. TALENs-an indispensable tool in the era of CRISPR：A mini review［J］. J Genet Eng Biotechnol， 2021， 19（1）： 125.

[72] STRECKER J， JONES S， KOOPAL B， et al. Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing［J］. Nat Commun， 2019， 10（1）： 212.

[73] KNOTT G J， DOUDNA J A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering［J］. Science， 2018， 361（6405）： 866-869.

[74] MAEDER M L， LINDER S J， CASCIO V M， et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes［J］. Nat Methods， 2013， 10（10）： 977-979.

[75] EID A， ALSHAREEF S， MAHFOUZ M M. CRISPR base editors： Genome editing without double-stranded breaks［J］. Biochem J， 2018， 475（11）： 1955-1964.

[76] MIRZA Z， KARIM S. Nanoparticles-based drug delivery and gene therapy for breast cancer：Recent advancements and future challenges［J］. Semin Cancer Biol， 2021， 69： 226-237.

[77] ZU H， GAO D. Non-viral vectors in gene therapy：Recent development， challenges， and prospects［J］. AAPS J， 2021， 23（4）： 78.

[78] WANG C， PAN C， YONG H， et al. Emerging non-viral vectors for gene delivery［J］. J Nanobiotechnology， 2023， 21（1）： 272.

[79] DYMEK M， SIKORA E. Liposomes as biocompatible and smart delivery systems-the current state［J］. Adv Colloid Interface Sci， 2022， 309： 002757.

[80] MUKAI H， OGAWA K， KATO N， et al. Recent advances in lipid nanoparticles for delivery of nucleic acid， mRNA， and gene editing-based therapeutics［J］. Drug Metab Pharmacokinet， 2022， 44： 100450.

[81] YIN H， KANASTY R L， ELTOUKHY A A， et al. Non-viral vectors for gene-based therapy［J］. Nat Rev Genet， 2014， 15（8）： 541-555.

[82] DU S， LI W， ZHANG Y， et al. Cholesterol-amino-phosphate （CAP） derived lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying RNA and restoration of spermatogenesis in infertile mice［J］. Adv Sci （Weinh）， 2023， 10（11）： e2300188.

[83] LI C， YANG T， WENG Y， et al. Ionizable lipid-assisted efficient hepatic delivery of gene editing elements for oncotherapy［J］. Bioact Mater， 2022， 9： 590-601.

[84] HAN J P， KIM M， CHOI B S， et al. In vivo delivery of CRISPR-Cas9 using lipid nanoparticles enables antithrombin gene editing for sustainable hemophilia A and B therapy［J］. Sci Adv， 2022， 8（3）： eabj6901.

[85] ZHANG D， WANG G， YU X， et al. Enhancing CRISPR/Cas gene editing through modulating cellular mechanical properties for cancer therapy［J］. Nat Nanotechnol， 2022， 17（7）： 777-787.

[86] WEI T， SUN Y， CHENG Q， et al. Lung SORT LNPs enable precise homology-directed repair mediated CRISPR/Cas genome correction in cystic fibrosis models［J］. Nat Commun， 2023， 14（1）： 7322.

[87] BREDA L， PAPP T E， TRIEBWASSER M P， et al. in vivo hematopoietic stem cell modification by mRNA delivery［J］. Science， 2023， 381（6656）： 436-443.

[88] BEACH M A， NAYANATHARA U， GAO Y， et al. Polymeric nanoparticles for drug delivery［J］. Chem Rev， 2024， 124（9）： 5505-5616.

[89] LYNN D M， LANGER R. Degradable poly（β-amino esters）：  Synthesis， characterization， and self-assembly with plasmid DNA［J］. J Am Chem Soc， 2000， 122（44）： 10761-10768.

[90] WANG C F， HE W， GUO R， et al. Endoplasmic reticulum-targeting highly branched poly （β-amino ester）s for skin gene delivery［J］. ACS Mater Lett， 2024， 6（11）： 5048-5057.

[91] ZHOU D， CUTLAR L， GAO Y， et al. The transition from linear to highly branched poly （β-amino ester）s：Branching matters for gene delivery［J］. Sci Adv， 2016， 2（6）： 14.

[92] YONG H， LIN L， LI Z， et al. Tailoring highly branched poly （β-amino ester）s for efficient and organ-selective mRNA delivery［J］. Nano Lett， 2024， 24（30）： 9368-9376.

[93] LUU Q P， SHIN J Y， KIM Y K， et al. High gene transfer by the osmotic polysorbitol-mediated transporter through the selective caveolae endocytic pathway［J］. Mol Pharm， 2012， 9（8）： 2206-2218.

[94] DOSS C G， DEBOTTAM S， DEBAJYOTI C. Glutathione-responsive nano-transporter-mediated siRNA delivery：Silencing the mRNA expression of Ras［J］. Protoplasma， 2013， 250（3）： 787-792.

[95] PIRES L R， OLIVEIRA H， BARRIAS C C， et al. Imidazole-grafted chitosan-mediated gene delivery：In vitro study on transfection， intracellular trafficking and degradation［J］. Nanomedicine （Lond）， 2011， 6（9）： 1499-1512.

[96] ZHANG X， DUAN Y， WANG D， et al. Preparation of arginine modified PEI-conjugated chitosan copolymer for DNA delivery［J］. Carbohydr Polym， 2015， 122： 53-59.

[97] FURGESON D Y， YOCKMAN J W， JANAT M M， et al. Tumor efficacy and biodistribution of linear polyethylenimine-cholesterol/DNA complexes［J］. Molecular Therapy， 2004， 9（6）： 837-845.

[98] CHEN B， LIU M， ZHANG L M， et al. Polyethylenimine-functionalized graphene oxide as an efficient gene delivery vector［J］. J Mater Chem， 2011， 21（21）： 7736-7741.

[99] LUO F， LUO X， WANG L， et al. The design and applications of 1，8-naphthalimide-poly（amidoamine） dendritic platforms［J］. Curr Org Chem， 2023， 27（13）： 1164-1178.

[100] LI J， LIANG H， LIU J， et al. Poly （amidoamine） （PAMAM） dendrimer mediated delivery of drug and pDNA/siRNA for cancer therapy‍［J］. Int J Pharm， 2018， 546（1/2）： 215-225.

[101] TARACH P， JANASZEWSKA A. Recent advances in preclinical research using PAMAM dendrimers for cancer gene therapy［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（6）： 2912.

[102] SUREKHA B， KOMMANA N S， DUBEY S K， et al. PAMAM dendrimer as a talented multifunctional biomimetic nanocarrier for cancer diagnosis and therapy［J］. Colloids Surf B Biointerfaces， 2021， 204： 111837.

[103] LI X， TA W， HUA R， et al. A review on increasing the targeting of PAMAM as carriers in glioma therapy［J］. Biomedicines， 2022， 10（10）： 2455.

[104] SONG Z， LIANG X， WANG Y， et al. Phenylboronic acid-functionalized polyamidoamine-mediated miR-34a delivery for the treatment of gastric cancer［J］. Biomater Sci， 2019， 7（4）： 1632-1642.

[105] SINGH P， PANDIT S， MOKKAPATI V R S S， et al. Gold nanoparticles in diagnostics and therapeutics for human cancer［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（7）： 1979.

[106] FAN J， CHENG Y， SUN M. Functionalized gold nanoparticles： Synthesis， properties and biomedical applications［J］. Chem Rec， 2020， 20（12）： 1474-1504.

[107] LI M， LI Y， HUANG X， et al. Captopril-polyethyleneimine conjugate modified gold nanoparticles for co-delivery of drug and gene in anti-angiogenesis breast cancer therapy［J］. J Biomater Sci Polym Ed， 2015， 26（13）： 813-827.

[108] XIAO Y， JASKULA-SZTUL R， JAVADI A， et al. Co-delivery of doxorubicin and siRNA using octreotide-conjugated gold nanorods for targeted neuroendocrine cancer therapy‍［J］. Nanoscale， 2012， 4（22）： 7185-7193.

[109] CASTILLO R R， LOZANO D， VALLET-REGÍ M. Mesoporous silica nanoparticles as carriers for therapeutic biomolecules［J］. Pharmaceutics， 2020， 12（5）： 432.

[110] ZHOU Y， QUAN G， WU Q， et al. Mesoporous silica nanoparticles for drug and gene delivery‍［J］. Acta Pharm Sin B， 2018， 8（2）： 165-177.

[111] YUAN Y， LIU J， YU X， et al. Tumor-targeting pH/redox dual-responsive nanosystem epigenetically reverses cancer drug resistance by co-delivering doxorubicin and GCN5 siRNA［J］. Acta Biomater， 2021， 135： 556-566.

[112] ZHANG C G， ZHU W J， LIU Y， et al. Novel polymer micelle mediated co-delivery of doxorubicin and P-glycoprotein siRNA for reversal of multidrug resistance and synergistic tumor therapy［J］. Sci Rep， 2016， 6： 23859.

[113] MALEKI DIZAJ S， BARZEGAR-JALALI M， ZARRINTAN M H， et al.Calcium carbonate nanoparticles as cancer drug delivery system［J］. Expert Opin Drug Deliv， 2015， 12（10）： 1649-1660.

[114] ZHAO D， ZHUO R X， CHENG S X. Modification of calcium carbonate based gene and drug delivery systems by a cell-penetrating peptide［J］. Mol Biosyst， 2012， 8（12）： 3288-3294.

[115] FATEMIAN T， MOGHIMI H R， CHOWDHURY E H. Intracellular delivery of siRNAs targeting AKT and ERBB2 genes enhances chemosensitization of breast cancer cells in a culture and animal model［J］. Pharmaceutics， 2019， 11（9）： 458.

[116] MISHRA M， DEY T， MISHRA M， et al. RNA encapsulation in metal-organic frameworks for targeting cancer-causing genes［J］. Adv Ther （Weinh）， 2024， 7（9）： 2400144.

[117] RENSING H， BAUER M. Multiple organ failure. Mechanisms， clinical manifestation and therapy strategies［J］. Anaesthesist， 2001， 50（11）： 819-841.

[118] LI B， ASHRAFIZADEH M， JIAO T. Biomedical application of metal-organic frameworks （MOFs） in cancer therapy：Stimuli-responsive and biomimetic nanocomposites in targeted delivery， phototherapy and diagnosis‍［J］. Int J Biol Macromol， 2024， 260（Pt 2）： 129391.

[119] WANG H， CHEN Y， WANG H， et al. DNAzyme-loaded metal-organic frameworks （MOFs） for self-sufficient gene therapy［J］. Angew Chem Int Ed Engl， 2019， 58（22）： 7380-7384.

[120] ALIOUAT H， PENG Y， WASEEM Z， et al. Pure DNA scaffolded drug delivery systems for cancer therapy［J］. Biomaterials， 2022， 285： 121532.

[121] HU Q， LI H， WANG L， et al. DNA nanotechnology-enabled drug delivery systems［J］. Chem Rev， 2019， 119（10）： 6459-6506.

[122] ZHAO Y， GUO L J， DAI J B， et al. Application progress of DNA nanostructures in drug delivery and smart drug carriers‍［J］. Chin J Anal Chem， 2017， 45（7）： 1078-1087.

[123] LIU J B， SONG L L， LIU S L， et al. A DNA-based nanocarrier for efficient gene delivery and combined cancer therapy‍［J］. Nano Letters， 2018， 18（6）：3328-3334.