仙茅苷通过PTEN/AKT通路调控糖尿病心肌病心肌重构和血管生成的机制

Mechanisms of curculigoside A modulation of the PTEN/AKT pathway in myocardial remodeling and angiogenesis in diabetic cardiomyopathy

摘要

目的 探究仙茅苷（curculigoside A，CA）通过人第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路调控糖尿病心肌病患者心肌重构和血管生成的机制。 方法 使用35 mg·kg^-1链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）构建大鼠糖尿病心肌病模型，造模成功后，将60只大鼠随机分为对照组、模型组、仙茅苷治疗组，每组20只。仙茅苷治疗组采用500 μmol·kg^-1仙茅苷灌胃治疗，每3 d 1次，连续治疗4周。采用超声心动仪检测大鼠心脏功能，Masson染色检查大鼠心肌细胞胶原纤维沉积情况，免疫组织化学检测大鼠心肌细胞血管生成能力。将人脐静脉内皮细胞系（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）分为正常组、高糖组（30 μmol·L^-1葡萄糖培养细胞）、高糖+CA组（30 μmol·L^-1葡萄糖和100 μmol·L^-1 CA培养细胞）、高糖+AKT组（30 μmol·L^-1葡萄糖和5 μmol·L^-1 AKT激活剂SC79培养细胞），AKT组（5 μmol·L^-1AKT激活剂SC79培养细胞），AKT+CA组（5 μmol·L^-1 AKT激活剂SC79和100 μmol·L^-1 CA培养细胞）。采用流式细胞术检测HUVEC细胞的凋亡情况，管形成实验检测细胞生成血管能力。Western blotting检测PTEN/AKT通路、血管生成因子以及凋亡相关蛋白［PTEN、p-PTEN-Ser380、AKT、p-AKT-S473、BCL-2、BCL-2相关X蛋白（BCL-2 associated X protein， BAX）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）］的表达情况。 结果 与对照组比较，模型组大鼠的左心室舒张末期直径、左心室收缩末期直径均显著增加，左心室射血分数、左心室收缩功能以及心率均显著降低（P<0.001）；心肌细胞胶原纤维沉积，血管生成因子VEGF表达均显著降低，血管生成能力显著减弱（P<0.001）。与模型组比较，仙茅苷治疗组上述指标均改善（P<0.001）。AKT激活剂SC79培养下的HUVEC细胞VEGF因子分泌降低，管形成能力降低，细胞凋亡增加，PTEN、AKT蛋白磷酸化增加，BCL-2因子表达降低，BAX因子表达升高。与AKT激活剂处理组相比，仙茅苷组大鼠的心肌细胞PTEN、AKT磷酸化均降低，BCL-2因子表达升高，BAX因子表达降低。 结论 仙茅苷通过抑制PTEN/AKT通路磷酸化并增强心肌细胞重构与血管生成能力而改善糖尿病心肌病。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of the action of curculigoside A in myocardial remodeling and angiogenesis in patients with diabetic cardiomyopathy through phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/ protein kinase B （PTEN/AKT） pathway. Methods A rat model of diabetic cardiomyopathy was constructed by using 35 mg·kg^-1 streptozotocin （STZ）. 60 rats were randomly divided into the control group， the model group， and the curculigoside A treatment group， with 20 rats in each group， after the model was successfully constructed. The rats were treated with 500 μmol·kg^-1 centaurin by gavage every 3 days for 4 weeks. Echocardiography was used to detect the cardiac function of rats， Masson staining was used to examine the collagen fiber deposition in rat cardiomyocytes， and immunohistochemistry was used to detect the angiogenic ability of rat cardiomyocytes. human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） were divided into the normal group， high glucose group （cells cultured with 30 μmol·L^-1 glucose）， high glucose+CA group （cells cultured with 30 μmol·L^-1 glucose and 100 μmol·L^-1 CA）， high glucose+AKT group （cells cultured with 30 μmol·L^-1 glucose and 5 μmol·L^-1 AKT activator SC79）， AKT group （cells cultured with 5 μmol·L L^-1 AKT activator SC79）， AKT+CA group （cells cultured with 5 μmol·L^-1 AKT activator SC79 and 100 μmol·L^-1 CA）. and the apoptosis of HUVEC cells was detected by flow cytometry， and the vasculogenic ability of the cells was detected by tube formation assay. The expression of PTEN/AKT pathway， angiogenic factors， and apoptosis-related proteins ［PTEN， p-PTEN-Ser380， AKT， p-AKT-S473， BCL-2， BCL-2 associated X protein （BAX）， and vascular endothelial growth factor （VEGF）］ were detected by Western blotting. Results Compared with the control group， rats in the model group showed an increase in left ventricular end-diastolic diameter， left ventricular end-systolic diameter， a decrease in left ventricular ejection fraction， left ventricular systolic function， and heart rate， collagen fiber deposition in cardiomyocytes， a decrease in the expression of the angiogenic factor VEGF， and a decrease in angiogenic capacity， with statistically significant differences （P<0.001）. Compared with the model group， the above indexes were normalized in the curculigoside A treatment group， and the difference was statistically significant. Compared with the high glucose group， HUVEC cells cultured under AKT activator SC79 showed decreased secretion of VEGF factor， decreased tube formation ability， increased apoptosis， increased phosphorylation of PTEN and AKT proteins， decreased expression of BCL-2 factor， and elevated expression of BAX factor. Compared with the AKT activator-treated group， rat cardiomyocytes in the curculigoside A treat group showed decreased PTEN and AKT phosphorylation， elevated BCL-2 factor expression， and decreased BAX factor expression. Conclusion Curculigoside A improves diabetic cardiomyopathy by inhibiting the phosphorylation of PTEN/AKT pathway and enhancing cardiomyocyte remodeling and angiogenesis.

Graphical abstract

关键词

糖尿病心肌病 / 仙茅苷 / 第10号染色体缺失的磷酸酶/蛋白激酶B / 血管生成 / 心肌重构

Key words

diabetic cardiomyopathy / curculigoside A / phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/protein kinase B / angiogenesis / myocardial remodeling

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是由糖尿病引起的心血管疾病，严重者可导致患者发生心力衰竭，其发病率占糖尿病患者的19%~26%^［1-2］。糖尿病患者血液中的高血糖使血管内皮细胞损伤，损伤后的内皮细胞通透性增加，导致屏障功能障碍、血管舒张功能受损、血管形成能力降低^［3-4］。心肌纤维化作为DCM的特征性病理症状，其主要表现为成纤维细胞与巨噬细胞、内皮细胞以及心外膜细胞间的蛋白质相互作用网络出现异常，这些异常促进心肌纤维化的发生，因此，探究DCM患者的心肌重构与血管生成机制对控制疾病的进展有着关键作用^［5-6］。研究表明，吡格列酮（pioglitazone，PIO）可以通过上调小鼠心肌组织中人第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN）及张力蛋白同源的基因蛋白，抑制蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化，从而改善糖尿病小鼠模型心脏纤维化程度^［7］。另有研究表明，仙茅苷（curculigoside A，CA）可通过抑制miR155表达上调Janus激酶2/信号转导子及转录激活因子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）信号通路从而改善大鼠心肌缺血再灌注损伤^［8］，对于心肌疾病具有积极作用。本研究通过构建大鼠DCM模型探究CA对DCM心肌重构以及血管生成的作用机制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Forma Series Ⅱ 3111型二氧化碳培养箱、1300 Series A2型超净生物安全柜、Multiskan GO型全波长酶标仪，均购自美国Thermo Fisher公司；FV3000型免疫荧光成像系统、BX53型组织免疫拍照系统，均购自日本Olympus Corporation公司；Optima XPN-100型超速离心机（美国Beckman公司）；VEVO 2100型超声心动图仪（加拿大VisualSonics公司）。

1.2 试药

葡萄糖（批号HY-B1125）、SC79（批号HY-18749）、链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批号HY-13753），均购自美国MCE公司；RPMI1640培养基（批号SH30027.01）、高糖Dulbecco’s改良培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，批号SH30243.02），均购自美国Hyclone-Cytiva公司；胎牛血清（批号A5670801，美国Thermo Fisher公司）；抗CD31抗体（批号sc-20071）、PTEN抗体（批号sc-73420）、p-PTEN-Ser380抗体（批号sc-377573）、AKT抗体（批号sc-5298）、p-AKT-S473抗体（批号sc-24500）、GAPDH抗体（批号sc-137179）、BCL-2抗体（批号sc-56018）、BAX抗体（批号sc-70408），均购自美国Santa Cruz公司；动物组织总蛋白提取试剂盒（批号19221ES50）、仙茅苷（批号53193ES10）、细胞增殖及毒性检测试剂盒CCK8（批号40206ES80），均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；大鼠血糖酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（APE21393，上海江莱生物科技有限公司）；Masson三色染色试剂盒（批号C0189S）、细胞凋亡检测试剂盒Annexin V/PI（批号C1052）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号P0398S），均购自南京碧云天生物技术有限公司。

1.3 细胞系与动物

人脐静脉内皮细胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC，上海启达生物有限公司）。

60只无特定病原体动物（specific pathogen free，SPF）大鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，大鼠体质量为200~220 g，饲养于实验动物中心屏障环境，温度为（22±1）℃、相对湿度为（50%± 10%）、12 h昼夜明暗循环。本研究已通过医院伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 造模与给药

60只大鼠按照随机数字表法分成对照组、模型组、仙茅苷治疗组，每组20只。对照组大鼠喂养普通饲料，模型组、仙茅苷治疗组大鼠喂养高糖高脂饲料，仙茅苷治疗组采用灌胃方法，每3 d灌胃500 μmol·kg^-1的CA，连续处理4周。喂养8周后一次性腹腔注射剂量为35 mg·kg^-1的STZ，对照组注射同等剂量的枸缘酸钠缓冲液。给药72 h后，采集大鼠尾静脉血以及尿液，通过ELISA试剂盒检测大鼠血糖以及尿糖含量。当随机血糖>16.7 mmol·L^-1、尿糖试纸测试为4“+”，表示造模成功。

2.2 大鼠心脏功能的检测

大鼠吸入2%的异氟烷麻醉后暴露胸部，剔除胸毛，检测心脏功能，测定大鼠的左心室舒张末期直径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期直径（left ventricular end- systaltic diameter，LVESD）、左心室内径（left ventricular internal diameter，LVID）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室收缩功能（left ventricular systolic function，LVSF）以及心率（heart rate，HR）。

2.3 Masson染色观察大鼠心肌纤维

对心脏组织进行切片，切成4~6 μm的连续切片，贴附于载玻片上，60 ℃烘片使切片平整黏附。按照Masson三色染色试剂盒说明书进行操作，经过固定、洗涤、苏木素染色、洋红染色后，在苯胺蓝溶液中返蓝5~10 min，将玻片依次浸泡在体积分数70%、95%、100%的乙醇溶液中进行脱水，再用二甲苯透明玻片，最后用封片剂进行封片。

2.4 免疫组织化学染色评估毛细血管的密度

将心脏组织切片脱蜡水化，在柠檬酸盐缓冲液中浸泡10 min进行抗原修复。将切片在封闭液中浸泡30 min。将切片与CD31一抗（1∶100）在4 ℃中孵育过夜。将切片浸入二抗（1∶1 000）中孵育1 h，并用二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）、苏木素染色后检测免疫反应性。

2.5 细胞培养

将HUVEC接种在含10%胎牛血清的1640培养基上，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达到80%后进行后续实验。将HUVEC细胞分为正常组、高糖组（30 μmol·L^-1葡萄糖培养细胞）、高糖+CA组（30 μmol·L^-1葡萄糖和100 μmol·L^-1 CA培养细胞）、高糖+AKT组（30 μmol·L^-1葡萄糖和5 μmol·L^-1 AKT激活剂SC79培养细胞）、AKT组（5 μmol·L^-1AKT激活剂SC79培养细胞）和AKT+CA组（5 μmol·L^-1 AKT激活剂SC79和100 μmol·L^-1 CA培养细胞）。

2.6 Western blotting检测PTEN/AKT通路、血管生成因子以及凋亡相关蛋白的表达情况

收集培养后的HUVEC细胞与大鼠心脏组织，组织通过蛋白提取试剂盒进行提取。收集到的蛋白通过BCA蛋白定量试剂盒测量蛋白浓度，将蛋白质量浓度调整为1 μg·μL^-1，总上样体积为20 μL。将样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（电压为80 V）进行分离，电泳结束后采用120 V电压将其转移到蛋白转印膜上。用含有5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭1 h。4 ℃过夜孵育一抗。次日加入二抗，在室温下孵育1 h，使用增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）在凝胶图像处理系统上进行可视化。

2.7 管形成实验观察内皮管状结构

取Matrigel放置于冰上进行解冻，再使用预冷的移液器吸取50 μL解冻后的Matrigel置于96孔板中，37 ℃孵育30 min。待凝固后加入2×10⁴个HUVEC细胞与100 μL含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养基。将细胞在37 ℃下孵育24 h后使用光学显微镜观察并分析内皮管状结构的形成情况。

2.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行处理。计量数据表示为（\overline{x}\pm s），两组间比较采用t检验，多组间比较采用单变量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CA对DCM大鼠心肌功能的影响

与对照组比较，模型组大鼠的LVEDD、LVESD均显著升高，LVEF、LVSF、HR均显著降低（P<0.05）；与模型组比较，仙茅苷治疗组大鼠的LVEDD、LVESD均显著降低，LVEF、LVSF、HR均显著升高（P<0.05）。Masson染色结果显示，与对照组比较，模型组的中心肌细胞胶原纤维大量增多并沉积，经CA治疗后心肌细胞胶原纤维较模型组降低，表明CA治疗可有效改善模型组大鼠的心肌功能，降低胶原纤维的过度形成。见表1、图1。

3.2 CA对大鼠体内血管生成的影响

与对照组（0.99±0.02）比较，模型组大鼠的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达量（0.51±0.03）显著降低，经CA治疗后VEGF蛋白表达量（0.85±0.02）上升，且与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，模型组大鼠的心脏组织毛细血管密度降低；与模型组比较，仙茅苷治疗组大鼠的心脏组织毛细血管密度升高，与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）无明显差异。见图2。

3.3 CA对大鼠体外血管生成的影响

与正常组比较，高糖组细胞的VEGF因子表达水平显著降低，细胞凋亡率上升（P<0.001）；经CA治疗后，VEGF因子的表达水平升高，细胞凋亡率显著降低，与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。管形成实验结果显示，在高糖条件下抑制内皮细胞发芽形成管腔，经过CA治疗后可有效恢复内皮细胞的管腔形成能力。表明高糖条件下内皮细胞血管形成能力降低，细胞趋于凋亡状态，经过CA治疗后可以提高内皮细胞的血管生成能力，改善内皮细胞凋亡状态。见图3、表2。

3.4 CA对PTEN/AKT通路蛋白的影响

体内实验结果显示，与对照组比较，模型组大鼠的PTEN、AKT蛋白磷酸化增加，BCL-2因子表达降低，BCL-2相关X蛋白（BCL-2 associated X protein，BAX）因子表达升高，经过CA治疗后，大鼠心肌细胞的PTEN、AKT磷酸化降低，BCL-2因子表达升高，BAX因子表达降低。体外实验结果显示，与正常组比较，高糖组的内皮细胞PTEN、AKT蛋白磷酸化增加，BCL-2因子表达降低，BAX因子表达升高；经过CA治疗后，内皮细胞PTEN、AKT蛋白磷酸化降低，BCL-2因子表达升高，BAX因子表达降低。与AKT比较，AKT+高糖组内皮细胞的PTEN、AKT磷酸化增加，BCL-2因子的表达降低，BAX因子的表达升高，经过CA治疗后，内皮细胞的PTEN、AKT磷酸化降低，BCL-2因子的表达升高，BAX因子的表达降低。见图4、表3。

4 讨论

DCM是与胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病和高胰岛素血症相关的心肌病，是导致糖尿病患者死亡的重要原因^［9-10］，其主要特征是心脏出现功能和结构的改变。早期会出现左心室舒张功能障碍（left ventricular diastolic dysfunction，LVDD）、左心室肥大和血管内皮功能障碍等并发症，随着研究的深入高血糖已被认为是导致内皮细胞功能障碍的主要诱因^［11-12］。由于高血糖环境造成内皮细胞与肌细胞发生非酶促使的糖基化增强、氧化还原电位改变以及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活^［13］。本研究结果发现，与对照组比较，模型组大鼠的LVEDD、LVESD均显著升高，LVEF、LVSF、HR均显著降低（P<0.05），经过CA治疗后，上述指标均改善。表明高糖环境会导致左心室功能减退，CA可有效改善DCM大鼠的心肌功能异常情况。

通过Masson染色发现，模型组大鼠心脏组织出现大量胶原纤维沉积，从而导致心肌功能出现异常。经过CA治疗后，大鼠心肌组织纤维化程度降低，表明CA可以改善DCM大鼠的心肌细胞纤维化程度，促进心肌细胞重构。有研究结果表明，褪黑素可以通过增强VEGF的分泌而改善糖尿病小鼠的心脏功能以及降低心肌细胞的自噬现象^［14］。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠VEGF表达量降低，毛细血管密度降低；经CA治疗后VEGF表达量升高，毛细血管密度增加。表明DCM可导致大鼠心脏毛细血管密度降低，内皮细胞血管生成能力降低，CA可通过促进毛细血管生成增强DCM大鼠心脏组织的血管生成能力。研究发现，在高糖条件下VEGF表达量降低，内皮细胞凋亡增加，且细胞管形成能力降低；经过CA处理细胞后，VEGF表达量升高，内皮细胞凋亡率降低且血管形成能力恢复正常，与动物实验结果一致。有研究表明，l-半胱氨酸乙酰化后的产物N-乙酰-l-半胱氨酸（N-acetyl-l-cysteine，NAC），可以作为抗氧化剂，增加细胞内还原型谷胱甘肽等抗氧化酶的活性，可通过上调DJ-1蛋白水平调控PTEN/AKT通路从而减轻心肌缺血再灌注损伤^［15］。本研究结果显示，模型组大鼠的PTEN、AKT蛋白磷酸化增加，促凋亡蛋白BAX分泌增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达降低。经过CA治疗后，大鼠心肌细胞PTEN、AKT蛋白磷酸化降低，促凋亡蛋白BAX分泌降低，抗凋亡蛋白BCL-2表达增加，这与细胞实验的结果一致。采用AKT激活剂SC79C处理内皮细胞HUVEC，PTEN、AKT蛋白磷酸化增加，表明激活剂发挥正常作用，促凋亡蛋白BAX分泌增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达降低。经过CA治疗后，内皮细胞PTEN、AKT蛋白磷酸化降低，促凋亡蛋白BAX分泌降低，抗凋亡蛋白BCL-2表达增加。与上述动物实验以及细胞实验结果一致，表明CA可通过抑制PTEN/AKT通路磷酸化改善糖尿病心肌病。

综上所述，本研究通过体内、体外实验均证明CA可通过抑制糖尿病心肌病中PTEN/AKT通路过度磷酸化，降低心肌胶原纤维沉积，促进心肌细胞重构，促进内皮细胞血管生成能力从而改善DCM。

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基金资助

河北省中医药科研计划项目(2022488)