基于核呼吸因子2抗氧化通路探究三黄血竭方对糖尿病足创面修复的作用

Exploring the effect of Sanhuang Xuejie Formula on wound repair of diabetic foot based on the Nrf2 antioxidant pathway

摘要

目的 观察三黄血竭方对糖尿病足创面修复的作用，并基于核呼吸因子2（nuclear respiratory factor 2，Nrf2）抗氧化通路探究其作用机制。 方法 构建SD大鼠2型糖尿病全层皮肤损伤模型，大鼠被随机分为4个组：对照组（非糖尿病）、模型组、三黄血竭方低剂量组和三黄血竭方高剂量组，每组6只。给药组外敷不同剂量的三黄血竭方膏剂，其他组等量外敷凡士林乳膏，每2 d清洁换药1次，连续给药14 d。在第1、7、14天，记录并计算各组的创面愈合率。通过H&E染色观察创面愈合状况，用免疫组织化学染色法检测胰腺β细胞数量；采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blotting技术分析创面组织中胶原蛋白Ⅰ（collagen-1）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Nrf2、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）mRNA或蛋白的表达情况。 结果 在给药后第7、14天，模型组大鼠的创面愈合率显著小于对照组（P<0.05）；低、高剂量组的愈合率均明显高于模型组（P<0.05）；高剂量组的胰腺β细胞数量有所增加（P<0.05）；创面组织中collagen-1、TGF-β、α-SMA的mRNA水平升高（P<0.05），Nrf2、HO-1的蛋白水平也升高（P<0.05）。 结论 三黄血竭方可能通过激活Nrf2/HO-1信号途径，降低创面组织的氧化应激损害，从而促进糖尿病足创面修复。

Abstract

Objective To investigate the effects of Sanhuang Xuejie Formula on the wound repair of diabetic foot and explore its underlying mechanisms via the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） antioxidant pathway. Methods Sprague-Dawley （SD） rats with type 2 diabetes and full-thickness skin injuries were divided into 4 groups： control （non-diabetic） group， model group， low-dose group Sanhuang Formula， and high-dose group Sanhuang Formula， with 6 rats in each group. The treatment groups received Sanhuang Xuejie Formula Ointment， while the control group and model group received petrolatum. Dressings were changed every 2 days for a total of 14 days. Wound healing rates were recorded on days 1， 7， and 14. Hematoxylin and eosin （H&E） staining and immunohistochemical staining were used to assess wound healing and β-cell counts， respectively. Quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） and western blotting were employed to analyze the expression of collagen-1， transforming growth factor-β （TGF-β）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， Nrf2，and heme oxygenase-1 （HO-1） in wound tissue. Results On days 7 and 14 post-injury， the model group exhibited a significantly reduced wound healing rate compared with the control group （P<0.05）. The low-dose and high-dose treatment groups showed significantly improved healing rates compared with the model group （P<0.05）. The high-dose treatment group demonstrated an increased pancreatic β-cell count （P<0.05）. There was upregulation of collagen-1， TGF-β， and α-SMA mRNA in the wound tissue （P<0.05）， as well as elevated protein expression of Nrf2 and HO-1 （P<0.05）. Conclusion Sanhuang Xuejie Formula may promote the repair of diabetic foot wounds by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway and reducing oxidative stress damage in wound tissue.

Graphical abstract

关键词

三黄血竭方 / 糖尿病 / 创面修复 / 核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1

Key words

Sanhuang Xuejie Formula / diabetes / wound repair / nuclear respiratory factor 2/heme oxygenase-1

糖尿病的主要特征为长期的高血糖状态，这种状态常伴有神经和血管系统的病变并发症，如自主神经病变、动脉粥样硬化、肢体坏死、足部溃疡等^［1］。在全球范围内，2型糖尿病患病率逐年上升，截止2021年世界糖尿病统计数据显示，5.29亿人患有糖尿病，年龄标化患病率为6.1%，其中96.0%为2型糖尿病^［2］。《素问奇病论》中记载了脾瘅的相关内容，书中提到，过度摄入甜美和肥腻食物会导致内热在脾脏中积聚。文中指出“肥胖引起内热，甜食导致中满，因此气机上逆，最终演变为消渴”，这明确表示脾瘅有可能进展为消渴病。黄子杰等^［3］提出了从阴阳角度分析胰岛素，并结合中西医学的视角，探讨了胰岛素与“阴胜则阳病，阳胜则阴病”之间的关系，揭示了中医理论与现代医学临床表现的关联性。

临床研究显示，一些糖尿病患者容易出现糖尿病足溃疡^［4］，尤其是那些患有感觉神经病变、外周动脉疾病和控制不佳的高血糖症的患者，他们具有更大风险面临危及生命的并发症，包括蜂窝织炎、骨髓炎和败血症^［5］。这种慢性不愈合的创面会导致反复住院，最终需要下肢截肢，长期发病导致死亡的风险很高^［6］。现代医学认为，在长时间的炎症过程中，随着活性氧中间体（reactive oxygen intermediates，ROI）的释放，中性粒细胞和巨噬细胞的过度积聚会导致严重的氧化应激反应，进而对角质细胞和成纤维细胞造成炎症性损害，这些细胞对于细胞外基质的构建和表皮再生至关重要^［7］。此外，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的产生和释放增加也会阻碍细胞外基质的组装和创面闭合^［8］。糖尿病足创面愈合涉及炎症、增殖、重塑3个阶段，3个阶段相互关联，导致治疗充满挑战。西医治疗侧重于血糖控制、抗感染、清创，但创面愈合缓慢导致的护理成本升高，从而给患者造成经济负担。中药治疗糖尿病足溃疡具有独特优势，如多靶点作用、多途径治疗、安全性高、效果显著且经济便捷，因此，中药治疗在糖尿病足的综合治疗中发挥着重要作用。

本研究课题组参考了多部经典文籍，遵循清热解毒、消肿散结、化瘀止痛的治疗原则，将三黄血竭方制备成膏剂，用于糖尿病创面的外用治疗，并探讨该膏剂基于核呼吸因子2（nuclear respiratory factor 2，Nrf2）抗氧化通路对糖尿病足创面修复的作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

580型血糖仪及试纸条（鱼跃医疗设备有限公司）；ST5020-CV5030型全自动染封一体机（德国LEICA公司）；ECLIPSE型倒置式生物显微镜（日本Nikon公司）；S60型数字全景扫描仪（日本滨松光子学株式会社）。

1.2 试药

黄连（批号121752-201801）、血竭（批号120906-201410）、黄柏（批号121510-201606）、紫草（批号121430-201705）、赤芍（批号121092-201804）、大黄（批号120984-201202）、苍术（批号120932-201708）、川牛膝（批号121065-201707），均购自安徽亳州珍宝岛中药材公司（符合《中华人民共和国药典》标准）；异氟烷（批号R510-22-16，瑞沃德公司）；苏木素伊红染色试剂盒（批号C0105S，上海碧云天生物技术股份有限公司）；凡士林（批号8009-03-8）、链脲佐菌素（streptozocin，STZ，批号S8050），均购自索莱宝公司；逆转录试剂盒（诺唯赞公司）；鼠抗Nrf2（批号12721T）、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1，批号70081S）、β-actin（批号4970T），均购自Cell Signaling Technology公司；鼠抗胰岛素（批号ZRB1138-25UL）、collagen-1（批号SAB5702908）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，批号ABF17-I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，批号A5228）抗体，均购自默克公司；鼠二抗（批号S0002）购自Affintiy公司。

1.3 实验动物

24只5~6周龄的SPF级雄性SD大鼠（北京维通利华公司），动物生产许可证编号为SCXK京2023-0151。所有大鼠按动物房标准环境饲养，实验程序均符合我院动物中心委员会伦理审核标准。

2 方法

2.1 造模及分组

将SD大鼠随机分为4组：对照组、模型组、三黄血竭方低剂量组和三黄血竭方高剂量组，每组6只。除对照组外，其他大鼠通过高糖高脂饮食联合低剂量STZ腹腔注射建立2型糖尿病模型。具体步骤：大鼠先进行1周的适应喂养，随后7周内喂食高糖高脂饲料。第7周末，大鼠空腹12 h后腹腔注射50 mg·kg^-1的STZ。注射72 h后，通过尾静脉取血检测血糖，若血糖值≥16.7 mmol·L^-1即判定为模型构建成功。各组大鼠吸入体积分数3%~5%的异氟烷麻醉后对其背部常规脱毛，用无菌活检冲头从大鼠背部的预定区域切下全层皮肤的圆形块（1 cm），所有组别均造模成功。

2.2 给药方法

对照组与模型组大鼠给予清创并外敷凡士林乳膏纱布于背部创面，再对覆盖部位应用压缩弹性网敷料，每2 d清创换药1次，连续治疗14 d。三黄血竭方低剂量组与三黄血竭方高剂量组大鼠给予清创并外敷含不同剂量三黄血竭方膏剂的纱布于背部创面，再对覆盖部位应用压缩弹性网敷料，每2 d清创换药1次，连续治疗14 d。三黄血竭方组方：黄连、黄柏、大黄、紫草、赤芍各75 g，血竭、苍术、川牛膝各30 g。所有中药混合研磨并过120目筛，对研磨好的药粉进行灭菌，灭菌温度为120 ℃，灭菌120 min，低剂量药粉中以药粉∶凡士林=1∶6加入医用凡士林捣匀，高剂量药粉中以药粉∶凡士林=1∶3加入医用凡士林捣匀，放置于阴凉干燥处储存备用。三黄血竭方膏剂与凡士林乳膏涂抹层厚度控制在0.5~1.0 mm。

2.3 创面愈合分析

在创面给药后第1、7、14天，拍照并记录所有组的创面面积。用ImageJ1.8.0软件对图像进行处理，并计算给药后7、14 d的创面愈合率。创面愈合率=［（给药后首日创面面积-各时间点创面面积）／给药后首日创面面积］×100%。

2.4 创面组织病理学分析

于给药后14 d收集大鼠背部创面及距创缘0.5 cm内的皮肤组织，剪下一小部分用福尔马林固定，其余部分用液氮快速冷冻并在-80 ℃存放以备后续使用，之后对大鼠进行安乐死。创面组织固定48 h后脱水包埋，取部分切片，进行H&E染色，用数字全景扫描仪于40倍放大倍数下观察各组创面组织的变化。

2.5 定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

取给药后14 d大鼠的皮肤组织样本，低温碾碎后，先通过试剂盒从样本中提取总RNA，并测定其浓度。利用PrimeScript RT reagent试剂盒将提取的RNA转录成cDNA。随后，利用SYBR Premix Ex Taq™对cDNA样品进行实时PCR分析。反应混合物由9 μL的qPCR主混合物、10 ng的cDNA溶液和20 μL所有引物组成。PCR结果采用Ct值和2^-ΔΔCt法计算靶基因的相对表达。数据用同一样本的β-actin与对照进行归一化。引物序列见表1。

2.6 胰腺β细胞数量变化

于给药后14 d，脱颈处死大鼠，收集胰腺。用组织固定液固定创面组织48 h后脱水包埋，取部分切片，使用一抗胰岛素抗体通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）进行染色，用数字全景扫描仪于40倍放大倍数下观察各组的胰腺β细胞数量变化，并计算每10个视野中的胰腺β细胞数量。

2.7 Western blotting

在创面给药后14 d，对大鼠皮肤样本进行低温研磨处理，利用Ripa缓冲液提取蛋白质，并通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜。在室温下用5%脱脂奶封闭后，4 ℃孵育一抗Nrf2和HO-1过夜，TBST清洗3次。室温下二抗孵育2 h，再用TBST清洗3次。显影操作在凝胶成像系统中完成。

2.8 统计学方法

利用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。数据以（\overline{x}±s）表示。多组数据比较采用单变量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 三黄血竭方对糖尿病大鼠创面愈合的影响

各组实验大鼠的创面面积随着给药时间的延长均不断缩小。在给药后第7、14天，模型组大鼠的创面愈合率明显低于对照组（P<0.01）；与模型组比较，三黄血竭方低剂量组和三黄血竭方高剂量组大鼠的创面愈合率均显著提高（P<0.05）。见图1和图2。

3.2 三黄血竭方对糖尿病大鼠创面再上皮化及重塑相关基因的影响

给药后第14天，对照组和治疗组大鼠的创面再上皮化明显，且上皮下观察到轻度成纤维细胞增殖，所有组别中三黄血竭方高剂量组未见组织炎症，见图3。

相较于对照组，模型组大鼠创面组织中的collagen-1、TGF-‍β和α‍-SMA mRNA水平均显著降低（P<0.05）。与模型组比较，三黄血竭方低剂量和三黄血竭方高剂量组大鼠创面组织的collagen-1、TGF-‍β、α‍-SMA mRNA表达均明显升高（P<0.05），见图4。

3.3 三黄血竭方对糖尿病大鼠胰腺β细胞数量的影响

模型组大鼠的胰腺β细胞数量比对照组少，而三黄血竭方低剂量组和三黄血竭方高剂量组大鼠的β细胞数量有所增多，见图5。

比较各组每10个视野中的胰腺β细胞数量，结果显示模型组大鼠的胰腺β细胞数量显著少于对照组（P<0.05），在治疗组中，三黄血竭方低剂量组和三黄血竭方高剂量组的大鼠的β细胞数量均显著多于模型组（P<0.05），见图6。

3.4 三黄血竭方对Nrf2/HO-1信号通路的影响

Western blotting结果显示，相比于对照组，STZ诱导的糖尿病大鼠模型组Nrf2、HO-1蛋白表达的水平上升，相比于对照组和模型组，三黄血竭方低剂量组和三黄血竭方高剂量组的Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著增加（P<0.05）。见图7和图8。

4 讨论

皮肤是人体最大的器官，由不同的外胚层组织组成，这些组织可保护肌肉、韧带、骨骼和内脏等。它也是一道保护墙，可以阻挡微生物、光、热等外界伤害^［9-10］。当受伤时，正常上皮层（称为皮肤）上会形成创面。然而，糖尿病和创面愈合有着复杂的关系，由于糖尿病患者存在持续的高血糖症状，这会影响身体以正常速度恢复的能力^［11-12］。并且自身体内长时间维持高血糖也会导致其微血管、神经系统和免疫系统都有一定的受损^［13］。因此，一旦出现创面，很容易不断分泌含有大量炎症介质和蛋白酶的渗出物，形成慢性炎症，不仅会破坏细胞外基质和创面床，还会稀释或降解活性药物，导致创面愈合延迟或不愈合^［14-15］。

本研究通过STZ诱导建立2型糖尿病SD大鼠全层皮肤缺损模型，对三黄血竭方是否影响糖尿病大鼠创面愈合进行研究。结果显示，与糖尿病模型组比较，给予三黄血竭方7、14 d后，糖尿病大鼠创面愈合显著加快。H&E染色结果也显示，三黄血竭方各剂量组的创面肉芽组织和成纤维细胞增加。成纤维细胞在创面修复过程中承担着关键角色，主要功能包括生成胶原蛋白以及构建细胞外基质^［16］。在创面修复的增殖阶段，这些细胞从静止状态转变为活跃状态，其迁移能力大幅提升，并逐步转型为具有收缩功能的肌成纤维细胞。这些肌成纤维细胞不仅收缩力增强，还能促进细胞外基质的快速生成，助力创面恢复^［17］。在肌成纤维细胞的形成过程中，α-SMA的基因表达水平是调控其形成的关键因素，它是肌成纤维细胞的标志性分子，在负责调控细胞外基质的同时，推动受损组织的修复^［18］。qRT-PCR检测结果显示，三黄血竭方可显著上调胶原蛋白形成相关基因（collagen-1、TGF-β、α-SMA）的表达，表明三黄血竭方干预14 d后可加速糖尿病大鼠创面组织的胶原沉淀和肌成纤维细胞的形成。IHC染色图结果显示，模型组的大鼠胰腺β细胞数量比对照组少，表明经过STZ诱导会破坏大鼠的胰岛β细胞。然而，经三黄血竭方外敷治疗的糖尿病大鼠胰岛β细胞数量相对模型组增加。该结果表明高剂量三黄血竭方可促进胰岛β细胞增殖以分泌更多的胰岛素，从而降低血糖水平。

糖尿病患者的创面愈合延迟和不愈合对临床医生来说是一个挑战。相关研究已经证实，在高血糖环境中，过度的氧化应激会通过一系列生理变化显著抑制创面愈合的正常过程，如神经营养功能受损、血管生成减少和炎症增加。许多研究人员强调抗氧化疗法在糖尿病创面治疗中的巨大潜力。研究表明，Nrf2通路的重要调节因子在糖尿病创面的氧化应激中起着关键作用^［19］。目前，基于Nrf2抗氧化通路治疗糖尿病创面的策略是调节过度氧化应激和抗氧化活性之间的平衡^［20］。体外研究结果表明，Nrf2/HO-1信号通路能够作为内源性抗氧化系统，有效对抗多种器官内的氧化应激。实验结果显示，通过激活该信号途径，能提升多种抗氧化剂的水平，从而防止细胞遭受氧化应激的损害^［21］。另外，多项研究结果表明，Nrf2/HO-1信号通路在创面愈合中起重要作用^［22-23］。本研究发现，三黄血竭方明显增加了Nrf2、HO-1蛋白的表达，表明三黄血竭方能够激活Nrf2/HO-1信号通路，减轻皮肤细胞的氧化应激损伤。

综上所述，本研究外敷三黄血竭方膏剂可加速糖尿病创面愈合。同时，三黄血竭方对胰腺β细胞具有保护作用，这可能是通过Nrf2/HO-1信号通路实现的。

参考文献

[1] MORLEY J E. Diabetes： The diabetic brain‍‍［J］. Nat Rev Endocrinol， 2017， 13（10）： 570-571.

[2] GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global， regional， and national burden of diabetes from 1990 to 2021， with projections of prevalence to 2050： A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021‍［J］. Lancet， 2023， 402（10397）： 203-234.

[3] 黄子杰， 谢欣颖. 立足 “中西机制互参” 探讨2型糖尿病早期中医辨治体系‍［J］. 新中医， 2024， 56（13）： 208-213.

[4] HUANG Zijie， XIE Xinying. Discussion on Chinese medicine syndrome differentiation and treatment of early stage of type 2 diabetes mellitus based on “mutual reference of Chinese and western medicine mechanisms”‍［J］. Journal of New Chinese Medicine， 2024， 56（13）： 208-213.

[5] ANGELOUSI A， ALEXANDRAKI K I， MYTARELI C， et al. New developments and concepts in the diagnosis and management of diabetes insipidus （AVP-deficiency and resistance）‍［J］.J Neuroendocrinol， 2023， 35（1）： e13233.

[6] LAU H C， KIM A. Pharmaceutical perspectives of impaired wound healing in diabetic foot ulcer‍［J］. J Pharm Investig， 2016， 46（5）： 403-423.

[7] RAMSEY S D， NEWTON K， BLOUGH D， et al.Incidence， outcomes， and cost of foot ulcers in patients with diabetes‍［J］. Diabetes Care， 1999， 22（3）： 382-387.

[8] DENG L， DU C， SONG P， et al. The role of oxidative stress and antioxidants in diabetic wound healing‍［J］. Oxid Med Cell Longev， 2021， 2021： 8852759.

[9] MOORE Z E， CORCORAN M A， PATTON D.Nutritional interventions for treating foot ulcers in people with diabetes‍［J］. Cochrane Database Syst Rev， 2020， 7（7）： CD011378.

[10] KHAVKIN J， ELLIS D A F. Aging skin： Histology， physiology， and pathology‍［J］. Facial Plast Surg Clin North Am， 2011， 19（2）： 229-234.

[11] SOLANO F. Metabolism and functions of amino acids in the skin‍［J］. Adv Exp Med Biol， 2020， 1265： 187-199.

[12] STEPHENS P， THOMAS D W. The cellular proliferative phase of the wound repair process‍［J］. J Wound Care， 2002， 11（7）： 253-261.

[13] WERNER S， KRIEG T， SMOLA H.Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing‍［J］. J Invest Dermatol， 2007， 127（5）： 998-1008.

[14] GANTWERKER E A， HOM D B. Skin： Histology and physiology of wound healing‍［J］. Facial Plast Surg Clin North Am， 2011， 19（3）： 441-453.

[15] CHEN P， VILORIO N C， DHATARIYA K，et al.Guidelines on interventions to enhance healing of foot ulcers in people with diabetes （IWGDF 2023 update）‍［J］. Diabetes Metab Res Rev， 2024， 40（3）： e3644.

[16] ARMSTRONG D G， TAN T W， BOULTON A J M， et al. Diabetic foot ulcers： A review‍［J］. JAMA， 2023， 330（1）： 62-75.

[17] WEI K， NGUYEN H N， BRENNER M B. Fibroblast pathology in inflammatory diseases‍［J］. J Clin Invest， 2021， 131（20）： e149538.

[18] DARBY I A， HEWITSON T D. Fibroblast differentiation in wound healing and fibrosis‍［J］. Int Rev Cytol， 2007， 257： 143-179.

[19] SAKAGUCHI M， NAKAJIMA R， ICHINOSE T， et al. α‍-SMA positive vascular mural cells suppress cyst formation in hemangioblastoma‍［J］. Brain Tumor Pathol， 2023， 40（3）： 176-184.

[20] HE F， RU X， WEN T. NRF2， a transcription factor for stress response and beyond‍［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（13）： 4777.

[21] BOORMAN E， KILLICK R， AARSLAND D，et al. NRF2：An emerging role in neural stem cell regulation and neurogenesis‍［J］. Free Radic Biol Med， 2022， 193（Pt 1）： 437-446.

[22] LIU Y， WANG S， JIN G， et al. Network pharmacology-based study on the mechanism of ShenKang injection in diabetic kidney disease through Keap1/Nrf2/Ho-1 signaling pathway‍［J］. Phytomedicine， 2023， 118： 154915.

[23] YANG R， GAO W， WANG Z， et al. Polyphyllin I induced ferroptosis to suppress the progression of hepatocellular carcinoma through activation of the mitochondrial dysfunction via Nrf2/HO-1/GPX4 axis‍［J］. Phytomedicine， 2024， 122： 155135.

[24] XIANG S， ZHAO L， TANG C， et al. Icariin inhibits osteoblast ferroptosis via Nrf2/HO-1 signaling and enhances healing of osteoporotic fractures‍［J］. Eur J Pharmacol， 2024， 965： 176244.

基金资助

河北省中医药管理局科研项目(2021346)