基于UPLC-Q-TOF-MS的银花抗病毒口服液化学成分分析

Analysis of the chemical constituents of Yinhua Antiviral Oral Liquid based on UPLC-Q-TOF-MS

摘要

目的 对银花抗病毒口服液的化学成分进行分析鉴定。 方法 采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）正负离子模式，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）色谱柱；流动相为体积分数0.1%甲酸（A）和乙腈（B），梯度洗脱；流速为0.4 mL·min^-1；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取（molecular feature extraction，MFE）功能，根据正负离子模式质谱扫描提供化合物一级、二级质谱数据的质谱碎片离子信息，采用中药成分数据库（traditional Chinese medicine component database，TCM-DATA），对照品比对等进行定性分析，并对化学成分进行归属。 结果 从银花口服液中共鉴定出85个化学成分，包括黄酮类20个、萜类19个、生物碱类5个、苯乙醇苷类6个、酚酸类10个、苯丙素类10个、其他类15个，并对各成分来源进行归属，同时对酚酸类、生物碱类、黄酮类、苯乙醇苷类化合物的裂解规律进行分析。 结论 建立的方法灵敏度高、准确高效，能够全面、快速地分析和鉴定银花抗病毒口服液的化学成分，为银花抗病毒口服液的质量控制和物质基础研究提供依据。

Abstract

Objective To analyze the chemical constituents of Yinhua Antiviral Oral Liquid. Methods By utilizing ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） technology， the analysis was performed in both positive and negative ion modes. An Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column （100 mm×3.0 mm， 1.8 μm） was employed with gradient elution. The mobile phase consisted of an aqueous phase （A， containing 0.1% formic acid） and an organic phase （acetonitrile， B）. The flow rate was maintained at 0.4 mL·min^-¹， the column temperature was set at 30 ℃， and the injection volume was 1 μL. Qualitative analysis was conducted by using the molecular feature extraction （MFE） function in the Agilent MassHunter Qualitative Analysis workstation. The identification of chemical components was based on mass spectrometry fragment ion information from primary and secondary mass spectrometry data obtained in both ion modes， the traditional Chinese medicine component database （TCM-DATA）， and comparison with reference substances. Results A total of 85 components were identified in Yinhua Antiviral Oral Liquid， including 20 flavonoids， 19 terpenoids， 5 alkaloids， 6 phenylethanol glycosides， 10 phenolic acids， 10 phenylpropanoids， and 15 other compounds. The sources of each component were classified， and the fragmentation patterns of phenolic acids， alkaloids， flavonoids， and phenylethanol glycosides were analyzed. Conclusion The developed method is highly sensitive， accurate， and efficient， enabling comprehensive and rapid analysis and identification of the chemical components in Yinhua Antiviral Oral Liquid. This approach provides a robust scientific basis for quality control and further research on the material basis of Yinhua Antiviral Oral Liquid.

Graphical abstract

关键词

银花抗病毒口服液 / 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱 / 成分分析 / 裂解规律

Key words

Yinhua Antiviral Oral Liquid / ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） / compositional analysis / fragmentation rules

银花抗病毒口服液是湖南省儿童医院拥有专利权的医院制剂，全方由板蓝根、金银花、黄芩、黄连、连翘、重楼、大青叶、柴胡、牛蒡子、射干和甘草11味中药材组成。本方为协定处方，是基于《温病条辨》中的银翘散并结合小儿内科临床经验积累而成，具有辛凉解表、清热解毒、利咽消肿的功效，临床上广泛用于上呼吸道感染、咽喉炎、小儿肺炎、扁桃体炎、水痘等证属风热者的治疗。以往对银花抗病毒口服液的研究主要集中在临床应用上^［1-2］，尚无药效物质基础研究的报道。质量控制研究方面，祝文兵等^［3］对其中的金银花、黄连展开薄层色谱鉴别，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）对绿原酸、黄芩苷的含量进行测定。中药复方成分复杂，其作用的发挥往往体现为多成分、多靶点的共同作用^［4-5］。银花抗病毒口服液作为中药复方制剂，其种类较多，成分复杂，通过检测其中的一种或某几种成分难以评价复杂中药的整体质量。

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）因其具有灵敏度高、分辨率高、扫描范围广^［6-7］等特点，被广泛应用于中药及复方制剂药效物质基础等的研究^［8-11］。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS对银花抗病毒口服液中的化学成分进行分析鉴定，明确其物质基础，为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 UPLC-6540 Q-TOF色谱-质谱联用仪、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）色谱柱，均购自美国Agilent科技公司；SK5200型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；S-23型高速台式离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；AUW120D型电子分析天平（日本SHIMADZU公司）。

1.2 试药

银花抗病毒口服液（湖南省儿童医院自制制剂，委托湖南新汇制药股份有限公司生产，批号220501）；甲醇（色谱级）、乙腈（质谱级），均购自德国Merck Millipore公司；蒸馏水（深圳屈臣氏蒸馏水有限公司）；甲酸铵（质谱级，美国Fisher公司）；柴胡皂苷A（批号22011101）、异绿原酸B（批号21012902）、甘草酸（批号20070203）、汉黄芩苷（批号21102107）、异绿原酸A（批号21112405）、汉黄芩素（批号21051406）、黄芩苷（批号21121404）、隐绿原酸（批号21061801）、黄芩素（批号20033102）、绿原酸（批号21032502）、马钱苷酸（批号21122804）、小檗碱（批号21110803）、异绿原酸C（批号22030303）、夏佛塔苷（批号21112406）、新绿原酸（批号20123006），质量分数均≥98.0%，均购自成都普菲德生物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）。以体积分数0.1%甲酸（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，0~10 min，5% B→15% B；10~20 min，15% B→35% B；20~30 min，35% B→55% B。流速为0.4 mL·min^-1。柱温为30 ℃。进样量为1 μL。

2.2 质谱条件

采用正负离子分析模式，离子化方式为电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI），进样分析前进行准确质量数的校正；一级质谱扫描范围为m/z 100~1 200；采用氮气为除溶剂干燥气体；毛细管温度为325 ℃；载气流速为6.8 L·min^-1；鞘气温度为350 ℃；毛细管电压为4.0 kV；一级碰撞电压为150 V；二级质谱扫描范围为m/z 50~1 000；二级碎裂电压为10、25、40 V。

2.3 溶液的制备

2.3.1 银花抗病毒口服液

取板蓝根200 g、重楼60 g、大青叶100 g、柴胡100 g、金银花100 g、牛蒡子100 g、连翘100 g、射干60 g、黄芩50 g、甘草30 g、黄连50 g加水煎煮2次，第1次3 h，第2次1.5 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.06（40 ℃）的浸膏，静置过夜，取上清液，滤过，滤液加入蔗糖200 g与羟苯乙酯0.5 g，制成1 000 mL溶液，滤过，灌封，灭菌，即得。

2.3.2 供试品溶液

取银花抗病毒口服液5 mL，以8 000 r·min^-1离心5 min，0.22 μm滤膜滤过，即得银花抗病毒口服液的供试品溶液。

2.3.3 对照品溶液

取对照品绿原酸、柴胡皂苷A、异绿原酸B、甘草酸、汉黄芩苷、异绿原酸A、汉黄芩素、黄芩苷、隐绿原酸、黄芩素、马钱苷酸、小檗碱、异绿原酸C、夏佛塔苷、新绿原酸对照品各约10 mg，精密称定，分别置于25 mL量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，静置后定容，即得对照品储备液。取小檗碱对照品储备液20 μL，其余储备液各取50 μL，混合均匀，即得混合对照品溶液。

2.4 银花抗病毒口服液主要成分的定性分析

在UPLC-Q-TOF-MS正、负离子模式下采集银花抗病毒口服液的一级、二级质谱数据，总离子流图见图1。采用安捷伦Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取（molecular feature extraction，MFE）功能，根据化合物的分子式、保留时间、加合离子及碎片离子信息，选择误差在5 ppm内的分子式与中药成分数据库（traditional Chinese medicine component database，TCM-DATA）进行初步比对，结合对照品比对和参考文献^［12-19］共鉴定出银花抗病毒口服液的85个化学成分，并对每个化学成分进行了药材来源归属。见图２、表1。

2.5 主要类别化合物的鉴定及裂解规律的分析

2.5.1 酚酸类化合物

在正、负离子模式下，共鉴定出10个酚酸类化合物，主要来源于金银花、黄连等。以化合物22为例，其准分子离子峰为m/z 353.078 6 ［M-H］^-，随后失去咖啡酰基的特征碎片离子得到m/z 191.046 8 ［M-H-C₉H₆O₃］^-的碎片离子峰，准分子离子峰丢失奎宁酸的特征碎片子可得到m/z 179.025 6 ［M-H-C₇H₁₀O₅］^-，以及二级碎片m/z 173.035 3 ［M‍-‍H‍-‍C₉H₆O₃－H₂O］‍^-‍、m/z 161.014 9 ［M-H-C₇H₁₂O₆］^-和m/z 135. 035 7 ［M-H-C₇H₁₂O₆-CO₂］^-，与对照品比对，可鉴定其为绿原酸，可能的质谱裂解途径见图3。

2.5.2 生物碱类化合物

结合二级碎片特征及文献报道，从银花抗病毒口服液中共鉴定出脱氧鸭嘴花碱酮、（R，S）-告依春、小檗碱、二氢小檗碱、表小檗碱5种生物碱，主要来源于板蓝根、黄连。生物碱类化合物多以正离子形式存在。化合物52的准分子离子峰为m/z 336.122 9 ［M+H］^＋，其产生特征碎片离子m/z 321.097 1 ［M+H-‍CH₃］^＋、m/z 320.091 9 ［M+H-‍CH_3‍-‍H］^＋和m/z 306.438 5 ［M+H-2CH₃］^＋，在二级质谱中还可观察到由m/z 306.438 5失去CO产生的碎片离子m/z 278.078 8 ［M+H-2CH₃-CO］^＋。通过与对照品比对，鉴定其为小檗碱，可能的质谱裂解途径见图4。

2.5.3 黄酮类化合物

黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素，以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物，在植物体内大多与糖结合成苷类的形式存在，也有部分以游离形式存在。黄酮类化合物在质谱中的裂解方式，主要有CO、CO₂等中性离子丢失、丢失侧链基团、糖基的断裂、C环发生RDA裂解等^［28-29］。以化合物83为例，负离子模式下分子离子峰m/z 283.050 4 ［M-H］^-，其特征碎片离子为m/z 268.026 8、m/z 240.031 4、m/z 224.034 4，其中m/z 268.026 8为准分子离子峰脱去1分子CH₃得到的碎片离子峰，继续脱去1分子CO得到m/z 240.031 4的碎片峰，而m/z 224.034 4为碎片峰m/z 268.026 8脱去COH得到的碎片离子峰。经与对照品对比，鉴定该化合物为汉黄芩素，其可能的裂解途径见图5。

2.5.4 苯乙醇苷类化合物

本研究共鉴定出6种苯乙醇苷类成分，这些化合物都表现出相似的裂解规律，主要表现为中性碎片丢失，如丢失咖啡酰基、葡萄糖、乙酰基以及水分子等峰的产生，以典型的苯乙醇苷类成分红景天苷为例，在负离子模式下，化合物16的准分子离子峰为m/z 299.103 5 ［M-H］^－峰，随后丢失1分子葡萄糖（Glc）得到m/z 137.050 5的碎片离子峰，再脱去1分子H₂O得到m/z 119.038 0的碎片峰。结合文献报道^［30］，推测该化合物为红景天苷。其可能的裂解途径见图6。

3 讨论

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技术，对银花抗病毒口服液的化学成分进行了分析鉴定。通过质谱生成的化合物信息结合二级碎片离子，同时结合对照品比对及相关参考文献鉴定了正、负离子模式下的85个化合物，其中包含了10个酚酸类化合物、20个黄酮类化合物、5个生物碱类化合物、19个萜类化合物、6个苯乙醇苷类、10个苯丙素类化合物和15个其他类化合物。总结归纳了酚酸类、黄酮类、生物碱类、苯乙醇苷类4大类化合物的裂解规律，且对每个化合物的药材来源进行了归属，其中可能归属于金银花的成分16个，大青叶2个，板蓝根5个，黄连16个，黄芩18个，重楼2个，连翘7个，射干5个，甘草12个，柴胡6个，牛蒡子9个。

银花抗病毒口服液处方由11种中药材组成，每种药材所含化学成分很多，那么该制剂的整体化学成分就更为繁多，因其整体化学成分目前无相关报道，在一定程度上限制了银花抗病毒口服液的临床应用与推广。本研究从银花抗病毒口服液中分离鉴定出85个化合物，以酚酸类、黄酮类、生物碱类、萜类、苯乙醇苷类等为主。在中药归属上主要来源于金银花（16个）以酚酸类化合物为主，如绿原酸等，金银花甘寒芳香，作为君药具有清热解毒、宣散风热之功效；黄连（16个）主要是生物碱类化合物，黄芩（18个）主要是黄酮类化合物，较典型的化合物有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素；黄连、黄芩性寒味苦，作为臣药具有清热燥湿、泻火解毒的作用；甘草（12个）主要是萜类化合物，调和诸药，性味甘平，归肺经，具有益气补中、祛痰止咳、解毒止痛的功效。

UHPLC-Q-TOF-MS技术是分析中药化学成分的有效方法，能够提高中药化合物分离和鉴定的效率，本研究初步明确了银花抗病毒口服液主要的化学成分群，为银花抗病毒口服液的质量控制和物质基础的研究提供科学依据。

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基金资助

湖南省卫生健康委科研项目(D202313058462)

湖南中医药大学“双一流”学科建设项目(22JBZ025)