高效液相色谱法同时测定强力脑清素片中紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲的含量

Determination of syringin, isofraxidin and schisandrin in Qiangli Naoqingsu Tablets by high-performance liquid chromatography

摘要

目的 建立同时测定强力脑清素片中紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲含量的高效液相色谱法。 方法 采用Phenomenex C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱：0~20 min，20% A；20~60 min，20% A→60% A；60~80 min，60% A；80~85 min，60% A→20% A；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为220 nm；进样量为5 μL。 结果 紫丁香苷、异秦皮啶、五味子醇甲分别在22.00~110.00 μg·mL^-1（R²=0.999 9）、16.74~83.70 μg·mL^－1（R²=0.999 9）、18.62~93.10 μg·mL^－1（R²=0.998 1）范围内线性关系良好，平均回收率分别为100.60%、99.49%、99.64%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.51%、0.73%、1.10%。 结论 该方法的准确度高，重复性好，可用于同时测定强力脑清素片中3种有效成分的含量，为强力脑清素片质量标准的完善提供参考。

Abstract

Objective To establish a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of syringin， isofraxidin and schisandrin in Qiangli Naoqingsu Tablets. Methods The HPLC separation was performed on a Phenomenex C₁₈ （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column eluted with the mobile phases of methanol （A）-water （B） solution in a gradient mode （0~20 min， 20% A； 20~60 min， 20% A→60% A； 60~80 min， 60% A； 80~85 min， 60% A→20% A） at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The column temperature was 30 ℃， the detection wavelength was 220 nm， and the injection volume was 5 μL. Results The linear ranges of syringin， isofraxidin and schisandrin were 22.00—110.00 μg·mL^-1 （R²=0.999 9）， 16.74—83.70 μg·mL^-1 （R²=0.999 9）， and 18.62—93.10 μg·mL^-1 （R²=0.998 1）， respectively. The average recoveries were 100.60%， 99.49% and 99.64%， and the relative standard deviation （RSD） values were 1.51%， 0.73% and 1.10%， respectively. Conclusion The established method is accurate and reproducible. It can be used for simultaneous determination of the 3 active components in Qiangli Naoqingsu Tablets， and can be used for the improvement of the quality standard of Qiangli Naoqingsu Tablets.

Graphical abstract

关键词

强力脑清素片 / 紫丁香苷 / 异秦皮啶 / 五味子醇甲 / 高效液相色谱法 / 含量测定

Key words

Qiangli Naoqingsu Tablets / syringing / isofraxidin / schisandrin / high-performance liquid chromatography / quantitative analysis

强力脑清素片是由刺五加浸膏、五味子流浸膏、鹿茸精和甘油磷酸钠组成的薄膜衣片，味微苦、酸，具有补肾健脾、养心安神的功效，主要用于治疗脾肾两虚、心神失养引起的心悸失眠、食欲不振、神疲乏力、尿频、神经衰弱等症状。其质量标准记载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十七册^‍［1］，该标准中检测方法单一，仅针对刺五加进行薄层色谱检测，缺乏准确度高的含量测定方法。相关文献报道多采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）单一测定强力脑清素片中紫丁香苷或异嗪皮啶的含量^‍［2-4］，未发现同时测定紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲3种有效成分的报道。为了更好地控制强力脑清素片的质量，保证临床用药的疗效，本研究建立同时测定强力脑清素片中紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲含量的HPLC方法，并对其进行方法学考察，以期为提升强力脑清素片的质量标准提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BP211D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；ME204型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品：紫丁香苷（质量分数为95.2%，批号111574-201605）、异秦皮啶（质量分数为99.5%，批号110837-201206），五味子醇甲（质量分数为99.9%，批号110857-201714），均购自中国食品药品检定研究院；强力脑清素片（批号220304，亚宝药业集团股份有限公司）；甲醇（色谱级，德国Merck公司）；超纯水（实验室自制）。

2 方法

2.1 色谱条件

采用Phenomenex C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱：0~20 min，20% A；20~60 min，20% A→60% A；60~80 min，60% A；80~85 min，60% A→20% A；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为220 nm；进样量为5 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别取紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲对照品适量，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成紫丁香苷、异秦皮啶、五味子醇甲质量浓度分别为1.100、0.837、0.931 mg·mL^-1的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品20片，除去薄膜衣，研细，取粉末约2.0 g，精密称定，加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率60 kHz） 30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3 结果

3.1 专属性考察

取上述制备的对照品溶液和供试品溶液适量，按照2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果表明，紫丁香苷的保留时间约为18.5 min，异嗪皮啶的保留时间约为34.7 min，五味子醇甲的保留时间约为72.1 min，与混合对照品溶液中响应色谱峰出峰时间一致。在本研究条件下，各成分间的分离度良好，理论塔板数按紫丁香苷计算不低于4 000。

3.2 线性关系考察

精密吸取2.2项下制备的混合对照品储备液1、2、3、4、5 mL，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得5个系列质量浓度的混合对照品溶液。按照2.1项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），分别进行线性回归，结果见表1。

3.3 稳定性实验

取同一批样品，量取2.3项下制备的供试品溶液适量，在室温下放置0、6、9、12、15、18 h后，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。计算得紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为2.67%、1.50%、0.52%（n=6），表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

3.4 精密度实验

精密吸取2.2项下制备的混合对照品储备液3 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算得紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲峰面积的RSD分别为0.49%、0.58%、0.24%（n=6），表明仪器的精密度良好。

3.5 重复性实验

取同一批样品，精密吸取2.3项下制备的供试品溶液6份，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。测得紫丁香苷、异秦皮啶和五味子醇甲峰面积的RSD分别为1.29%、2.65%、0.67%（n=6），表明该方法的重复性良好。

3.6 加样回收实验

取样品粉末约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，平行6份，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算平均回收率。结果显示，紫丁香苷、异秦皮啶、五味子醇甲的平均回收率分别为100.60%、99.49%、99.64%（n=6）。见表2。

3.7 样品含量的测定

取强力脑清素片样品约2.0 g，精密称定，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，计算含量。结果显示，紫丁香苷、含异秦皮啶、五味子醇甲的含量分别为3.855 1、0.756 4、0.140 9 mg·g^-1。

4 讨论

4.1 提取方式的选择

本文采用超声提取法对强力脑清素片中的有效成分进行提取，考察了不同超声时间、不同溶剂、不同浓度、不同料液比对强力脑清素片中的3种有效成分含量测定的影响，结果表明，25倍量甲醇超声（功率500 W，频率60 kHz）提取30 min，提取效果最好。

4.2 检测波长的选择

经查阅文献^‍［2-8］发现，异秦皮啶在波长225 nm和344 nm处具有最大吸收，紫丁香苷的最大吸收在220、265 nm，五味子醇甲的最大吸收为250 nm^‍［9］，结合DAD检测器的特性，结果发现，五味子醇甲的最大吸收波长为216 nm，考虑到3个成分同时检出，因此选择220 nm作为检测波长，在此波长下进行测定杂质干扰少，灵敏度高，分离度好。

4.3 流动相的选择

考察了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液等不同比例的流动相进行梯度洗脱，结果表明，采用甲醇-水溶液梯度洗脱的色谱峰，基线平直，分离度均大于1.5，且峰形对称，无拖尾等现象。

本研究参考文献报道中紫丁香苷和异嗪皮啶的检测方法^{‍［8，10-11］}，结合《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十七册执行标准^‍［1］，建立了同时测定强力脑清素片中紫丁香苷、含异秦皮啶、五味子醇甲含量的高效液相色谱法，并考察了方法的线性关系、重复性和稳定性，该方法准确可靠，操作简单，适用于强力脑清素片的质量控制，可以为该品种的质量标准提升提供参考。

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