高效液相色谱法测定伊曲茶碱原料药中的有关物质

Determination of related substances in istradefylline active pharmaceutical ingredients by high-performance liquid chromatography

摘要

目的 建立测定伊曲茶碱原料药中有关物质的高效液相色谱法。 方法 采用YMC-Pack ODS-A C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为pH 3.0磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱；检测波长为230 nm；流速为1.0 mL·min^-1；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。 结果 杂质A、B、C、D、E的线性范围分别为1.17~11.71、1.27~12.68、1.19~11.9、1.14~11.39、1.16~11.65 ng；定量限分别为1.17、1.27、1.19、1.14、1.16 ng；检测限分别为0.47、0.51、0.48、0.46、0.46 ng；加样回收率范围为91.8%~104.9%。 结论 该方法的灵敏度高，准确度高，重复性好，可用于伊曲茶碱原料药中有关物质的检测。

Abstract

Objective To establish a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of related substances in istradefylline active pharmaceutical ingredients （APIs）. Methods The HPLC analysis was performed using a YMC-Pack ODS-A C₁₈ column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）. Gradient elution was employed， with mobile phase A being a pH 3.0 phosphate buffer solution and mobile phase B being acetonitrile. The detection wavelength was set at 230 nm， with a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The column temperature was maintained at 40 ℃， and the injection volume was 10 μL. Results The linear ranges for impurities A， B， C， D and E were 1.17—11.71， 1.27—12.68， 1.1—11.9， 1.14—11.39 and 1.16—11.65 ng， respectively. The limits of quantitation （LOQ） were 1.17， 1.27， 1.19， 1.14 and 1.16 ng， while the limits of detection （LOD） were 0.47， 0.51， 0.48， 0.46 and 0.46 ng， respectively. The recovery rates for impurity samples were all within the range of 91.8% to 104.9%. Conclusion The developed HPLC method is sensitive， accurate， and reproducible， making it suitable for the determination of related substances in istradefylline APIs.

Graphical abstract

关键词

伊曲茶碱 / 原料药 / 有关物质 / 杂质 / 高效液相色谱法

Key words

istradefylline / active pharmaceutical ingredients / related substances / impurities / high-performance liquid chromatography

伊曲茶碱（istradefylline）是首个腺苷A_2A受体拮抗剂，可通过阻断纹状体和苍白球的受体，发挥治疗帕金森病（Parkinson's disease，PD）的作用。伊曲茶碱由日本协和发酵工业株式会社研发，于2013年5月在日本获得批准上市，用于改善长期使用经典抗帕金森药物（如左旋多巴、卡比多巴等）治疗引起的运动障碍^‍［1-7］。2019年8月美国食品药品管理局（food and drug administration， FDA）批准伊曲茶碱上市，目前尚未在中国上市，且其质量标准未见相关报道。本研究通过建立伊曲茶碱原料药中有关物质的测定方法，为制定伊曲茶碱质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo U3000型液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），配备Waters e2695 2998型二极管阵列检测器（photo-diode array，PDA，美国Waters公司）；ME204E型电子天平、S210K型pH计，均购自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 试药

伊曲茶碱原料药（批号：158190801、158210401、158210402、158210403，连云港贵科药业有限公司），伊曲茶碱对照品（质量分数为99.5%，批号13HW1312-I+6+3R）、杂质A（质量分数为92.7%，批号13HW1312-A+1R）、杂质B（质量分数为99.5%，批号13HW1312-V+4+3R）、杂质C（质量分数为93.0%，批号13HW1312-C+1R）、杂质D（质量分数为89.5%，批号13HW1312-D+1R）和杂质E（质量分数为90.9%，批号13HW1312-E+3R），均购自南京华威医药科技有限公司；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；磷酸（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用YMC-Pack ODS-A C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为pH 3.0磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.36 g，加水1 000 mL使溶解，用磷酸调节pH值至 3.0），B为乙腈，梯度洗脱：0~20 min， 60% A~40% A；20~40 min，40% A；40~40.1 min， 40% A~60% A；40.1~50 min，60% A；检测波长为230 nm；流速为1.0 mL·min^-1；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 溶剂

将流动相A与流动相B按照20∶80的比例制备成溶剂，用于后续溶液的制备。

2.2.2 伊曲茶碱对照品溶液

取伊曲茶碱对照品约25 mg，精密称定，置于50 mL棕色量瓶中，加溶剂超声溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.5 mg·mL^-1的伊曲茶碱对照品溶液。

2.2.3 伊曲茶碱供试品溶液

取伊曲茶碱原料药约25 mg，精密称定，置于50 mL棕色量瓶中，加溶剂超声溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.5 mg·mL^-1的伊曲茶碱供试品溶液。

2.2.4 加杂供试品溶液

取伊曲茶碱（批号158190801）原料药适量，分别按报告限浓度（0.050%）、限度（0.150%）、1.5倍限度（0.225%）的量加入各杂质，加溶剂溶解并稀释制成每1 mL中约含伊曲茶碱0.5 mg的溶液。

2.2.5 自身对照溶液

精密量取供试品溶液1.0 mL，置于100 mL棕色量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为原料药自身对照溶液。

2.2.6 杂质对照品溶液

取杂质A、B、C、D、E对照品各适量，精密称定，分别置于10 mL棕色量瓶中，分别加溶剂溶解并制成每1 mL中含0.5 mg杂质的对照品储备液；取各杂质对照品储备液溶液适量，加溶剂稀释，制成每1 mL中约含0.75 μg混合杂质的对照品溶液。

2.2.7 系统适用性溶液

取伊曲茶碱对照品适量，精密称定，加入各杂质对照品溶液适量，加溶剂溶解并稀释，制成每1 mL中约含伊曲茶碱0.5 mg和各杂质0.5 μg的溶液，作为系统适用性溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验

分别取溶剂、供试品溶液、混合杂质对照品溶液、系统适用性溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，见图1。结果显示，空白溶剂不干扰本品有关物质的检测，各杂质间分离度均符合要求，杂质理论板数均大于5 000。

2.3.2 线性关系和校正因子实验

精密量取2.2.6项下制备的杂质对照品溶液适量，加溶剂稀释成质量浓度分别为0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250 μg·mL^-1的杂质梯度质量浓度线性溶液。精密量取2.2.2项下伊曲茶碱对照品溶液适量，加溶剂稀释成质量浓度分别为0.125、0.250、0.500、0.750、2.500、5.000、6.000 μg·mL^-1的伊曲茶碱梯度质量浓度线性溶液。按照2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以伊曲茶碱与各杂质的质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x）、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，根据杂质校正因子=主成分线性斜率/杂质线性斜率，计算各杂质的校正因子。杂质D的校正因子为0.76，计算时乘以校正因子0.76，其余杂质计算时校正因子均不计。见表1。

2.3.3 检测限与定量限

取2.2.2项下制备的伊曲茶碱对照品溶液和2.2.6项下制备的杂质对照品溶液，用溶剂逐级稀释，按照2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以信噪比为10∶1计算定量限，以信噪比为3∶1计算检测限。杂质A、B、C、D、E和伊曲茶碱的定量限分别为1.17、1.27、1.19、1.14、1.16、1.25 ng；检测限分别为0.47、0.51、0.48、0.46、0.46、0.50 ng。

2.3.4 精密度实验

取2.2.2项下制备的伊曲茶碱对照品溶液和2.2.6项下制备的杂质对照品溶液，用溶剂逐级稀释，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算各物质峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。杂质A、B、C、D、E和伊曲茶碱的RSD分别为0.40%、0.57%、1.8%、0.45%、1.6%、0.73%，表明仪器的精密度良好。

2.3.5 重复性实验

取2.2项下制备的伊曲茶碱供试品溶液、加杂供试品溶液及杂质对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，6份伊曲茶碱供试品溶液均未检出杂质。6份加杂供试品溶液杂质A、B、C、D、E的平均回收率分别为100.3%、101.0%、102.8%、100.6%、99.5%，RSD分别为0.88%、0.66%、1.40%、0.73%、2.0%，各杂质的平均回收率为96.9%~104.6%，RSD均<5%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.3.6 稳定性实验

取2.2.2项下制备的伊曲茶碱对照品溶液和2.2.6项下制备的杂质对照品溶液，于常温放置0、4、8、16、24、48 h后，按照2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，计算峰面积RSD。结果显示，供试品溶液放置48 h均未检出杂质，稳定性良好；杂质对照品溶液在常温放置48 h内，与0 h比较，各时间点的峰面积变化绝对值最大为1.9%，表明杂质对照品溶液常温放置48 h内稳定性良好。

2.3.7 回收率实验

取2.2项下制备的杂质对照品溶液和加杂供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，采用加校正因子对照品外标法计算测得量和回收率。各杂质高、中、低3种质量浓度下回收率均在91.8%~104.9%范围内，回收率的RSD最大为4.1%<5%（n=9），表明该方法的准确性良好。结果见表2。

2.3.8 耐用性实验

具体考察流动相A初始比例（60%±1%）、波长（230±2） nm、柱温（40±2） ℃、流速（1.0±0.1） mL·min^-1、不同色谱柱等；结果显示，在不同色谱条件下主成分理论塔板数均大于5 000；分离度均大于1.5；供试品溶液均无杂质检出；加杂供试品溶液各杂质检出量与原条件比较，变化范围均小于0.075%，表明该方法耐用性良好。

2.3.9 样品测定

取伊曲茶碱原料药适量，分别按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算有关物质，色谱图中如有其他未知杂质，采用自身对照法进行测定，结果显示，多批样品的检测结果均符合规定，见表5。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

在实验过程中，待检测杂质与伊曲茶碱在波长230 nm处有较大吸收，个别杂质在波长230 nm处吸收较小，但检测浓度下可满足灵敏度要求。综合考虑，最终选定230 nm作为检测波长。

3.2 稀释剂的选择和样品配制

采用流动相A-B（20∶80）溶解样品，样品溶解良好，且由于和流动相体系与比例较为接近，故无溶剂效应，对不同批次的样品、在不同仪器间的耐用性均表现良好，故最终选定流动相A-B（20∶80）作为稀释剂。在实验过程中发现，样品对光较为敏感，但由于样品在稀释剂中溶解较快，整个过程采用棕色量瓶即可有效控制配置过程中的降解，故最终要求样品配置过程中采用棕色量瓶。

3.3 强制降解实验

样品在存储过程中会受到多种因素的影响，包括酸、碱、氧化、光、热等，因此对样品溶液和固体进行各种破坏因素影响的考察以验证方法的专属性，通过强制降解实验可知，本品的溶液状态对光特别敏感，另外于碱性环境中加热一段时间亦能降解生成少量杂质，其他条件均较为稳定，各破坏条件下峰纯度阈值均大于纯度角度，主峰中未包含不能分离的杂质及降解新增杂质；各条件主峰占比均大于90%，主峰相邻杂质峰与主峰分离度均大于1.5，溶剂对杂质检出无干扰，表明该色谱条件适合本品有关物质的检测，也提示样品溶液在配制过程中应避光操作。

3.4 限度的确定

伊曲茶碱的合成包括四步反应和一步精制，合成过程中可能存在的杂质包括有机杂质、有机潜在杂质、残留溶剂、无机杂质以及其他杂质，通过分析判断各杂质的来源及各中间体的检测结果，把杂质A、B、C、D、E作为控制项目列入质量标准中；其中杂质A、B、C、E为合成过程中的工艺杂质（工艺副产物或中间体残留），杂质D为降解产物，均已明确结构，作为已知杂质控制，根据伊曲茶碱片（规格为20 mg）的用量说明，本品最大日剂量不超过2 g，依据相关指导原则对原料药杂质的要求，规定其限度均不得超过0.15%，本实验多批次样品检测均符合杂质限度要求^{‍［8-12］}。

本实验建立伊曲茶碱原料药中有关物质的测定方法，将建立的方法应用于实际样品检测，结果准确、可靠，方法通用性好，能够满足质量控制的要求，为伊曲茶碱原料药的质量标准制定提供依据及参考。

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