Box-Behnken设计-响应面法优化新疆赤芍的酒炙工艺

Optimization of the wine-processing technology of Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan Radix based on Box-Behnken design-response surface methodology

摘要

目的 通过Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）优选酒炙新疆赤芍的最佳工艺。 方法 在单因素实验的基础上，以黄酒用量、炒制温度、炒制时间为自变量，以酒炙新疆赤芍芍药苷含量为因变量，用BBD-RSM设计不同水平实验，优化酒炙工艺。 结果 最佳酒炙工艺：黄酒用量为15%（即每100 g新疆赤芍饮片加黄酒15 g）、炒制温度为110 ℃、炒制时间为20 min，此时新疆赤芍中有效成分芍药苷的提取率为0.33%。 结论 BBD-RSM优化所得新疆赤芍的酒炙工艺稳定、可行，可在实际生产中应用。

Abstract

Objective To optimize the processing of Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan Radix with rice wine. Methods The Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan Radix was processed under different processing conditions. By taking the content of paeoniflorin as an indicator， the Box-Behnken design-response surface methodology （BBD-RSM） was used to investigate the effects of the amount of rice wine， stir-frying temperature and stir-frying time on the quality of decoction pieces of Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan Radix. Results Optimal processing parameters were determined as 15% amount of rice wine， 110 ℃ for stir-frying temperature and 20 minutes for stir-frying time. Under the conditions， the extraction rate of paeoniflorin reached the highest （0.33%）. Conclusion The optimized processing is stable and feasible with good reproducibility. Through the research on the processing of Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan Radix with rice wine， this paper lays a foundation for further research on the processing of Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan Radix.

Graphical abstract

关键词

新疆赤芍 / 酒炙 / 芍药苷 / Box-Behnken设计-响应面法

Key words

Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan / processing with rice wine / paeoniflorin / Box-Behnken design-response surface methodology （BBD-RSM）

新疆赤芍为毛茛科植物新疆芍药Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan的干燥根。药性为二级干热，具有生干生热、袪寒燥湿、补脑补神、强筋补肌、活血通滞、通经通尿等功效，用于治疗湿寒或异常黏液质性脑部疾病^［1］。新疆赤芍是新疆的道地药材，应用历史悠久，其记载可追溯至一千多年前。早在10世纪就有使用新疆赤芍酒煎内服的记载^［2］。研究发现，新疆赤芍的主要活性成分为芍药苷，具有保肝、抗肿瘤、抗炎、镇痛、保护神经、调节免疫等药理作用^［3-6］。并且不同的炮制方法能够影响芍药苷的含量^［7］。但是文献报道的炮制方法没有对炮制工艺的具体参数进行考察，如辅料用量、加热时间、加热温度等，仅以炮制品表面颜色判断炮制终点，无法有效控制饮片的质量。作为新疆道地药材，目前还没有新疆赤芍的炮制标准和炮制规范。为了更好地发挥新疆赤芍的治疗作用，扩大临床应用范围，本研究采用传统炮制技术结合现代分析技术，研究新疆赤芍酒炙后有效成分变化的规律，确定最佳炮制工艺，为制定新疆赤芍饮片的炮制标准奠定基础。

由于酒炙新疆赤芍的炮制工艺涉及黄酒用量、炒制时间、炒制温度等因素的交互作用，而Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）适用于多因素、多水平的工艺考察实验，其可通过指标量化和非线性拟合建立直观的数学模型，预测科学客观、准确性高，因此本研究采用BBD-RSM法优化新疆赤芍的酒炙工艺，以期为该炮制品的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MC-SCL2207型美的变频灶（广东美的生活电器制造有限公司）；AS852B型非接触式红外测温仪（东莞万创电子制品有限公司）；500A型多功能粉碎机（上海赛耐机械进出口有限公司）；Metter AE163型电子分析天平［丹佛仪器（北京）有限公司］；SK250LHC型智能超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；HHS-4S型电子恒温水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KH-111型循环水式多用真空泵（上海科恒实业发展有限公司）；Waters2707型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；UPT-I-5T型优普超纯水仪（成都纯化科技有限公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号111562-201613，中国食品药品检定研究院）；黄酒（批号20230911D，酒精度为16.5%vol，中国绍兴黄酒集团有限公司）；甲醇（色谱纯，赛墨飞世尔科技公司）。

新疆赤芍由乌鲁木齐市中医医院提供，经新疆维吾尔自治区中医医院李永和主任中药师鉴定为毛茛科植物新疆芍药Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan的干燥根。

2 方法与结果

2.1 新疆赤芍酒炙品的制备

按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）四部炮制通则中的规定，新疆赤芍饮片加黄酒拌匀（每1 kg新疆赤芍饮片，用100~300 g黄酒），稍闷，待黄酒被吸尽后，置于炒制容器中，用文火加热，炒至微黄色，取出放凉，筛去碎屑。新疆赤芍酒炙品粉碎成粗粉，全部过2号筛，用于后续实验。

2.2 芍药苷含量的测定

新疆赤芍中含有芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、挥发油、儿茶素、丹皮酚、没食子酸等活性成分，其中芍药苷的含量较高。同时，芍药苷也是2010年版《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》新疆赤芍项下含量测定的指标性成分。因此，本研究以芍药苷含量为测定指标。

2.2.1 色谱条件

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），使用Symmetry C₁₈柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；流动相为甲醇-水（26∶74）；进样量为10 μL；检测波长为230 nm；流速为1.0 mg·mL^-1。

2.2.2 对照品溶液的制备

取芍药苷对照品约0.2 mg，精密称定，加体积分数80%甲醇溶液，经0.32 μm滤膜滤过，制备成每1 mL含0.02 mg的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取2.1项下制备的新疆赤芍炮制品粗粉约0.2 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入体积分数80%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声处理30 min（功率为250 W，频率为40 kHz），放冷，再称定质量，用体积分数80%甲醇补足减失的质量，缓慢摇匀，滤过，以1 500 r·s^-1离心10 min，二次过滤，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

以体积分数80%甲醇作为阴性对照溶液。

2.2.5 专属性实验

吸取上述对照品溶液、酒炙新疆赤芍供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。由图1可见，在该色谱条件下，理论塔板数不得少于2 000，芍药苷与其他成分的分离度均>1.5，阴性对照无干扰，表明该方法具有良好的专属性。

2.2.6 线性关系考察

分别量取2.2.2项下芍药苷对照品溶液适量，用体积分数80%甲醇稀释为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.30 mg·mL^-1系列质量浓度的对照品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（y），以对照品溶液质量浓度（mg·mL^-1）为横坐标（x），进行线性回归。得到芍药苷的回归方程为y=11 349 203.280 3x-148 884.288 3（r=0.999 8），在质量浓度0.04~0.30 mg·mL^-1范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度实验

精密吸取2.2.2项下芍药苷对照品溶液，按照2.2.1项下色谱条件连续进样6次，进样量为10 μL，记录峰面积。计算得芍药苷的峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.39%，表明仪器的精密度良好。

2.2.8 稳定性实验

精密吸取2.2.3项下制备的新疆赤芍炮制品溶液，按照2.2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、6、24、48 h进样测定，进样量均为10 μL，记录峰面积。计算得芍药苷峰面积的RSD值为0.85%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性实验

取新疆赤芍炮制品饮片6份，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进样检测。计算得芍药苷含量的RSD值为1.14%，表明该方法的重复性良好。

2.2.10 加样回收实验

称取已知含量的新疆赤芍炮制品6份，分别加入一定量的芍药苷对照品溶液，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样检测，计算平均加样回收率。计算得芍药苷平均回收率为102.0%，RSD值为1.2%，表明该方法的回收率良好。见表1。

2.3 新疆赤芍炮制工艺单因素实验

2.3.1 黄酒用量

考察黄酒用量对芍药苷含量的影响，取新疆赤芍饮片5份，每份100 g，加10%、15%、20%、25%、30%黄酒，于120 ℃下炒制15 min，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样检测，计算芍药苷的含量。结果表明，辅料用量对酒炙新疆赤芍芍药苷含量的影响较大，黄酒用量为15%时芍药苷含量最高。因此黄酒用量选择10%、15%、20%作为后续实验因素水平。见图2。

2.3.2 炒制温度

考察炒制温度对芍药苷含量的影响，取新疆赤芍饮片5份，每份100 g，分别于不同温度（100、120、140、160、180 ℃）下炒制15 min，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样检测，计算芍药苷的含量。结果表明，炒制温度对酒炙新疆赤芍芍药苷的含量有显著影响，在180 ℃时达到峰值，但炒制温度达到180 ℃时，酒炙新疆赤芍饮片表面已经焦化。因此，炒制温度选择100、120、140 ℃作为后续实验因素水平。见图3。

2.3.3 炒制时间

考察炒制时间对芍药苷含量的影响，取新疆赤芍饮片5份，每份100 g，分别于120 ℃下炒制不同时间（10、15、20、25、30 min），按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样检测，计算芍药苷的含量。结果表明，炒制时间对酒炙新疆赤芍芍药苷的含量有影响，炒制10 min时芍药苷含量较高，但此时炮制品表面颜色较淡。因此，炒制时间选择15、20、25 min作为后续实验因素水平。见图4。

2.4 BBD-RSM优化酒新疆赤芍炮制工艺

2.4.1 RSM实验设计

在单因素实验结果的基础上，选择黄酒用量（A）、炒制温度（B）、炒制时间（C）为因素，以酒炙新疆赤芍芍药苷含量（Y）为响应值，建立3因素3水平的响应面实验，优化新疆赤芍酒炙工艺。实验因素与水平见表2，实验设计与结果见表3。

2.4.2 模型拟合与统计分析

使用Design-Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行多元回归拟合，以酒炙新疆赤芍芍药苷含量（Y）为响应值，以黄酒用量（A）、炒制温度（B）、炒制时间（C）为自变量，进行回归分析。得到酒炙新疆赤芍芍药苷含量（Y）的回归方程：Y=-1.313+0.042 9×A+0.004 825×B+0.109 2×C-2.840 31×10^－18×AB-0.001×AC-7.915 59×10^－20×BC-0.000 78×A²-0.000 024×B²-0.002 38×C²（R²=0.965 7）。建立的回归模型F=21.90，P=0.000 3（<0.05），表明回归模型拟合良好，具有统计学意义。F失拟项=0.19，P=0.901 3（>0.05），表明该模型失拟项不显著，实验中未知因素对实验干扰小。其中，加热温度P值为0.002 6（<0.05），具有显著性；AC组，即辅料用量与加热时间的P值为0.002 4（<0.05），表明在酒炙新疆赤芍的炮制过程中，辅料用量与加热时间的交互作用较为显著。

在响应面模型适配度指标检验中，回归方程的决定系数R²=0.965 7，表明该模型能够准确反映各个因素对响应值的影响；校正系数Adjusted R²=0.921 6，表明该模型可以解释92.16%的工艺对响应值大小的影响；预测系数Predicted R²=0.886 0，Adjusted R²与Predicted R²的差值小于0.2；模型变异系数为3.83%（<10%），表明该模型较为稳定；信噪比为13.432 0（>4），表明该模型的精密度较高，可以反映实验结果。见表4。

2.4.3 响应面法分析交互作用

为进一步研究相关变量的交互作用，根据回归分析结果做相应的等高线图及响应曲面图，见图5。等高线和三维空间曲面图直观地反映2个变量交互作用的程度，响应面曲线越陡、等高线越趋向椭圆，则表明交互作用越强。由图5可见，在该炮制工艺中辅料用量与加热时间的交互作用较为显著。

2.4.4 最优制备工艺及验证实验

基于BBD-RSM得出的酒炙新疆赤芍饮片的最佳工艺为辅料用量14.763%、炒制温度108.890 ℃、炒制时间20.169 min，根据实际情况调整为辅料用量15%、炒制温度110 ℃、炒制时间20 min。在此条件下进行3次平行实验，测得芍药苷的含量为0.33%，与理论预测值0.33%相吻合。见表5。

3 讨论

3.1 新疆赤芍炮制品的制备和质量控制

新疆赤芍主产于新疆北部阿尔泰山区，资源丰富，是新疆的道地药材，也是《新疆维吾尔自治区中药民族药资源保护与产业发展规划》中提到的“要扩大人工规范化种植范围和规模”的药材之一。本文根据《中国药典》（2020版）中的要求，选用黄酒作为辅料。在炒制过程中，由于饮片较薄，在180 ℃时容易焦化；在120 ℃时炒制5 min时饮片颜色较浅，不够干燥。在后期的实验中，应该针对新疆赤芍饮片的片型加以考察。新疆赤芍在不同炮制方法和炮制条件炮制后，芍药苷含量亦有较大区别。同时，新疆赤芍炮制品中的其他成分如芍药内酯苷、儿茶素、丹皮酚、没食子酸等活性成分，经炒制后含量也会发生变化。因此，后续研究将建立同时检测多种活性成分的方法，对新疆赤芍炮制品工艺进行全面的质量控制。

3.2 实验条件的优化

考察了不同流动相对色谱峰的影响，如以甲醇-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾（38∶62）为流动相时，出峰太早，且有杂峰干扰；以乙腈-体积分数0.1%磷酸（14∶86）为流动相时，出峰时间适宜，但峰面积太大，含有杂峰；在不断调整流动相比例后，采用甲醇-水（26∶74）为流动相，芍药苷的峰形和分离度均能达到要求。柱温为20 ℃时，供试品溶液容易析出结晶，堵塞色谱柱；35 ℃时，前部分时间出峰过于紧凑，影响目标峰的分离。最终选择柱温为30 ℃。

近些年，国内学者将Box-Behnken 响应面法广泛应用于药学研究领域^［8-11］。该方法具有实验次数少、精密度高、预测性好、科学可行的优点。是解决多变量优化问题的一种有效方法。本研究优化了新疆赤芍的酒炙工艺，得到了酒炙新疆赤芍的最佳工艺：黄酒用量为15%、炒制温度为110 ℃、炒制时间为20 min。优化所得的炮制工艺稳定、可行，可用于酒炙新疆赤芍的炮制。

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基金资助

乌鲁木齐市卫生健康委员会科技计划项目(202132)

中央本级重大增减支项目(2060302)