益胃膏制备工艺及质量标准的研究

Study on the preparation process and quality standard of Yiwei Paste

摘要

目的 优化益胃膏的制备工艺，并建立可靠的质量控制方法。 方法 以盐酸小檗碱含量和浸膏得率为指标，通过正交实验设计优化提取工艺，并考察浓缩和成型工艺；采用薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）对君药黄芪、苦参进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定益胃膏中盐酸小檗碱的含量。 结果 优化后的制备工艺为加水煎煮2次，分别加8倍水和6倍水，每次1 h，合并煎液，过滤，取上清液浓缩至相对密度为1.18~1.33（80~90 ℃）的浸膏，加入炼糖和炼蜜混匀，浓缩至相对密度为1.38，即得益胃膏。TLC斑点清晰，分离度良好。HPLC结果显示盐酸小檗碱的质量浓度在0.4~8.0 μg·mL^-1范围内线性关系良好，平均回收率为98.87%，平均含量为0.484 mg·mL^-1。 结论 优化的制备工艺科学合理、稳定可行，质量标准有效可控，可用于益胃膏的质量控制。

Abstract

Objective To optimize the preparation process of Yiwei Paste and establish a reliable quality control method. Methods By using the content of berberine hydrochloride and the yield of the extract as indicators， the extraction process was optimized through orthogonal experimental design. The concentration and shaping processes were also examined. Thin-layer chromatography （TLC） was employed for qualitative identification of the principal medicinal materials， Astragalus membranaceus and Sophora flavescens. High-performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the content of berberine hydrochloride in Yiwei Paste. Results The optimized preparation process involved decocting with water twice， adding 8 times and 6 times the volume of water respectively， for 1 hour each time. The combined decoctions were filtered， and the supernatant was concentrated to a relative density of 1.18-1.33 to obtain the extract. The extract was mixed with refined sugar and honey， and concentrated to a relative density of 1.38. TLC spots were clear with good separation. HPLC results showed that the concentration of berberine hydrochloride was linearly related to the peak area within the range of 0.4-8.0 μg·mL^-¹， with an average recovery rate of 98.87% and an average content of 0.484 mg·mL^-¹. Conclusion The optimized preparation process is scientific， rational， and feasible. The established quality standards are effective and controllable， and can be used for the quality control of Yiwei Paste.

Graphical abstract

关键词

益胃膏 / 提取工艺 / 盐酸小檗碱 / 质量标准

Key words

Yiwei Paste / extraction process / berberine hydrochloride / quality standard

近年来，消化不良、消化性溃疡、慢性胃炎等胃病的发病率逐渐升高，严重降低患者的生活质量。目前，西医主要使用抗菌药、消炎药、抑酸药等进行对症治疗，但无法根治且病情容易反复。中医药在治疗恶心、呕吐、胃痛等胃病常见临床症状方面具有独特的优势。

益胃膏为湖北省某医院的院内经验方，以半夏泻心汤加四君子汤为基方^［1-2］，经消化科数年来临床经验总结得出。处方中含有黄芪、苦参、黄连、茯苓、炒白术、法半夏、蒲公英、黄芩、芡实、补骨脂、砂仁、鸡内金、玉竹、厚朴、大枣、甘草等16味中药材，具有健脾和胃、疏肝理气等功效，能有效改善上腹不适钝痛、食欲不振及恶心泛酸等症状。膏方作为中药传统方剂，药味较多，组方复杂，但药效平和滋补，在治疗慢性虚损性疾病上效果显著，且无明显毒性和不良反应^［3］。本研究旨在优化益胃膏的制备工艺，建立科学、合理的质量标准，确保药效可控，为该制剂的研发提供支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CY-1000L型纯水制备系统（上海创洋水处理设备股份有限公司）；FA1004型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；LC-20ATVP型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KX-2013QT型超声仪（北京科玺科技有限公司）；F15097型提取浓缩器（武汉制药机械厂）。

1.2 试药

对照品：盐酸小檗碱（质量分数≥98%，批号110713-202216），苦参碱（质量分数≥98%，批号110805-202010），黄芪甲苷（质量分数≥98%，批号110781-202219），均购自中国食品药品检定研究院；正丁醇、甲醇、氢氧化钠、三氯甲烷、磷酸二氢钾、乙酸乙酯、浓氨试液、乙醇、硫酸、磷酸、苯、碘化铋钾均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯，德国SIMARK公司）；黄芪对照药材（批号220501，湖北道地药材科技有限公司），经武汉科技大学医学院刘嵩博士鉴定为《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）收载的品种。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱含量的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为COSMOSIL 5C₁₈-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（磷酸调pH为4.0）（30∶70）为流动相，流速为1.0 mL·min^-1；进样量为10 μL；检测波长为345 nm。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为4.00 μg·mL^-1的对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液

取益胃膏样品约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100︰1）的混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.1.2.3 阴性样品溶液

去除处方中的黄连药材，按照制备工艺制得阴性样品，按照2.1.2.2项下方法制得阴性样品溶液。

2.1.3 专属性考察

取上述制备的对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。结果显示，供试品中盐酸小檗碱色谱峰的位置与对照品一致，且阴性溶液无干扰，表明该方法的专属性良好。

2.1.4 线性关系的考察

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含8 μg的对照品储备液。分别精密量取储备液0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到系列质量浓度的对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，求得回归方程为y=26 680x+2 671.8（r=0.998 7）。结果显示，盐酸小檗碱对照品质量浓度在0.4~8.0 μg·mL^-1范围内时与其峰面积线性关系良好。

2.1.5 精密度实验

取按照2.1.2.2项下方法制备的供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，益胃膏样品中盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.22%，表明精密度良好。

2.1.6 重复性实验

取同一批益胃膏样品6份，按照2.1.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。计算得样品中盐酸小檗碱含量的RSD为0.45%，表明该方法的重复性良好。

2.1.7 稳定性实验

取2.1.2.2项下方法制备的供试品溶液，分别在0、1、4、8、16、24 h按照2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.51%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收率实验

取已知成分含量的益胃膏样品6份，每份约0.5 g，精密称定，按1∶1的比例加入对照品，按照2.1.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。计算得样品的平均加样回收率为98.87%，RSD为0.78%，表明该方法回收率良好。

2.1.9 3批样品的含量测定

分别取中试扩大生产的3批样品约1.0 g，精密称定，按照2.1.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样测定。计算得3批样品中盐酸小檗碱的含量分别为0.481、0.483、0.478 mg·mL^-1，平均含量为0.484 mg·mL^-1。

2.2 浸膏得率的测定

取药材共122 g，以8倍量水加热1 h，提取2次，合并2次滤液浓缩成稠膏，置于真空干燥箱中干燥，称定质量，计算浸膏得率。浸膏得率=（浸膏质量/药材质量）×100%

2.3 单因素实验

2.3.1 加水倍数

按处方比例的1/5称取药材饮片，先加入2倍量水，浸泡1 h，分别加入4、6、8、10倍量水，按照2.1.1项下色谱条件进样测定，并按照2.2项下方法测定浸膏得率。结果显示，当加水量增加时，盐酸小檗碱的含量和浸膏得率也随之增加，但当加水倍数大于8倍时增加幅度较小，故选择4、6、8倍量水进一步考察。见表1。

2.3.2 提取时间

提取时间设定为0.5、1、2、3 h，其余同2.3.1项，结果显示，提取时间增加时，盐酸小檗碱的含量和浸膏得率也升高，故选择1、2、3 h做进一步考察。见表2。

2.3.3 提取次数

提取次数设定为1、2、3、4次，其余同2.3.1项，结果显示，提取次数增加时，盐酸小檗碱的含量和浸膏得率先大幅升高，后续变化较小，为节约能耗，选择1、2、3次做进一步考察。见表3。

2.4 正交实验优化提取工艺

采用L₉（3⁴）正交实验设计，以加水倍数（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，以盐酸小檗碱含量和浸膏得率为评价指标，其权重系数分别为0.7、0.3，综合评分=（盐酸小檗碱含量/盐酸小檗碱含量最大值×0.7+浸膏得率/浸膏得率最大值×0.3）×100。因素水平见表4，正交实验结果及方差分析结果见表5、表6。

结果表明，3个因素对提取效果均有显著性影响（P<0.05），由R值确定的影响程度为C>A>B，根据综合评分，并结合实际生产需要，确定最佳提取条件为A2B1C2。在前期实验中，对处方药材提前浸泡，并测定其吸水率曲线，确定本处方药材吸水倍数为1.38^［4］，因此初次煎煮多加2倍量的水，在后续提取过程中，第一次煎煮加水量为8倍，第二次为6倍，每次煎煮1 h。

2.5 浓缩工艺的考察

考虑工业生产的可操作性，本实验采用常压浓缩，按1/5处方比例称取6份药材，按照2.4项下确定的最佳工艺参数进行提取，过滤，浓缩，在80~90 ℃时，考察浓缩液性状，测定其体积和相对密度。见表7。结果显示，浓缩液相对密度为1.18~1.33（80~90 ℃）时，浓缩液性状为稠膏状态，流动性适宜，易于后续加入炼糖、炼蜜时搅拌均匀。

2.6 成型工艺的考察

2.6.1 辅料用量的考察

选择工业生产中常用的矫味剂炼糖和炼蜜（1∶2），取上述浓缩的浸膏4份，分别加入不同比例的矫味剂搅拌，文火加热（80~90 ℃）熬炼至一定的相对密度，考察膏体的性状及口感，见表8。结合该方已有的临床用药习惯和高渗环境下膏剂的稳定性，选择浸膏︰矫味剂比例为1∶3，性状和口感均较好。

2.6.2 收膏密度考察

取3份浓缩后的浸膏，按浸膏︰矫味剂（1∶3）加入炼糖和炼蜜（1∶2），搅拌，文火加热（80~90 ℃）熬炼至对应的相对密度，收膏，观察膏体性状，结果见表9。结果表明，当收膏时的相对密度为1.38时膏体光滑、油润，性状和口感均较好。

2.7 验证实验

据上述优化后的工艺，进行3次平行验证实验，分别在3批益胃膏成品中取样，以相对密度、不溶物检查、装量差异、盐酸小檗碱含量为考察指标进行验证。结果见表10。

由表7可知，制得的3批煎膏剂的相对密度、不溶物检查、装量、盐酸小檗碱含量均符合《中国药典》中的规定，且较为稳定，表明优化的工艺质量可控、稳定可行。

2.8 薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）鉴别

2.8.1 黄芪

取益胃膏10 mL，加水50 mL，振摇10 min，用水饱和正丁醇溶液提取2次，每次30 mL，合并正丁醇层，先用质量分数1% NaOH溶液洗涤2次，每次25 mL，再用正丁醇饱和水溶液洗涤2次，每次30 mL，蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液；取缺黄芪的益胃膏，同法制成阴性样品溶液；另取黄芪对照药材2 g，同法制成对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL^-1的对照品溶液。吸取上述溶液各5 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成带状，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（10∶20∶11∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积分数10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置于日光下检视。见图2。

2.8.2 苦参

取益胃膏10 mL，加氯仿25 mL，用浓氨试液调pH至9.5，摇匀，超声30 min，取氯仿液蒸干，残渣加乙醇2 mL溶解，作为供试品溶液；取缺苦参的益胃膏，同法制成阴性样品溶液；另取苦参碱对照品，加乙醇制成2 mg·mL^-1的对照品溶液。吸取上述溶液各5 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-甲醇-乙酸乙酯-浓氨试液（2∶3∶4∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾溶液，置于日光下检视。结果见图2。

3 讨论

益胃膏是以半夏泻心汤加四君子汤为基方，经湖北省某医院多年临床经验总结而来。方中黄芪、苦参具有健脾和胃、疏肝理气的功效，为君药；黄连、茯苓、炒白术、法半夏、蒲公英，具有和胃降逆、辛通化气的功效，为臣药；黄芩、芡实、补骨脂、砂仁、鸡内金、玉竹、厚朴，具有疏肝理气的功效，为佐药；大枣、甘草，补脾和中、调理气机，为使药。诸药合用共奏温中健脾、理气和胃之功^［5］，在治疗慢性胃病方面具有独特的优势，临床疗效显著且无明显毒性和不良反应。现代药理研究发现，黄连的有效成分盐酸小檗碱，能够抑制H⁺-K⁺-ATP酶的活性，抑制胃酸分泌，还能对抗多种病原微生物的毒素，提高机体的耐受能力，对消化性溃疡、胃炎有较好的疗效^［6-8］。黄芪中含有大量黄芪皂苷，能抑制炎症反应，提高免疫细胞活性，有效缓解恶心、呕吐、胃痛等症状^［9-11］。苦参中的苦参碱可通过下调炎性细胞因子、细胞凋亡因子及纤维增生调节因子等的表达^［12］，有效治疗慢性萎缩性胃炎。

本研究应用水提工艺提取药材活性成分，方中活性成分主要为生物碱类和黄酮类，传统的水提工艺具有操作简单、成本低、提取效率高和安全方便等优点，且对处方中活性成分结构的影响较小，适合用于工业上大规模生产。处方中黄连的活性成分盐酸小檗碱含量高、性质相对稳定，因此以浸膏得率和盐酸小檗碱含量为工艺评价指标，对二者进行权重系数赋值，盐酸小檗碱含量为0.7，浸膏得率为0.3，最后计算综合评分，筛选最佳的工艺参数。预实验中先对处方药材进行了吸水率测定，得到吸水倍数为1.38，因此在初次加水时需多加2倍量水。然后通过单因素实验对煎煮次数、煎煮时间和加水倍数进行初步优选，最后进行正交实验，以此确定最佳提取工艺的参数。然后对得到的浸膏进行浓缩，浓缩液性状保持在稀稠至稠膏状态，避免过于浓稠影响后续矫味剂的加入，结果表明，将相对密度控制在1.18~1.33时，能将加入的辅料搅拌均匀并使膏体的性状和口感更好。在煎膏中加入炼糖和炼蜜，不仅能掩盖药物的苦味等不适气味，而且含糖量的提高能抑制微生物的生长，延长益胃膏的保质期。

根据君臣佐使的配伍原则^［13］，采用TLC法对处方中君药黄芪和苦参进行定性鉴别，结果显示，在日光下均有相对应的斑点，且在不同实验人员和实验条件下对结果并无较大影响，表明所选的方法具有较强的专属性和重复性，可作为益胃膏中药味的专属鉴别方法。生物碱类为本处方的主要活性成分，盐酸小檗碱在胃病的治疗中发挥着重要作用，且其性质稳定，因此选择测定方中盐酸小檗碱的含量，对益胃膏进行质量控制。通过HPLC法进行方法学考察和稳定性研究，色谱参照《中国药典》（2020年版）^［14］收载的黄连含量测定方法，并结合相关文献^［15-16］，选择乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾为流动相，通过紫外全波长扫描得到盐酸小檗碱的最大吸收波长为345 nm，结果表明，供试品中盐酸小檗碱的色谱峰峰型、分离效果和重复性均较好，符合含量测定要求。

本研究优化筛选出益胃膏的制备工艺，对其建立科学合理的质量控制方法，并进行3批工艺验证实验，保证益胃膏在生产中的可控性、有效性和稳定性，为益胃膏的进一步生产和开发提供了实验基础。

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