艾司氯胺酮通过腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1信号通路对老年骨折大鼠术后认知功能的影响

Esketamine alleviates postoperative cognitive decline in elderly fracture rats through adenosine monophosphate-activated protein kinase/silent information regulator 1 signaling pathway

摘要

目的 探讨艾司氯胺酮通过腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）信号通路对老年骨折大鼠术后认知功能的影响。 方法 建立老年术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）大鼠胫骨骨折模型，将30只大鼠随机分为空白对照组、溶剂组、艾司氯胺酮组、MK-3903组和BAY-3827组。采用Morris水迷宫实验评价大鼠的认知能力；采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察海马神经元的形态和结构；采用免疫组织化学分析细胞凋亡相关蛋白的表达；采用Western blotting检测AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白的表达；采用透射电子显微镜观察线粒体的形态。 结果 与空白对照组和溶剂组比较，艾司氯胺酮组、MK-3903组和BAY-3827组大鼠的术后认知障碍发生率均显著降低（P<0.05）。与空白对照组和溶剂组比较，艾司氯胺酮组、MK-3903组的p-AMPK和SIRT1表达水平均显著升高（P<0.05）。与艾司氯胺酮组比较，BAY-3827组的p-AMPK和SIRT1的表达水平均显著降低（P<0.05）。 结论 艾司氯胺酮可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路改善大鼠的术后认知功能。

Abstract

Objective To investigate the effect of esketamine on postoperative cognitive function in elderly fracture rats through adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK）/silent information regulator 1 （SIRT1） signaling pathway. Methods A rat model of postoperative cognitive dysfunction （POCD） with tibial fracture was established and divided into blank control group， solvent group， esketamine group， MK-3903 group and BAY-3827 group. The Morris water maze test was employed to assess the changes in cognitive abilities. Morphological and structural alterations in hippocampal neurons were examined via hematoxylin-eosin （HE） staining under light microscopy. The expression of apoptosis-related proteins was analyzed through immunohistochemistry， while the expression of proteins associated with the AMPK/SIRT1 signaling pathway was detected by Western blotting. Additionally， mitochondrial morphological changes were observed by using transmission electron microscopy. Results The water maze test revealed that the incidence of postoperative cognitive impairment was significantly lower in the esketamine group， MK-3903 group and BAY-3827 group compared with the blank and solvent groups （P<0.05）. The expression of p-AMPK and SIRT1 was significantly higher in the esketamine group and MK-3903 group than in the control group， whereas the expression of related proteins was significantly lower in the BAY-3827 group than in the esketamine group （P<0.05）. Conclusion Esketamine may enhance postoperative cognitive function in rats by activating the AMPK/SIRT1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

艾司氯胺酮 / 腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1信号通路 / 术后认知功能 / 老年骨折

Key words

esketamine / adenosine monophosphate-activated protein kinase/silent information regulator 1 signaling pathway / postoperative cognitive dysfunction / senile fracture

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是手术麻醉后常见的中枢神经系统并发症，临床表现为记忆力减退、注意力分散、学习能力下降及社会功能受损^‍［1］。随着人口老龄化进程加速，接受手术治疗的老年患者数量显著增加，导致POCD患者的数量增加^‍［2］。发生POCD不仅影响患者的术后康复质量，还会导致家庭护理成本激增和社会医疗资源过度消耗，其已成为麻醉学、神经科学和老年医学领域亟待解决的临床难题^‍［3］。

目前POCD的发病机制尚未完全阐明，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate‐activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子2相关酶1（silent information regulator 1，SIRT1）信号通路作为能量代谢调控的核心路径，其在阿尔茨海默病^‍［4］和血管性认知障碍^‍［5］患者中已被证实可通过调节线粒体功能和抑制神经细胞凋亡发挥神经保护作用。然而，该通路在POCD中作用机制的研究仍处于起步阶段，现有研究多局限于动物实验层面^‍［6-7］。由于艾司氯胺酮与N-甲基-d-天冬氨酸（N-methyl-d-aspartic acid，NMDA）受体亲和力高，小剂量艾司氯胺酮即可通过阻滞NMDA受体信号通路而发挥镇痛和抗抑郁作用^‍［8］。然而，目前关于艾司氯胺酮与AMPK/SIRT1信号通路改善POCD关联性的研究尚未见系统报道。

本研究通过建立POCD大鼠胫骨骨折模型，从行为学、海马神经元形态学、海马神经元细胞线粒体形态和动力学等方面，系统评估了AMPK/SIRT1信号通路的神经保护机制，并通过特异性激动剂/拮抗剂实验验证AMPK/SIRT1信号通路对POCD的作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1103MS型Morris水迷宫设备（美国San Diego Instruments公司）；Azure 600型增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）检测设备（美国Azure Biosystems公司）。

1.2 试药

AMPK激动剂MK-3903、AMPK抑制剂BAY-3827，均购自美国MCE公司；anti-p-AMPK抗体（批号ab133448）、anti-SIRT1抗体（批号ab110304）、anti-caspase-3抗体（批号ab49822）、anti-caspase-9抗体（批号ab20206）和anti-β-actin抗体（批号ab8226），均购自英国Abcam公司；山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，购自美国Proteintech公司，免疫沉淀分析缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 动物

30只健康的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级Sprague-dawley（SD）大鼠（6~7月龄，体质量为350~420 g）购自南通特洛菲饲料科技有限公司。大鼠在（23±1） ℃的自然光源下饲养，并在适应性喂养1周后进行实验。本研究经医院动物伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 大鼠胫骨骨折模型的建立

将30只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、溶剂组、艾司氯胺酮组、MK-3903组和BAY-3827组，每组6只。所有大鼠于右后肢胫骨中段内侧1 cm处做纵行切口，钝性分离肌肉组织，充分暴露胫骨中段骨干。使用骨科专用微型咬骨钳在胫骨中段制造横行骨折。采用三点弯曲法施加外力至可触及骨折断端异常活动，并听到明显骨擦音。选用0.8 mm克氏针自胫骨近端平台穿入，通过骨折端至远端髓腔，针尾折弯后埋于皮下。缝合切口，术区进行再次消毒；术后单笼饲养，每日观察切口愈合情况。

2.2 干预处理

在手术前5、3、1 d，空白对照组大鼠腹腔注射2 mL生理盐水；溶剂组大鼠腹腔注射2 mL按体积比1∶1溶于生理盐水的PEG300；艾司氯胺酮组大鼠腹腔注射2 mL艾司氯胺酮溶液（剂量为40 mg·kg^-1）；MK-3903组大鼠腹腔注射1 mL艾司氯胺酮溶液（剂量为40 mg·kg^-1）和1 mL MK-3903（剂量为40 mg·kg^-1）。BAY-3827组大鼠腹腔注射1 mL 艾司氯胺酮溶液（剂量为40 mg·kg^-1）和1 mL BAY-3827（剂量为40 mg·kg^-1）^‍［9］。

2.3 Morris水迷宫测试

术前在水迷宫固定平台上对大鼠进行认知能力训练。水迷宫分为4个象限，平台固定在第四象限。给药的第1~4天，每日选择1个不重复象限，将大鼠按固定顺序放置在象限中，按分组编号顺序（空白对照组1~6、溶剂组7~12、艾司氯胺酮组13~18、MK-3903组19~24、BAY-3827组25~30）依次完成单次测试循环。每只大鼠的记忆时间设定为50 s，大鼠成功找到平台即视为训练完成。若大鼠在50 s内未能定位平台，则将其引导至平台，并在平台上停留30 s，此过程亦被记录为1次训练。在学习阶段，所有大鼠每日在相同象限内接受4次训练。首先对所有30只大鼠依次进行第1次训练，随后从编号为1的大鼠开始依次进行第2次训练，直至30只大鼠均完成4次训练，至此该象限的水迷宫训练阶段结束。

学习阶段训练完成后，从第5日起，将大鼠按照固定顺序放置于距离平台最远的第2象限，记录其从入水到游至固定平台的时间。该过程每日进行1次，直至手术当天。术后第1、3、5日，再次按照固定顺序将大鼠放置于第二象限，记录大鼠从入水到游至固定平台的时间比。

2.4 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色检测大鼠脑组织形态变化

从各组中随机选取2只大鼠，分别在术后第1、3、5日腹腔注射50 mg·kg^-1戊巴比妥钠进行麻醉。通过左心室和升主动脉快速灌注生理盐水和体积分数4%多聚甲醛，灌注完成后立即完整摘除全脑组织。并在体积分数4%多聚甲醛中浸泡48 h后包埋在石蜡中。从冠状脑中切下5 μm厚的切片进行HE染色。

2.5 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测通路相关蛋白的表达情况

取大鼠海马组织全蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，将偏二氟乙烯膜于室温下、体积分数5%脱脂乳和Tween-20中封闭2 h，加入一抗（1∶1 000稀释），4 ℃下孵育过夜。次日洗膜后，使用辣根过氧化物酶缀合物进行膜的孵育，并在山羊抗兔IgG二抗中孵育2 h，洗膜，ECL显影，凝胶成像系统曝光并拍照，Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

2.6 免疫组织化学染色检测大鼠海马组织caspase-3和caspase-9的表达

石蜡切片在二甲苯中脱石蜡，并在不同体积分数的乙醇（100%、90%、80%和70%）中复水。将5 μm切片置于0.01 mol·L^-1柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，加热至121 ℃并保持10 min，进行非酶切抗原回收。然后，冷却切片，用体积分数0.1%的Tween 20的Tris缓冲盐水（tris buffered saline tween，TBST）冲洗，并在37 ℃下用体积分数3%的H₂O₂的甲醇溶液孵育30 min，以抑制内源性过氧化物酶的活性。冲洗3次后，在37 ℃下用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭切片30 min，然后用抗caspase-3和抗caspase-9在室温湿室中孵育1 h。然后用TBST冲洗肝脏切片，并与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG聚合物在37 ℃下孵育1 h。采用半定量技术评估海马组织中caspase-3和caspase-9的表达水平。在相同的光照强度和放大倍数（×400）下，使用光学显微镜随机拍摄8个视野，用Image-Pro Plus进行分析，并测量其平均密度。

2.7 透射电镜观察海马组织神经元线粒体形态

将海马组织经放入电镜固定液中固定24 h、乙醇梯度脱水、丙酮浸透、包埋、切片后，经醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色，室温下干燥过夜，采用电子透射电镜观察。

2.8 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 22软件对数据进行处理。大鼠在水迷宫中的行为数据用ANY迷宫软件进行评估。Bartlett检验用于检验目标蛋白相对灰度值的方差同质性，数据与正态分布相似。采用方差分析对多组之间的平均值进行比较，并采用LSD-t检验对不同组进行配对比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Morris水迷宫测试的结果

手术前，各组大鼠在寻找平台过程中探索路径无显著差异。手术后，与空白对照组和溶剂组比较，艾司氯胺酮组、MK-3903组和BAY-3827组大鼠到达平台的时间显著缩短，表明采用艾司氯胺酮治疗可显著改善大鼠手术后的认知功能（P<0.05）。见图1。

3.2 各组大鼠海马形态学的变化

HE染色结果显示，各组大鼠海马CA1、CA2和CA3区锥体细胞染色质物质减少，细胞核轻度染色，细胞质疏松（黑色箭头），但在DG区未见异常，无明显坏死和炎性细胞浸润。空白对照组和溶剂组大鼠海马组织CA1区的锥体细胞松散且排列不规则（红色箭头）；部分海马组织CA2和CA3中的少量锥体细胞收缩，体积变小，染色加深，嗜碱性粒细胞增多，细胞质和细胞核边界不清楚（蓝色箭头）。经艾司氯胺酮处理后，大鼠海马组织形态学有所改善。

3.3 各组大鼠脑组织中AMPK/SIRT通路蛋白的相对表达量

术后第1、3、5日分别检测各组大鼠p-AMPK、SIRT1的表达量，与空白对照组和溶剂组比较，艾司氯胺酮组p-AMPK和SIRT1蛋白的相对表达量显著升高（P<0.05）。与艾司氯胺酮组比较，MK-3903组的p-AMPK和SIRT1蛋白的相对表达量显著升高，BAY-3827组的p-AMPK和SIRT1蛋白的相对表达显著降低（P<0.05）。见图3。

3.4 凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9在海马组织中表达的免疫组织化学分析

对空白对照组和溶剂组比较，艾司氯胺酮组、MK-3903组、BAY-3827组大鼠的caspase-3和caspase-9抗体染色光密度值显著提高（P<0.05）。药物处理后，BAY-3827组的生长速率显著低于艾司氯胺酮组和MK-3903组（P<0.05）。见图4。

3.5 透射电镜观察线粒体的形态学变化

各组海马组织的电子显微照片显示，与空白对照组和溶剂组比较，艾司氯胺酮、MK-3903组和BAY-3827组的线粒体内外膜明显受损，嵴结构模糊，神经元核基质缺失，细胞质细胞器模糊，突起数量增加。透射电镜的结果显示，艾司氯胺酮可以保护线粒体膜和细胞器的完整性，并维持正常的线粒体动力学，从而缓解术后认知功能障碍。见图5。

3 讨论

POCD的发病机制具有高度复杂性，涉及蛋白质的错误折叠与聚集、β淀粉样蛋白沉积、氧化应激、线粒体功能障碍、神经胶质细胞功能异常、兴奋性毒性、钙稳态失调以及神经炎症反应等多个病理生理过程^‍［10］。其中，氧化应激与线粒体损伤在POCD的发生、发展中扮演着关键角色^‍［11］。值得注意的是，尽管不同神经认知障碍疾病的病因各异，但现有研究证实这些疾病普遍存在线粒体功能异常、活性氧过度生成以及神经炎症反应等共同病理特征^{‍［12-13］}。研究发现，线粒体动力学异常是神经认知障碍的早期迹象^‍［14］，其发生先于β淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白异常磷酸化以及神经元凋亡等病理改变。本研究通过透射电镜观察发现，POCD大鼠海马神经元线粒体膜结构受损，嵴结构模糊，而艾司氯胺酮处理组的线粒体形态更接近于正常。表明艾司氯胺酮可能通过维持线粒体动力学平衡，从而保护神经元功能。

艾司氯胺酮作为一种具有良好血脑屏障穿透特性的静脉麻醉药物，能够通过调节神经系统功能影响多种生物活性因子的表达与释放^‍［15］。临床研究发现，小剂量艾司氯胺酮可改善老年患者股骨近端防旋髓内钉术后早期认知功能，这可能与其减轻术后疼痛，降低术中血流动力学波动，抑制炎症、应激反应有关^‍［16］。本研究结果显示，术后艾司氯胺酮组、MK-3903组和BAY-3827组大鼠的逃避潜伏期显著缩短，表明艾司氯胺酮能有效改善POCD大鼠的空间学习记忆能力。

现有研究发现，AMPK信号转导通过调节自噬参与认知障碍^{‍［17-18］}。据报道，利拉鲁肽通过AMPK/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）通路促进自噬，抑制神经元凋亡，改善认知功能下降^{‍［18-19］}。在阿尔茨海默病小鼠模型中，硒代蛋氨酸通过AMPK‐mTOR通路促进自噬，延缓认知功能下降^‍［20］。多项研究发现，SIRT1是一种NAD⁺依赖性蛋白脱乙酰酶，在神经退行性疾病中发挥神经保护作用^{‍［21-22］}。SIRT1的活性可由AMPKα12正向调节^‍［21］，AMPK/SIRT1通路与由各种神经疾病导致的认知障碍有关^{‍［23-24］}。此外，由AMPK/SIRT1通路介导的自噬通路在神经元保护中发挥着重要作用^‍［25］。二甲双胍通过调节AMPK/SIRT1通路改善术后认知功能障碍^‍［6］。本研究发现，艾司氯胺酮显著上调海马组织中p-AMPK和SIRT1的表达。MK-3903组p-AMPK和SIRT1的表达水平进一步升高，而BAY-3827组的表达水平降低，表明艾司氯胺酮可能通过AMPK/SIRT1通路发挥神经保护作用。

此外，POCD大鼠海马组织中caspase-3和caspase-9的表达水平上升，而艾司氯胺酮组和MK-3903组的凋亡信号减弱。表明艾司氯胺酮可能通过抑制凋亡相关蛋白的激活，减少神经元死亡，从而保护认知功能。

综上所述，艾司氯胺酮和AMPK激动剂治疗可以降低大鼠术后认知功能障碍的发生率，表明艾司氯胺酮在胫骨骨折大鼠中的作用可能是通过激活AMPK/SIRT1信号通路实现的。

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基金资助

宁德师范学院级科研项目(2024ZX86)