双歧杆菌四联活菌片联合水飞蓟宾对非酒精性脂肪肝患者肝功能、肠道菌群及胰岛素敏感性的影响

Effect of Bifidobacterium Quadruple Viable Tablets combined with Silybin on liver function，intestinal flora and insulin sensitivity in patients with non-alcoholic fatty liver disease

摘要

目的 探讨双歧杆菌四联活菌片（思连康）联合水飞蓟宾对非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者肝功能、肠道菌群及胰岛素敏感性的影响。 方法 选取2020年11月—2023年6月收治的124例NAFLD患者作为研究对象，用随机信封法分为对照组和观察组，每组62例。对照组给予常规治疗，观察组在常规治疗的基础上采用思连康辅助治疗，疗程为8周。比较2组的肝功能［丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰转肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）］、肝纤维化［透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前胶原（type Ⅲ procollagen，PC-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen，PC-Ⅳ）］、脂肪肝严重程度［肝脏控制衰减参数（controlled attenuation parameter，CAP）值］、肠道菌群、血清炎性因子［白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-1β，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）］、胰岛素敏感性［外周血葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT4） mRNA、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS1） mRNA、IRS2 mRNA］及不良反应的发生情况。 结果 治疗4、8周后观察组的AST、GGT、ALT水平较对照组均降低（P<0.05）；治疗4、8周后观察组的HA、LN、PC-Ⅲ、PC-Ⅳ水平较对照组均降低（P<0.05）；治疗4、8周后，观察组的CAP值均低于对照组（P<0.05）；治疗4、8周后观察组的乳杆菌、双歧杆菌水平较对照组均升高，肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌水平较对照组均降低（P<0.05）；治疗4、8周后观察组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平较对照组均降低（P<0.05）；治疗4、8周后观察组的GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA水平均高于对照组（P<0.05）；观察组的不良反应发生率（6.45%）与对照组（9.68%）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 双歧杆菌四联活菌片联合水飞蓟宾治疗NAFLD，能减轻机体炎性反应，改善肝功能、抑制肝纤维化和IR，从而改善患者的病情。

Abstract

Objective To investigate the effects of Bifidobacterium Quadruple Viable Tablets （Siliankang） combined with Silybin on liver function， intestinal flora， and insulin sensitivity in patients with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods A total of 124 patients with NAFLD admitted from November 2020 to June 2023 were selected as the research subjects and randomly assigned to a control group and an observation group by using a random envelope method， with 62 cases in each group. The control group received conventional treatment， while the observation group received additional treatment with Siliankang on the basis of conventional treatment. The course of treatment was 8 weeks. The liver function ［alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， and glutamyl transpeptidase （GGT）］， liver fibrosis ［hyaluronic acid （HA）， laminin （LN）， type Ⅲ procollagen （PC-Ⅲ）， and type Ⅳ collagen （PC-Ⅳ）］， severity of fatty liver ［controlled attenuation parameter （CAP） value ， intestinal flora，serum inflammatory factors ［interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）］， insulin sensitivity ［glucose transporter-4 （GLUT4） mRNA， insulin receptor substrate-1 （IRS1） mRNA， and IRS2 mRNA］， and the occurrence of adverse reactions were compared between the 2 groups. Results After 4 and 8 weeks of treatment， the levels of AST， GGT and ALT in the observation group decreased compared with the control group （P<0.05）； after 4 and 8 weeks of treatment，the levels of HA， LN， PC-Ⅲ， and PC-Ⅳ in the observation group were all reduced compared with those in the control group （P<0.05）； after 4 and 8 weeks of treatment， the CAP values in the observation group were lower than those in the control group （P<0.05）； after 4 and 8 weeks of treatment， the levels of Lactobacillus and Bifidobacterium in the observation group increased compared with the control group， while the levels of Enterobacteriaceae， Enterococcus， and Staphylococcus decreased compared with the control group （P<0.05）； after 4 and 8 weeks of treatment， the levels of IL-1β， IL-6 and TNF-‍α in the observation group were reduced compared with those in the control group （P<0.05）； after 4 and 8 weeks of treatment，the mRNA levels of GLUT4， IRS1 and IRS2 in the observation group were higher than those in the control group （P<0.05）； there was no significant difference in the incidence of adverse reactions between the observation group （6.45%） and the control group （9.68%）， P>0.05. Conclusion The treatment of NAFLD with Bifidobacterium Quadruple Viable Tablets combined with silybin can reduce the inflammatory response of the body， improve liver function， inhibit liver fibrosis and IR， and thus improve the condition of patients.

关键词

非酒精性脂肪肝 / 胰岛素敏感性 / 双歧杆菌四联活菌片 / 肝纤维化 / 肠道菌群 / 炎性因子

Key words

non-alcoholic fatty liver disease / insulin sensitivity / Bifidobacterium Quadruple Viable Tablets / hepatic fibrosis / intestinal flora / inflammatory factor

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝细胞内脂肪过度堆积为主要特征的临床综合征，且患者无过量饮酒史，其与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、遗传等因素形成的代谢综合征关系密切，严重者可发展至肝癌^［1］。随着我国居民生活水平的提高，高脂血症、糖尿病、肥胖症等代谢紊乱性疾病的发病率呈上升趋势，因此NAFLD也越来越常见，现已成为肝脏疾病死亡的主要原因之一^［2］。现阶段，临床对于NAFLD尚无标准治疗方案，其主要治疗措施为积极控制导致疾病进展的危险因素，包括饮食干预、糖脂代谢调节、护肝治疗等对症支持治疗，但整体治疗效果不甚理想。研究发现^［3-4］，肠道微生态失衡是导致NAFLD发生和发展的关键因素，其影响糖脂代谢，可加重机体内质网应激与氧化应激，促进肝脏炎症反应和纤维化进程^［5］。NAFLD患者肠道菌群失调破坏肠道屏障完整性，细菌及其代谢产物进入固有层，同时细菌产生的内毒素随门静脉重新回流至肝脏，进而诱发肝脏炎性反应，促进NAFLD向肝纤维化发展。因此，调节肠道微生态是治疗NAFLD的方法之一。双歧杆菌四联活菌片（思连康）属于益生菌制剂，可抑制肠道中细菌的定植，维持肠道的正常蠕动，有利于调整菌群平衡，目前被广泛应用于胃肠道疾病的治疗，临床效果良好^［6-7］。目前，调节肠道菌群被认为是治疗NAFLD的新靶点。本研究从肠道菌群、IR入手探究思连康辅助治疗NAFLD的效果，以期为临床采用益生菌治疗NAFLD提供参考。

1 一般资料

以2020年11月—2023年6月收治的124例NAFLD患者作为研究对象。样本量估计：以丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）含量为观测指标，根据既往文献及预实验结果，对照组治疗后ALT含量的平均数为（68.15±9.24） U·L^-1，预计观察组治疗后ALT含量可下降10 U·L^-1，设双侧α=0.05，把握度为90%。根据n₁=n₂=［（Z_α +Z_β ）2×2σ²］/δ²，计算得到n₁=n₂=55，考虑失访及拒访的情况（按10%~20%计算），最终确定每组62例。

纳入标准：符合NAFLD的诊断标准^［8］；年龄为18~80岁；无饮酒史或女性饮酒<70 g·周^-1、男性饮酒<140 g·周^-1（按乙醇量计算）；近半个月未使用过调脂药、抗生素或免疫抑制剂等影响胃肠黏膜通透性的药物；Child-Pugh肝功能分级为A级或B级；首次接受治疗；肝脏CT检查显示出现弥漫性脂肪肝病变；自愿签署知情同意书。

排除标准：伴有病毒性肝病或药物性肝损伤；过敏体质或对本研究所使用的药物过敏；伴有认知功能障碍或精神性疾病；合并自身免疫障碍性疾病；合并肠道梗阻、肝豆状核变性；合并严重心、脑血管疾病；合并恶性肿瘤；合并血液系统或全身感染性疾病；处于妊娠期的妇女。

采用随机信封法将入组的病例分为对照组和观察组。具体步骤：按就诊顺序设置1~124个编码随机数字，将所有编号导入随机数字表，设置1∶1比例，随机生成2组，并将药物方案装入对应编号的信封内，密封保存，符合纳入标准的患者，签署知情同意书后，纳入分组，并拆开信封，采用对应药物方案给予治疗，2组各62例。2组性别、病程、体质量指数、合并症等一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。本研究经医院医学伦理委员会审核、批准。

2 方法

2.1 治疗方法

2组均积极控制危险因素，包括帮助患者调整饮食结构，改变生活作息，禁止吸烟饮酒，适当运动，控制体质量，积极控制高脂血症、糖尿病等基础疾病，且用药方案一致。同时对照组给予水飞蓟宾胶囊（规格为35 mg·粒^-1，天津天士力圣特制药有限公司）治疗，口服，每次70 mg，每日3次。观察组在对照组治疗的基础上，给予思连康（规格为0.5 g·片^-1，杭州远大生物制药有限公司）治疗，口服，每次1.5 g，每日3次。2组均连续治疗8周。

2.2 观察指标

2.2.1 肝功能

分别于治疗前，治疗4、8周后抽取患者清晨空腹静脉血3 mL，以3 000 r·min^-1离心10 min（半径12 cm），取上清液，检测血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰转肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）和ALT水平。检测仪器为Viva-ProE型全自动生化分析仪（德国西门子）。

2.2.2 肝纤维化

按照2.2.1项下的方法取上清液，用放射免疫法检测血清透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前胶原（type Ⅲ procollagen，PC-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen，PC-Ⅳ）水平，检测仪器为Viva-ProE型全自动生化分析仪（德国西门子）。

2.2.3 脂肪肝严重程度

分别于治疗前后，用彩超检查2组的肝脏控制衰减参数（controlled attenuation parameter，CAP）值，以评价脂肪肝的严重程度。

2.2.4 肠道菌群

分别于治疗前，治疗4、8周后收集2组患者的新鲜粪便1 g，加入9 g·L^-1无菌NaCl溶液，用接种环接种于琼脂培养基上，37 ℃需氧培养24~48 h，用平板活菌计数法计算肠球菌、葡萄球菌、双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌的数量，以LogCFU·g^-1表示。

2.2.5 血清炎性因子

根据2.2.1项下的方法取上清液，用化学发光免疫分析法检测血清白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子‍-‍α（tumor necrosis factor-‍α，TNF-α）的水平。检测仪器为全自动生化分析仪。

2.2.6 胰岛素敏感性

分别于治疗前，治疗4、8周后用抗凝管采集患者外周静脉血3 mL，用细胞分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），按照总RNA提取试剂盒、Trizol试剂盒说明书操作，提取PBMCs总RNA，逆转录合成cDNA，以β-actin为内参，cDNA为模板，用AGS8830-16型聚合酶链反应核酸（PCR）扩增仪（上海安誉生物科技有限公司）测定葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT4）mRNA、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS1）mRNA、IRS2 mRNA的表达量，以2^-ΔΔCt法计算GLUT4 mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA的相对表达量。

2.2.7 不良反应

观察并比较2组患者在治疗期间发生皮肤瘙痒、恶心、呕吐、头晕等不良反应的情况。

2.3 统计学方法

研究调查结果双人录入，采用SPSS 27.0统计学软件对数据进行处理。经K-S检验符合正态分布的计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，行t检验，多时间点指标采用重复测量方差分析；计数资料以“例（%）”表示，行χ² 检验，等级资料采用Ridit检验。检验标准为α=0.05（双侧）。

3 结果

3.1 肝功能的比较

2组组间、不同时间点及组间不同时间点交互AST、GGT、ALT水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗4、8周后，2组的AST、GGT、ALT水平较治疗均前下降（P<0.05），且观察组的AST、GGT、ALT水平均低于对照组（P<0.05）。见表2。

3.2 肝纤维化程度的比较

2组组间、不同时间点及组间不同时间点交互HA、LN、PC-Ⅲ、PC-Ⅳ水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。2组治疗4、8周后的HA、LN、PC-Ⅲ、PC-Ⅳ水平较治疗前均下降（P<0.05），且观察组的HA、LN、PC-Ⅲ、PC-Ⅳ水平均低于对照组（P<0.05）。见表3。

3.3 脂肪肝严重程度的比较

2组组间、不同时间点及组间不同时间点交互CAP值比较，差异均有统计学意义（P<0.05），2组治疗4、8周后的CAP值较治疗前均下降（P<0.05）。治疗4、8周后，观察组的CAP值均低于对照组（P<0.05）。见表4。

3.4 肠道菌群的比较

2组组间、不同时间点及组间不同时间点交互肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌、葡萄球菌、肠杆菌水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗4、8周后，观察组的双歧杆菌、乳杆菌数量较治疗前均升高，肠球菌、肠杆菌、葡萄球菌数量较治疗均前下降（P<0.05），对照组上述指标与治疗前比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗4、8周后，观察组的乳杆菌、双歧杆菌数量多于对照组，肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌数量少于对照组（P<0.05）。见表5。

3.5 血清炎性因子的比较

2组组间、不同时间点及组间不同时间点交互IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。2组治疗4、8周后的IL-1β、IL-6、TNF-α水平较治疗前均下降（P<0.05），且观察组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于对照组（P<0.05）。见表6。

3.6 外周血GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA表达水平的比较

2组组间、不同时间点及组间不同时间点交互外周血GLUT4 mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；2组治疗4、8周后GLUT4 mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA水平较治疗前均升高（P<0.05）；治疗4、8周后，观察组的GLUT4 mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA水平均高于对照组（P<0.05）。见表7。

3.7 不良反应发生情况的比较

观察组的不良反应发生率为6.45%，对照组为9.68%，2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表8。

4 讨论

NAFLD的病因较为复杂，治疗难度大。目前普遍认为，由IR、脂质代谢紊乱等引发的肝细胞内脂肪过度蓄积是导致NAFLD发病的主要原因，而脂肪过度蓄积形成的系统性炎症反应和氧化应激可进一步损伤肝脏^［9-10］。近年来有研究发现，肠道微生态的改变在NAFLD的发生和发展中具有促进作用，并逐渐形成了肠-肝轴理论，该理论认为肠道与肝脏存在双向沟通关系，一方面，肝脏中无法被库普弗细胞代谢的活性物质及炎性因子随肠道流入肠腔，诱导肠黏膜损伤；另一方面，肠道结构受损时，细菌及其产物通过门静脉运转至肝脏，从而使肝脏受肠道微生物影响而影响肝脏正常生理功能，故肠-肝轴紊乱可诱发或加重NAFLD的发生和发展^［11-12］。因此，合理利用益生菌调整肠道微生态平衡对改善NAFLD患者的病情具有积极意义。

水飞蓟宾胶囊是肝脏疾病的一线治疗药物，具有清除肝细胞内的活性氧自由基、稳定肝细胞膜的作用，可明显提升患者的肝脏解毒能力，抑制病情进展，使肝功能得到良好恢复，但对肠道微生态无明显改善作用^［13］。思连康的主要成分包括嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌，NAFLD患者口服后可直接在肠道内定植、繁殖，与致病菌产生拮抗作用，快速恢复并维持肠道内菌群平衡，并在肠黏膜表面形成保护膜，恢复肠道黏膜完整性，恢复并维持肠道正常形态与功能，从而减少内毒素的产生，减轻患者的肝脏损伤^［14-15］。张海玲等^［16］研究发现，NAFLD患者采用微生态制剂辅助治疗能抑制肝纤维化、减轻炎症刺激，临床治疗效果确切。本研究在水飞蓟宾胶囊治疗的基础上联合微生态制剂，结果发现，治疗4、8周后观察组的肝功能指标及肝纤维化指标较对照组均下降，表明思连康辅助治疗能修复受损肝组织，改善肝功能，与上述研究的结果基本一致。

肠道微生态是由肝-肠轴与肠道菌群共同维持、相互作用，正常情况下处于动态平衡状态。既往研究发现^［17］，NAFLD患者肠道内双歧杆菌、乳杆菌等厌氧菌的数量减少，而肠杆菌、葡萄球菌等需氧菌的数量增多。变形菌门多数为革兰氏阴性菌，其外膜的主要成分为脂多糖，变形菌门死亡后导致脂多糖释放增加，进而引发内毒素血症，并通过门静脉系统进入肝脏，激活库普弗细胞，触发炎症级联反应，从而加速NAFLD患者的肝纤维化^［18-19］。本研究发现，思连康辅助治疗后患者肠道中双歧杆菌、乳杆菌的数量明显增多，肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌的数量明显减少，表明思连康能调节肠道菌群紊乱，逐渐恢复肠道菌群平衡，这也是患者肝纤维化与肝形态得到改善的原因之一，肠道菌群平衡恢复能抑制革兰氏阴性菌的过度增殖，从而降低内毒素含量，利于纠正患者肠黏膜的通透性，提高肠黏膜上皮修复能力，进一步恢复肠黏膜形态及功能的完整性，具有良好的护肝效应，且安全性较高。

肠道菌群失衡破坏肠黏膜屏障，致病菌释放的内毒素通过门脉系统转移至肝脏，从而激活内毒素-Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号通路，刺激肝细胞产生炎症级联反应，促进IL-1β、IL-6、TNF-α等抗细菌或抗病毒细胞因子来抵抗病原体侵袭，当其持续升高则会损伤宿主细胞^［20-21］。另外，有文献^［22-23］指出，炎性因子能通过TLR4炎性信号通路激活其下游TNF、髓样分化因子（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）等信号因子，从而导致IR的发生，表现为外周血GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA表达水平下降。另外，NAFLD患者的临床特征为三酰甘油的聚集，当体内和肝脏内游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）及其代谢产物聚集到一定程度时，能激活Jun氨基端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK 1）、蛋白激酶C θ（protein kinase C theta，PKC θ）等丝氨酸激酶级联反应，从而使IRS1、IRS2丝氨酸磷酸化，致使磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）无法活化，从而阻断胰岛素信号转导。IR可导致胰岛素对脂肪代谢的调节作用减弱，促进脂肪组织分解，使FFA释放增加，过量的FFA直接经门静脉循环进入肝脏，在肝细胞内堆积，进而引发脂肪肝等肝脏疾病。本研究结果显示，与对照组比较，治疗4、8周后观察组的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低，外周血GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA的表达水平均升高。表明联合思连康治疗能有效减轻患者体内炎症反应，改善胰岛素敏感性。分析原因为：肠-肝轴具有“双向性”，服用思连康后能快速纠正肠道微生态紊乱，与肠道内致病菌产生营养竞争、黏附竞争、生物化学抑制作用，从而抑制内毒素分泌，减轻肠道炎症反应，同时也能抑制肝脏损伤，且嗜酸乳杆菌、双歧杆菌的增多能提升患者的免疫功能，促进醋酸、乳酸分解，调节肠道酸碱度，有利于减轻肝脏及肠道免疫损伤，在调节肠道微生物环境的同时，也能调节机体代谢，降低血糖、血脂水平，从而抑制IR的发生，从而达到治疗NAFLD的目的^［24-26］。

综上所述，思连康联合水飞蓟宾治疗能纠正NAFLD患者的肠道菌群紊乱，降低外周血GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA的表达水平，抑制机体炎性反应，从而抑制患者肝纤维化，促进肝功能恢复。但本研究仍存在一些问题：①部分患者需使用降糖药物，可能对GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA的表达产生影响，因此未来需设计更加细致的分层分析，如不同血糖控制药物（如胰岛素、口服降糖药等）对GLUT4、IRS1、IRS2 mRNA水平的影响或将糖尿病患者和非糖尿病患者进行分层，以进一步排除血糖状态本身对试验结果的影响；②NAFLD患者需长期用药，长期大量摄入益生菌，可能使肠道对外部益生菌产生依赖性，导致自身肠道菌群的调节能力下降，一旦停止摄入益生菌，可能出现菌群失衡等问题，因此，未来需开展长期随访研究，以评估益生菌在NAFLD治疗中的长期安全性和有效性。

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基金资助

2020年四川省医学（青年创新）科研课题(S20157)