东紫苏质量标准的研究

Study on the quality standard for Elsholtzia bodinieri Van

摘要

目的 建立东紫苏的质量标准。 方法 收集8批不同产地的东紫苏药材，用显微及薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）对东紫苏进行定性分析；参照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部中的方法对水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属及有害元素、33种禁用农药残留、浸出物进行检查和测定；采用超高效液相色谱法（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）测定东紫苏中木犀草苷和迷迭香酸2种成分的含量。 结果 东紫苏显微鉴别特征清晰，含有木纤维、导管、后壁细胞、非腺毛、叶肉细胞、叶表皮细胞。TLC鉴别斑点清晰、分离度较好。水分平均值为7.945%；总灰分平均值为8.786%；酸不溶性灰分平均值为0.556%；重金属及有害元素均符合规定、33种禁用农药残留均未检出；浸出物平均值为33.916%；木犀草苷和迷迭香酸分别在0.004 1~0.203 8 μg和0.004 0~0.199 6 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好线性关系，平均回收率分别为106.5%、102.6%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.76%、1.85%（n=6）。 结论 该研究建立的显微鉴别、TLC鉴别、重金属及有害元素、33种禁用农药残留、其他检查项和浸出物的测定方法简便、准确、专属性强。UPLC法能在13 min内准确、快速地测定东紫苏中木犀草苷和迷迭香酸的含量，为东紫苏的整体质量控制提供有力的技术支持。

Abstract

Objective To establish a comprehensive quality standard for Elsholtzia bodinieri Van. Methods 8 batches of Elsholtzia bodinieri Van were collected from various regions. Qualitative analysis was performed using microscopy and thin-layer chromatography （TLC）. Moisture content， total ash， acid-insoluble ash， heavy metals， harmful elements， and 33 banned pesticide residues were evaluated according to the methods outlined in the Chinese Pharmacopoeia （2020 edition）. The contents of luteolin and rosmarinic acid were rapidly determined using ultra-performance liquid chromatography （UPLC）. Results Microscopic features were clearly identified， including wood fibers， posterior wall cells， non-glandular hairs， mesophyll cells， and leaf epidermis cells. TLC identification spots were clear with good separation. The average moisture content was 7.945%， total ash was 8.786%， and acid-insoluble ash was 0.556%. Heavy metals and harmful elements were within regulatory limits， and no residues of the 33 banned pesticides were detected. The average extract value was 33.916%. Luteolin and rosmarinic acid contents ranged from 0.004 1 to 0.203 8 µg and 0.004 0 to 0.199 6 µg， respectively. Recovery rates for luteolin and rosmarinic acid were 106.5% and 102.6%， with relative standard deviations （RSD） of 1.76% and 1.85% （n=6）， respectively. Conclusion The methods employed for microscopic identification， TLC identification， and the determination of heavy metals， harmful elements， and banned pesticide residues are fast， efficient， and accurate. The UPLC method allows for the rapid determination of luteolin and rosmarinic acid in Elsholtzia bodinieri Van within 13 minutes， providing a robust tool for quality control.

Graphical abstract

关键词

东紫苏 / 质量标准 / 显微鉴别 / 薄层色谱 / 超高效液相色谱 / 木犀草苷 / 迷迭香酸

Key words

Elsholtzia bodinieri Van / quality standards / microscopic identification / thin-layer chromatography / ultra-performance liquid chromatography / luteolin / rosmarinic acid

东紫苏，又称牙刷草、云松茶、铁线夏枯草等，为唇形科香薷属东紫苏（Elsholtiza bodinieri Van）的干燥全草，属多年生草本植物，主产于云南、贵州西部等地^［1］。其气清香，味辛、微苦，性平，具有发散解表、清热利湿的功效。临床上主要用于感冒、咽喉痛、头痛、扁桃腺炎、小儿口腔炎、牙痛、肝炎、消化不良等的治疗^［2］。研究发现，东紫苏中主要含有黄酮类、酚酸类、三萜类、挥发油及多糖等多种活性成分^［3-15］，其中黄酮类成分具有降血脂、抗氧化、抗炎、调节免疫、镇痛、抗肿瘤等药理作用^［11］，酚酸类成分具有增强机体免疫力、抗氧化、抗疲劳、抗流感等生物活性^［12］。目前，关于东紫苏质量标准的研究尚未有文献报道，本研究参考其他药材质量标准的文献报道^［16-19］，建立东紫苏的显微鉴别方法、薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）鉴别和超高效液相色谱法（ultra-performance liquid chromatography，UPLC），快速测定东紫苏中黄酮类活性成分木犀草苷和酚酸类活性成分迷迭香酸的含量；并参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）对东紫苏中的重金属及有害元素、33种禁用农药残留、水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物进行测定，规定其限度。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BX53（LED）型生物显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；VVisualizer 2型薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）显色及成像系统（瑞士CAMAG公司）；i CAP RQ型电感耦合等离子体质谱仪（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）、Thermo Flex2500型循环水机，均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Multiwave PRO型微波消解仪（奥地利安东帕公司）；BHW-09A45型赶酸仪（博通化学科技有限公司）；AB SCIEX QTRAP 4500型三重四级杆液质联用仪（美国安捷伦公司）；KS 4000 ic control型控温摇床（德国IKA公司）；PM4-1300TL型超声波清洗机（上海普锐马电子有限公司）；DKM610C型干燥箱、F0811C型箱式电阻炉，均购自日本Yamato公司；ELGA型超纯水处理系统（英国ELGA公司）；ACQUITY型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BSA224S型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

木犀草苷（批号111720-202111，质量分数为96.6%）、迷迭香酸（批号111871-202007，质量分数为98.1%），均购自中国食品药品检定研究院；铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）混合对照溶液（批号610014-201701，国家有色金属及电子材料分析测试中心）；33种农药对照品均购自中国食品药品检定研究院，具体信息见表1。乙腈（色谱纯，美国Merck公司）； 8批次东紫苏药材采自不同产地，经中国科学院昆明植物研究所鉴定为唇形科香薷属东紫苏（Elsholtiza bodinieri Van）的干燥全草，具体信息见表2。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取东紫苏（编号DZS-001）样品，粉碎，过2号筛，取粉末少许，置于载玻片上，加水合氯醛1~2滴，置于酒精灯上加热透化，加三酰甘油1~2滴，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。粉末呈黄绿色。木纤维壁薄，孔沟明显。可见螺纹、梯纹和网纹导管，以螺纹导管为主。厚壁细胞为棕黄色，呈多角形或不规则形。非腺毛由2~5个细胞组成，表面有疣状突起。叶肉组织上可见小型螺纹导管及多数草酸钙结晶。叶表皮细胞呈不规则形，气孔为直轴式。见图1。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 对照品溶液的制备

取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mg·mL^-1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取东紫苏药材粉末（过2号筛）约1.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，蒸干，加1 mL甲醇使其溶解，即得。

2.2.3 空白溶液的制备

取溶剂适量，按照2.2.2项下的方法制得空白溶液。

2.2.4 TLC鉴别

按照《中国药典》（2020年版）四部通则0502项下方法进行TLC实验，取8批东紫苏样品，按照2.2.2项下方法制成供试品溶液，取2.2.1项下制备的迷迭香酸对照品溶液，各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸（12∶2.5∶3∶0.3）为展开剂，展开，取出，晾干。置于365 nm波长处检视，供试品溶液与对照品溶液在相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，空白溶液无干扰，表明建立的TLC专属性良好，可用于东紫苏药材的定性鉴别。见图2。

2.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属及有害元素、33种禁用农药残留、浸出物的检查和测定

2.3.1 水分

按照《中国药典》（2020年版）四部通则0832项下水分测定法中第二法（烘干法）进行测定，见表3。

2.3.2 总灰分及酸不溶性灰分

按照《中国药典》（2020年版）四部通则2302项下灰分测定法进行测定，见表3。

2.3.3 重金属及有害元素

按照《中国药典》（2020年版）四部通则2321项下第二法（电感耦合等离子体质谱法），对8批次东紫苏中铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）进行检测，结果显示，8批次东紫苏中Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量不超过《中国药典》（2020年版）四部通则中的限值（Pb不得超过5 mg·kg^-1；Cd不得超过1 mg·kg^-1；As不得超过2 mg·kg^-1；Hg不得超过0.2 mg·kg^-1；Cu不得超过20 mg·kg^-1）。

2.3.4 33种禁用农药残留

按照《中国药典》（2020年版）四部通则，用三重四级杆气质联用仪对农药残留进行检测。结果显示，8批次东紫苏均未检出33种禁用农药残留。

2.3.5 浸出物

按照《中国药典》（2020年版）四部通则2201项下醇溶性浸出物测定法的热浸法，用体积分数50%乙醇作为提取溶剂，对8批次东紫苏提取浸出物进行测定。见表3。

2.4 木犀草苷和迷迭香酸含量的测定

2.4.1 色谱条件

采用ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；以体积分数0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0~15 min，15% B→21% B；柱温为20 ℃；流速为0.2 mL·min^-1；进样量为2 μL；检测波长为348 nm。

2.4.2 混合对照品溶液的制备

取木犀草苷、迷迭香酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成质量浓度分别为40.765 2、39.926 7 µg·mL^-1的混合对照品溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备

取东紫苏药材粉末（过2号筛）约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.2 µm微孔滤膜滤过，即得。

2.4.4 空白溶液的制备

取溶剂按照2.4.3项下的方法制得空白溶液。

2.4.5 系统适用性实验

取上述制备的混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，按照2.4.1项下色谱条件进样检测，记录色谱图。结果显示，木犀草苷和迷迭香酸与其相邻峰的分离度均大于2.0，空白实验在相应位置无干扰，理论塔板数均大于8 000。见图3。

2.4.6 线性关系考察

按照2.4.2项下方法制备混合对照品溶液，分别取0.1、0.5、1.0、1.5、3.0和5.0 µL，按照2.4.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图并测定峰面积。以进样量（µg）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，得到木犀草苷和迷迭香酸的回归方程分别为y₁=2×10⁷x₁-57 214（R²=0.999 2）；y₂=6×10⁶x₂-5 515.8（R²=1.000 0），线性范围分别为0.004 1~0.203 8、0.004 0~0.199 6 µg。

2.4.7 精密度实验

取2.4.2项下的混合对照品溶液，按照2.4.1项下的色谱条件连续进样6次。计算得木犀草苷和迷迭香酸的峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.41%、0.10%，表明仪器的精密度良好。

2.4.8 稳定性实验

取同一批东紫苏（编号DZS-001）样品，按照2.4.3项下的方法制备供试品溶液，按照2.4.1项下的色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定。计算得木犀草苷和迷迭香酸峰面积的RSD分别为0.47%、0.35%，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.4.9 重复性实验

取同一批东紫苏（编号DZS-001）样品，按照2.4.3项下的方法平行制得6份供试品溶液，按照2.4.1项下的色谱条件进样测定。计算得木犀草苷和迷迭香酸峰面积的RSD分别为0.88%、0.94%，表明其重复性良好。

2.4.10 回收率实验

取同一批东紫苏（编号DZS-001）样品粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，分别精密加入木犀草苷和迷迭香酸的质量浓度分别为0.127 4、0.204 5 mg·mL^-1的对照品溶液15 mL，按照2.4.3项下的方法制备供试品溶液，按照2.4.1项下的色谱条件进样测定。计算得木犀草苷和迷迭香酸的平均回收率分别为106.5%、102.6%，RSD分别为1.76%、1.85%，表明该方法的回收率良好。

2.4.11 样品含量测定结果

取8批不同产地东紫苏样品，按照2.4.3项下的方法制备供试品溶液，按照2.4.1项下的色谱条件进样测定，计算不同批次东紫苏中木犀草苷和迷迭香酸的含量。见表4。实验结果表明，澄江产地的东紫苏中木犀草苷和迷迭香酸的含量明显高于其他产地，含量分别为19.35、35.23 mg·g^-1；昆明、曲靖、宜良和东川产地的东紫苏中木犀草苷的含量均较高，含量分别为18.48、15.62、15.58、16.03 mg·g^-1；而红河和禄劝产地的东紫苏中木犀草苷含量明显低于其他产地，含量分别为10.06、12.00 mg·g^-1；宜良、红河、昆明和禄劝产地的东紫苏中迷迭香酸的含量均较高，含量分别为34.70、33.27、30.94、30.77 mg·g^-1；曲靖产地的东紫苏中迷迭香酸素的含量（25.94 mg·g^-1）低于其他产地。

3 讨论

3.1 质量标志物的选择

东紫苏目前已在药品、保健食品中广泛使用，研究过程中对东紫苏中槲皮素、芦丁、白杨素、乔松素、咖啡酸、原儿茶酸、齐墩果酸和熊果酸等化学成分的含量进行了检测，但由于含量较低，故不作为东紫苏的定量检测指标。木犀草苷和迷迭香酸含量较高，又是东紫苏中的代表性成分，具有较强的生物活性，相邻峰之间有很好的分离度，基线平稳，重复性和稳定性均较好，可有效控制东紫苏的内在质量，故选择木犀草苷和迷迭香酸作为东紫苏质量控制的标志物。

3.2 挥发性成分的选择

据文献报道，东紫苏含有挥发油等化学成分，其中桉树醇的含量较高^［14］。参照《中国药典》（2020年版）四部通则2204挥发油测定法对东紫苏鲜品及干燥品进行了挥发油的对比研究。结果表明，东紫苏鲜品得油率为0.18%~0.26%，干燥品得油率为0.03%~0.08%。而东紫苏为干燥品入药，因此未考虑将挥发油含量作为质量控制指标。

3.3 色谱条件的选择

检测波长选择中采用二极管阵列检测器，设定波长范围200~400 nm对样品进行扫描。实验结果表明，当波长为348 nm时，供试品中其他成分对木犀草苷和迷迭香酸的干扰较小，基线平稳，吸收更强且线性关系更好，故选择348 nm波长作为检测波长；选择甲醇-水、乙腈-水、甲醇-体积分数0.3%的乙酸溶液、甲醇-体积分数0.3%的磷酸溶液、乙腈-体积分数0.3%的乙酸溶液、乙腈-体积分数0.3%的磷酸溶液作为流动相，并分别考察等度洗脱和不同梯度洗脱的方法，结果表明在梯度洗脱条件下，以乙腈-0.3%的磷酸作为流动相时，进行梯度洗脱，各成分的色谱峰分离效果较为理想，峰形均较好且无拖尾现象。

3.4 提取方式的选择

提取溶剂分别考察了不同比例的甲醇和乙醇对东紫苏中2种成分含量的影响，结果显示，甲醇作为提取溶剂时，提取效率较高，故选择甲醇为提取溶剂；提取方法分别考察了超声提取、冷浸提取、加热回流提取方法，结果显示，超声处理30 min时效果最佳，故提取方法确定为超声提取30 min。

3.5 限度的制定

根据《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则（试行）》中的规定和实验结果，8批东紫苏样品水分范围为5.89%~9.85%，平均值7.95%，建议水分不得超过10.00%；总灰分范围为7.04%~9.61%，平均值为8.79%，建议总灰分不得超过10.00%；酸不溶性灰分范围为0.39%~0.76%，平均值为0.56%，建议酸不溶性灰分不得超过1.00%；浸出物范围为30.37%~37.79%，平均值为33.92%，建议浸出物按干燥品计算不得少于27.00%；木犀草苷的含量范围为10.06~19.35 mg·g^-1，平均值为15.06 mg·g^-1、迷迭香酸的含量范围为25.33~35.20 mg·g^-1，平均值为30.70 mg·g^-1，以平均值的80%设限，建议限度制定为木犀草苷和迷迭香酸按干燥品计算分别不得低于9.00、24.00 mg·g^-1。

4 结论

本实验对东紫苏进行了显微鉴别，薄层色谱鉴别，对8批不同产地东紫苏药材进行了水分、总灰分和酸不溶性灰分的检测，根据《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则（试行）》，初步拟定其限度，对安全性指标（重金属及有害元素、33种禁用农药残留）进行了检测、对醇溶性浸出物进行了测定，初步拟定其限度，建立了用UPLC法同时测定东紫苏中2种主要有效成分的含量测定方法，并进行了方法学考察。该方法简便、高效、准确，首次对东紫苏的质量标准进行了较为完整的研究，可用于东紫苏的整体质量控制。迷迭香酸、木犀草苷在紫苏子、等齿叶薰衣草植物中均存在，在后续的研究中，将进一步采集多种植物，扩大样本种类和数量，以期建立不同植物中迷迭香酸、木犀草苷含量测定方法。

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基金资助

国家中管局2018级全国中药特色技术传承人才培训项目(T20184828005)