胶州延胡索基因组调研及简单重复序列特征分析

Genome survey and characteristic analysis of simple sequence repeat in Corydalis kiautschouensis V. Poelln

摘要

目的 基于基因组调研分析，研究药用植物胶州延胡索的基因组遗传信息。 方法 采用Illumina高通量测序技术，借助K-mer分析工具揭示胶州延胡索的基因组大小、杂合率和鸟嘌呤-胞嘧啶（guanine-cytosine，GC）含量等分子遗传学特征，利用微卫星序列识别工具（microsatellite identification tool，MISA）分析其简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）特征。 结果 结果表明胶州延胡索为三倍体，基因组的大小约为573.97 Mb，基因组的GC含量为39.18%；根据样品K-mer曲线偏离泊松分布，推测该样品的高杂合基因组杂合度为1.71%，重复序列比例为65.53%。提取reads中前50 000条序列与核苷酸序列（nucleotide，NT）数据库进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，结果显示，五台山延胡索Corydalis hsiaowutaishanensis T.P. Wang是比对上最多的物种，占比38.97%，表明胶州延胡索与同科同属植物五台山延胡索的来缘关系较近。此外对基因组序列进行SSR特征分析，共鉴定出864 360个SSR，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重复基序的占比依次为77.0%、11.6%、9.7%。 结论 胶州延胡索的复杂基因组高杂合、高重复，该研究为构建延胡索精细测序基因组文库提供依据，同时为其基因资源的保护、利用以及SSR分子标记的开发和应用提供参考。

Abstract

Objective To develop genetic resources of the medicinal plant Corydalis kiautschouensis V. Poelln. based on genomic investigation and analysis. Methods In this study， Illumina high-throughput sequencing technology and K-mer analysis tools were employed to elucidate the molecular genetic characteristics of Corydalis kiautschouensis， including genome size， heterozygosity， guanine-cytosine （GC） content， and to develop simple sequence repeat （SSR） molecular markers using microsatellite identification tool （MISA） software. Results The assembly analysis revealed that Corydalis kiautschouensis is a triploid with an estimated genome size of 573.97 Mb and a GC content of 39.18%. The deviation of the sample’s K-mer curve from Poisson distribution suggested a highly heterozygous genome， exhibiting a heterozygosity rate of 1.71% and repetitive sequences accounting for 65.53%. The first 50 000 reads were extracted and aligned against the nucleotide （NT） database using basic local alignment search tool （BLAST）， demonstrating the highest sequence match rate （38.97%） with Corydalis hsiaowutaishanensis T.P. Wang， indicating a close phylogenetic relationship between Corydalis kiautschouensis and this congeneric species. Additionally， SSR molecular genetic markers were predicted and developed based on detected gene sequences， totaling 864 ‍360 markers， with single nucleotide， dinucleotide， and trinucleotide repeat motifs accounting for 77.0%， 11.6%， and 9.7%， respectively. Conclusion The genome of Corydalis kiautschouensis V. Poelln. is characterized by a high proportion of repetitive sequences and is considered a complex genome with high heterozygosity. This study provides a reference for constructing a library for fine sequencing of the genome and offers a molecular basis for the development of SSR molecular markers， as well as for the protection and utilization of genetic resources.

Graphical abstract

关键词

胶州延胡索 / 基因组大小 / 杂合率 / 简单重复序列

Key words

Corydalis kiautschouensis V. Poelln / genome size / heterozygosity rate / simple sequence repeat

胶州延胡索（Corydalis kiautschouensis V. Poelln.）是罂粟科紫堇属多年生草本植物，以干燥块茎入药，其味辛、微苦，具有活血散瘀、行气止痛的功效^［1］。其主要活性成分为生物碱类成分，例如盐酸小檗碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀等，此外还含有甾体类、有机酸、糖类等成分。现代药理研究发现其具有镇痛、镇静催眠、抗心肌缺血、抗肿瘤等活性，在新兴领域如戒毒、抗血小板聚集及抗抑郁方面也有一定的药理作用^［2-4］。目前，胶州延胡索参考基因组信息缺乏。从全基因组层面深入探索与中药活性成分合成、优良农艺性状相关的基因，剖析这些基因在代谢物的合成途径、代谢物网络中的具体作用及其调控机制，能够为道地中药材的品种优化及基因资源保护奠定坚实的理论基础^［5］。目前，在规划全基因组测序策略、初步评估未测序植物的基因组大小及复杂性的研究过程中，简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记技术凭借其具有高度的多态性特点，在遗传图谱构建及种质资源鉴定领域获得了广泛的应用^［6-7］。

本研究采用Illumina高通量测序技术，对胶州延胡索开展基因组调研，揭示其K-mer分布曲线、鸟嘌呤-胞嘧啶（guanine-cytosine，GC）含量和重复序列比例等特征。采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）评估物种间序列相似性和进化关系，并开发SSR分子标记，为开展胶州延胡索的分子生药学和药用植物亲缘学研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Covaris M220型超声波破碎仪（美国Covaris公司）；Qubit 2.0型荧光定量仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 2100型生物分析仪（美国Agilent公司）；Illumina NovaSeq 6000型高通量基因测序系统（美国Illumina公司）。

1.2 材料

胶州延胡索来自山东威海，经汉中职业技术学院王仕宝教授鉴定为罂粟科紫堇属药用植物Corydalis kiautschouensis V. Poelln.的块茎，植物标本保存于汉中职业技术学院秦巴山区药（食）用植物研究所。

2 方法

采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取延胡索块茎脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否降解及片段大小；Nannodrop检测DNA纯度，Qubit荧光定量仪对DNA进行定量。DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增等步骤完成整个文库的制备。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0型荧光定量仪进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100型生物分析仪对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量^［8］。文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至Flow cell，使用桥式集群生成系统（cluster generation bot，cBOT）成簇后使用Illumina 高通量测序平台Illumina NovaSeq进行测序^［9］。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始数据（raw reads 或rawdata），结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的碱基信息以及其对应的测序质量信息^［10］。在测序过程中会存在一定的错误率，测序质量值可衡量碱基未正确检出的概率。如果测序错误率用P表示，碱基质量值用Q_score表示，则有以下关系：

Q_{\mathrm{s}\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{r}\mathrm{e}}=-\mathrm{10}\times \mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{10}}P

测序质量值通过公式转化可以得到每个碱基的测序错误率，而测序错误率是在Base Calling过程中使用一种预测碱基发生错误概率模型计算得到的^［8］。碱基质量值越高表示碱基识别正确率越高，碱基测序错误率越小^［11］。

由于原始测序数据可能包含低质量序列、接头序列等，为了保证信息分析结果的可靠性，原始测序数据需要经过过滤，从而得到clean reads，仍然以FASTQ格式存储（该序列文件可直接用于公共数据库提交，后续分析等）^［12］。数据过滤的标准为：①去除N碱基含量超过5%的reads；②去除低质量值（质量值≤5）碱基数量达到50%的reads；③去除被adapter污染的reads；④去除PCR扩增造成的重复序列^［11］。

利用测序得到的reads，采用基于K-mer的分析方法来估计基因组大小和杂合率等情况^［13］。K-mer是指一段长度为K bp的序列，从一段连续序列中迭代地选取长度为K个碱基的序列，若序列的长度为L，则K-mer的长度为K，那么可以得到L-K+1个K-mer^［14］。然后对测序得到的reads 取K-mer，统计每个K-mer出现的频数。根据Lander-waterman算法，基因组（G）满足如下公式：

C_{\mathrm{b}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{e}}=C_{\mathrm{K}-\mathrm{m}\mathrm{e}\mathrm{r}}\times \frac{L}{L-K+\mathrm{1}}

\mathrm{G}=\frac{n_{\mathrm{K}-\mathrm{m}\mathrm{e}\mathrm{r}}}{C_{\mathrm{K}-\mathrm{m}\mathrm{e}\mathrm{r}}}=\frac{n_{\mathrm{b}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{e}}}{C_{\mathrm{b}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{e}}}

注：C_base和C_K-mer 为覆盖碱基的期望深度和K-mer期望覆盖深度，n_base 和n_K-mer为序列的碱基总数和K-mer总数。在数据量一定的情况下，K-mer的深度频数是服从泊松分布的，因此，K-mer深度频数分布的峰值为对应的深度，作为K-mer期望深度的估计值^［14］。

通过 GenomeScope（2.0版）软件评估基因组的大小及杂合情况；使用Jellyfish（2.2.10版）得到K-mer频率-深度分布后，并基于K-mer频数-深度分布对基因组的大小进行估计。为了确定测序数据是否存在污染，从测序的reads中前50 000条与NT数据库（201806版）进行BLAST比对（2.11.0+版）^［15-16］。

运用微卫星识别工具（microsatellite identification tool，MISA，https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）对序列进行SSR分析，参数设置为默认；对应的各个重复单元（unit size）的最少重复次数分别为：1-10、2-6、3-5、4-5、5-5、6-5，如：1-10表示以单核苷酸为重复单位时，其重复数至少为10才可被检测到^［17］。

3 结果

3.1 测序数据量的统计

采用高通量测序技术进行测序，过滤掉低质量数据后，得到有效数据^［18］，见表1。由表1可知，G/C碱基数量占总碱基数量的百分比（G/C含量）为39.18%，整条测序序列中，碱基质量值为20（Q₂₀）的碱基占总碱基数量的百分比为96.83%，碱基质量值为30（Q₃₀）的碱基占总碱基数量的百分比为91.36%，表明碱基识别准确率高，测序质量良好。

3.2 K-mer分析及基因组大小的评估

在基因组组装前，采用基于K-mer分析的方法，通过GenomeScope（2.0版）软件估算基因组的大小和杂合率^［19］。利用测序得到的reads，取K为19进行后续分析，胶州延胡索的频率分布见图1。由图1可见，该样本为三倍体，K-mer的深度为32.00左右，基因组大小初步估计为573.97 Mb，单套染色体大小约为1 738.26 Mb；K-mer曲线偏离泊松分布，推测该样品为高杂合，杂合度为1.71%，重复度为65.53%。

3.3 胶州延胡索物种的比对

将测序的reads中提取前50 000条与NT数据库（201806版）进行BLAST比对（2.11.0+版；参数-evalue 1e-5 -max_target_seqs 1），以确保测序数据未被污染^［11］。经统计，比对得到13 261条roads，五台山延胡索Corydalis hsiaowutaishanensis T.P. Wang是比对上最多的物种，共5 168条，表明胶州延胡索与同科同属植物五台山延胡索的亲缘关系较近。NT数据库比对结果、物种分类结果见表2。

3.4 胶州延胡索基因组的SSR分析

采用微卫星识别工具MISA对初步组装的胶州延胡索基因组进行SSR分析，结果显示，单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基序的分布数量分别为665 649、100 250、83 142、8 412、3 795、2 646。在总重复基序数的占比依次为77.0%、11.6%、9.7%、1.0%、0.4%、0.3%。对每种SSR重复基序按照序列组成进行分类，结果表明，在单核苷酸、双核苷酸、三核苷酸重复基序中，A/T、AT/AT和AAT/ATT的含量最高。见表3、表4。

4 讨论

药用植物是中药体系的重要组成部分。自2009年陈士林院士团队提出“本草基因组计划”以来，针对具有重大经济价值和典型次生代谢途径的药用植物类群，系统开展了全基因组测序及后基因组学研究。该研究通过揭示药用植物的遗传背景，为药用植物的资源鉴定、活性成分合成机制解析及分子育种提供了重要的技术方法和理论支撑^［20-21］。随着高通量二代测序技术的成熟和测序成本的大幅下降，基于大规模平行测序的基因组调研已成为分子标志筛选与开发的核心技术手段。

本研究采用Illumina高通量测序技术，结合K-mer分析工具，对胶州延胡索的基因组大小、杂合率和GC含量等分子遗传学特征进行解析，并利用MISA方法开展SSR特征分析。结果表明，胶州延胡索为三倍体物种，基因组的大小约为573.97 Mb，单套染色体的大小约为1 738.26 Mb，基因组的GC含量为39.18%；基于K-mer曲线偏离泊松分布的特征，推测其为高杂合基因组，杂合度为1.71%，重复序列比例为65.53%。表明胶州延胡索具有高杂合、高重复的复杂基因组。为获取高质量的胶州延胡索全基因组图谱，后续研究将采用二代与三代测序技术相结合的策略，并利用Hi-C技术定位染色体水平的序列定位。BLAST比对结果显示，同科同种植物五台山延胡索与胶州延胡索的亲缘关系较近。目前，延胡索属植物的基因信息较匮乏，本研究通过鉴定864 360个SSR位点（以单核苷酸、双核苷酸、三核苷酸重复基序为主），不仅为延胡索基因组精细测序文库的构建提供参考，也为SSR分子标志开发及基因资源的保护与利用奠定基础，对开展该科植物的分子生药学及药用植物亲缘学研究提供重要科学依据。

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基金资助

秦创原中医药产业创新聚集区项目(L2024-QCY-ZYYJJQ-X69)

秦创原中医药产业创新聚集区项目(L2024-QCY-ZYYJJQ-X38)

秦巴生物资源与生态环境国家重点实验室项目(SXC-2019)

陕西中医药大学科技创新人才体系建设计划项目(2023)

陕西省科技厅重点研发计划社发项目(2022SF-543)

汉台区科学技术计划项目(2021KX-07)