基于薄层色谱与一测多评法的龙胆泻肝片中黄芩质量的研究

Quality evaluation of Scutellariae radix in Longdan Xiegan Tablets based on thin-layer chromatography and quantitative analysis of multi-components by single marker

摘要

目的 建立龙胆泻肝片中黄芩的薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）鉴别方法、一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）和显微鉴别方法，评价龙胆泻肝片中黄芩的质量。 方法 采用QAMS测定龙胆泻肝片中黄芩的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种黄酮类成分的含量；采用TLC鉴别龙胆泻肝片中黄芩、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素。参照《中华人民共和国药典》（2020年版）显微鉴别法对龙胆泻肝片粉末进行鉴别。 结果 以黄芩苷为内参物，汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的相对校正因子分别为0.792、0.598、0.518，22批次龙胆泻肝片样品QAMS与外标法的含量测定结果无显著性差异；建立的龙胆泻肝片中黄芩、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的TLC鉴别方法专属性强；龙胆泻肝片粉末中可观测到黄芩的显微特征韧皮纤维。 结论 建立的TLC鉴别方法、QAMS和显微鉴别方法可为龙胆泻肝片中黄芩的质量控制和评价提供参考。

Abstract

Objective To establish a thin-layer chromatography （TLC） identification method， quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）， and microscopic identification method for Scutellariae radix in Longdan Xiegan Tablets， and to evaluate the quality of Scutellariae radix in Longdan Xiegan Tablets. Methods The content of 4 flavonoids （baicalin， wogonoside， baicalein and wogonin） in Scutellariae radix of Longdan Xiegan Tablets were determined by QAMS. The identification of Scutellariae radix， baicalin， baicalein and wogonin in Longdan Xiegan Tablets was studied by TLC. The powders of Longdan Xiegan Tablets were identified by the microscopic identification method of Chinese Pharmacopoeia （2020 edition）. Results The relative correction factors of wogonoside， baicalein， and wogonin were established by using baicalin as an internal reference. The values were 0.792， 0.598 and 0.518， respectively. There was no significant difference in the content determination results between QAMS and external standard method （ESM） for 22 batches of Longdan Xiegan Tablets. TLC identification method of Scutellariae radix， baicalin， baicalein and wogonin in Longdan Xiegan Tablets was established with strong specificity. Microscopic characteristics of Scutellariae radix with phloem fibers were observed in the powder of Longdan Xiegan Tablets. Conclusion The established TLC identification method， QAMS， and microscopic identification method can provide reference for the quality control and evaluation of Scutellariae radix in Longdan Xiegan Tablets.

Graphical abstract

关键词

龙胆泻肝片 / 一测多评 / 薄层色谱 / 显微鉴别 / 质量评价

Key words

Longdan Xiegan Tablets / quantitative analysis of multi-components by single marker / thin-layer chromatography / microscopic identification / quality evaluation

龙胆泻肝片由龙胆、柴胡、黄芩、栀子（炒制）等10味药材配伍而成，具有清肝胆、祛湿热的功效，临床上用于治疗肝胆湿热引起的头晕目赤、耳鸣耳聋、耳痛、胸胁痛、口苦等症状^［1］。现行质量标准仅涵盖性状检查，薄层色谱鉴别龙胆苦苷、栀子苷，以及常规理化检查项目^［1］。其中，黄芩作为方中臣药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的药理活性，其主要药效物质包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类成分^［2］。前期研究发现，不同厂家的龙胆泻肝片样品中黄芩的上述4种黄酮类成分的含量存在显著差异，因此，加强黄芩药材的质量控制对保证制剂质量均一性具有重要意义。

通过文献调研发现，现有研究中薄层色谱鉴别仅涉及黄芩苷单一成分，缺乏针对黄芩药材的系统鉴别方法；含量测定方面，虽已建立龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的高效液相色谱测定方法，但尚未见采用一测多评（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）技术同时测定龙胆泻肝片中黄芩4种黄酮类成分含量的相关报道^［3-6］。QAMS技术基于同一色谱系统内不同组分之间的相对校正系数的恒定性，通过单一标准品实现多组分同步定量检测^［7-18］。

本研究以黄芩苷为内参物，系统计算汉黄芩苷、黄芩素以及汉黄芩素的相对校正因子，并测定其含量，从而达到用黄芩苷1个对照品对4个黄酮类成分进行质量控制的目的。龙胆泻肝片共有38个批准文号，涉及35家生产企业，有素片、糖衣片、薄膜衣片3种剂型。鉴于黄芩以生药粉形式入药，其质量直接影响制剂疗效，因此开展黄芩质量标准提升研究具有迫切性和必要性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent-1260型、Agilent-1200型高效液相色谱仪、Agilent ZORBAX SB-Aq型C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），均购自美国Agilent公司；Diamonsil PLUS C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）购自北京迪科马科技有限公司；LT502E型电子天平、Satorious BP211D型电子天平，均购自北京赛多利斯科学仪器有限公司；OLYMPUS BX-51型显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；Sk2510 LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；A2S-10-BE型超纯水仪（美国艾科浦国际有限公司）。

1.2 试药

对照品：黄芩苷（批号110715-201821，质量分数为95.4%）、汉黄芩苷（批号112002-201702，质量分数为98.5%）、黄芩素（批号111595-201808，质量分数为97.9%）、汉黄芩素（批号111514-201706）、黄芩对照药材（批号120955-201810），均购自中国食品药品检定研究院。龙胆泻肝片样品S1~S4（批号分别为210826、201804、210803、211101，购自企业A）、S5~S7（批号分别为211103、211101、220205，购自企业B）、S8~S13（批号分别为202012006、20211201、20211003、20211002、20210901、20220105，购自企业C）、S14~S17（批号分别为410487、410525、410494、420086，购自企业D）、S18~S21（批号分别为20201171、20210960、20210823、20220198，购自企业E）、S22（批号210510，购自企业F）。乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲醇、磷酸均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法和结果

2.1 显微鉴别

取龙胆泻肝片样品（S14）2片，除去包衣，研细，取粉末（过4号筛）少许，置于载玻片上，滴加水合氯醛加热透化，盖上盖玻片，取黄芩对照药材0.1 g，同法制片后置于显微镜下观察。结果显示，韧皮纤维呈淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细。见图1。

2.2 薄层鉴别

取龙胆泻肝片样品（S14）5片，除去包衣，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5 mL甲醇使其溶解，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。分别取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含1.0、0.5、0.5 mg的对照品溶液。取缺黄芩的阴性对照品约1.5 g，按上述供试品溶液制备方法制备成缺黄芩的阴性对照溶液。按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）通则0502项下薄层色谱法进行实验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液、黄芩苷对照品溶液、黄芩素对照品溶液、汉黄芩素对照品溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶2∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯365 nm处检视，再喷以体积分数为2%的三氯化铁乙醇溶液，置于日光下检视。结果显示，供试品色谱在与对照药材和对照品相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图2。

2.3 一测多评法含量测定

2.3.1 混合对照品溶液的制备

取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品约39.50、14.50、14.65、9.26 mg，精密称定，分别置于50、20、20、20 mL量瓶中，用体积分数为70%的甲醇溶解，定容至刻度，得到质量浓度分别为0.750 4、0.714 1、0.717 1、0.463 0 mg·mL^-1的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素单一对照品储备液。再分别量取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品储备液10.0、2.0、1.0、0.8 mL，置于15 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇定容至刻度，得到质量浓度分别为500.266 7、95.216 7、47.807 8、24.693 3 μg·mL^-1的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液5 mL，置于10 mL量瓶中，用体积分数为70%的甲醇定容至刻度，得到混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

取龙胆泻肝片适量，研细（糖衣片去糖衣），取粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液的制备

根据龙胆泻肝片的处方比例和制备工艺制备缺黄芩的阴性对照品，按照2.3.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3.4 色谱条件

采用Diamonsil PLUS C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-1 mL·L^-1磷酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序为0~15 min，25% A；15~25 min，25% A→32% A；25~30 min，32% A →40% A；30~60 min，40% A；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为274 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.3.5 系统适应性实验

分别取上述制备的混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量，按照2.3.4项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分离度均大于1.5，阴性对照溶液无干扰。见图3。

2.3.6 线性关系考察

取2.3.1项下制备的混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，得系列质量浓度的混合对照品溶液。按照2.3.4项下的色谱条件进样测定，记录色谱图，以对照品质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。结果显示，黄芩苷的线性范围为25.013 3~500.266 7 μg·mL^-1（r=0.999 9），汉黄芩苷的线性范围为4.760 8~95.216 7 μg·mL^-1 （r=1.000 0），黄芩素的线性范围为2.390 4~47.807 8 μg·mL^-1（r=0.999 7），汉黄芩素的线性范围为1.234 7~24.693 3 μg·mL^-1（r=0.999 9），表明各成分在各自范围内线性关系良好。见表1。

2.3.7 精密度实验

取2.3.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.3.4项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.25%、0.31%、0.43%、0.35%，表明仪器的精密度良好。

2.3.8 稳定性实验

取龙胆泻肝片样品（S14），按照2.3.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3.4项下色谱条件，分别在0、2、5、15、20、24 h进样，记录峰面积，计算RSD。黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.61%、0.87%、0.45%、0.79%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9 重复性实验

取龙胆泻肝片样品（S14），按照2.3.2项下方法制备成供试品溶液，平行制备6份，按照2.3.4项下色谱条件进样测定，分别计算6份样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量，其RSD分别为0.53%、0.49%、0.83%、0.59%，表明该方法的重复性良好。

2.3.10 加样回收率实验

取已知含量的龙胆泻肝片样品（S14）0.25 g，研细平行6份，精密称定，置于25 mL量瓶中，精密加入黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品储备液5.0、0.8、0.4、0.3 mL，加体积分数为70%的甲醇定容至刻度，按照2.3.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3.4项下色谱条件进样测定，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均回收率和RSD。见表2。

2.3.11 相对校正因子计算

参考相关文献^［7-9］，相对校正因子f_s/i=f_s/f_i=（C_s×A_i）/（C_i×A_s）f_{\mathrm{s}\mathrm{i}}=f_{\mathrm{s}}/f_{\mathrm{i}}=(A_{\mathrm{s}}/C_{\mathrm{s}})/(A_{\mathrm{i}}/C_{\mathrm{i}})，待测成分浓度计算公式C_i=（C_s×A_i）/（f_s/i×A_s），式中A_s为内参物对照品s的峰面积，C_s为内参物对照品s的质量浓度，A_i为某待测成分对照品i的峰面积，C_i为某待测成分对照品i的质量浓度。取2.3.1项下的混合对照品储备液进行稀释，按照2.3.4项下色谱条件进样测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积。用黄芩苷作为内参物，分别计算黄芩苷对汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的相对校正因子f。见表3。

2.3.12 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

取2.3.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.3.4项下色谱条件分别采用不同仪器和色谱柱进行测定，分别考察Agilent 1260型和 Agilent 1200型高效液相色谱仪和Dima PLUS、Agilent SB-AQ色谱柱对相对校正因子的影响。见表4。

2.3.13 色谱峰定位

取2.3.1项下的混合对照品溶液，按照2.3.4项下色谱条件进样测定，以黄芩苷为内参物，采用相对保留时间法对其他3种成分色谱峰进行定位，结果表明，不同仪器、色谱柱对各待测成分的相对保留时间无明显影响。见表5。

2.3.14 QAMS与外标法（external standard method，ESM）测定结果的比较

取22批次龙胆泻肝片样品各约0.5 g，精密称定，按照2.3.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3.4项下色谱条件进样测定，记录色谱图和峰面积，分别采用QAMS和ESM计算各成分的含量及相对平均偏差（relative average deviation，RAD），结果显示，RAD值均小于2%，表明2种方法测定含量的结果差异不显著，可用于龙胆泻肝片中黄芩的4个黄酮类成分的质量研究。见表6。

3 讨论

3.1 定性鉴别

分别考察了不同提取溶剂［甲醇、乙酸乙酯-甲醇（3∶1）］、不同展开剂［乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）、乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（26∶7∶1.5∶3）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶2∶2）］、不同波层板（G板、GF254板、聚酰胺薄膜）对TLC结果的影响，结果显示，提取溶剂为乙酸乙酯-甲醇（3∶1）时供试品溶液的斑点更清晰；展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶2∶2），GF254板和聚酰胺薄膜展开效果较好，但GF254板中黄芩苷斑点的比移值较小，故选择以聚酰胺薄膜为薄层板。置于紫外灯365 nm处检视，聚酰胺膜由于载样量小，部分样品中黄芩苷和黄芩素在紫外灯365 nm处显色不明显，故加用体积分数为2%的三氯化铁显色剂显色，使黄芩苷和黄芩素斑点的显色更明显。在显微镜下观察6个生产厂家22批样品的粉末显微特征，结果均可观测到黄芩药材粉末的显微特征韧皮纤维。

3.2 含量测定

3.2.1 提取方法的优化

参考相关文献^［2-15］，提取溶剂选择体积分数为70%的甲醇，提取方法选择超声提取，考察不同超声时间（30、45、60 min），结果显示，4种黄酮类成分的峰面积无明显差异，故选择超声提取30 min；考察不同取样量（0.25、0.50 g）、不同溶剂用量（15、25、50 mL），结果显示，取样量0.5 g，溶剂用量为25 mL时可提取完全。

3.2.2 检测波长的确认

采用二极管阵列检测器在200~400 nm范围内对混合对照品溶液进行扫描，结果发现，在274 nm处黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的分离效果及峰形最好，故选择274 nm作为检测波长。

3.2.3 内参物的选择

《中国药典》（2020年版）一部中黄芩药材、黄芩提取物均选取黄芩苷作为含量测定的指标性成分，考虑到黄芩苷的化学性质稳定，含量较高，价廉易得，故选择黄芩苷为内参物。

3.2.4 结果分析

22批次龙胆泻肝片中均检测出黄芩的4种黄酮类成分，不同厂家样品中4个成分的含量有一定差异，黄芩苷为7.778~21.347 mg·g^-1，汉黄芩苷为1.508~3.579 mg·g^-1，黄芩素为 0.464~2.106 mg·g^-1，汉黄芩素为0.216~0.993 mg·g^-1，龙胆泻肝片中黄芩以黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的总量计，黄芩含量为10.114~26.426 mg·g^-1，平均含量为17.787 mg·g^-1。若黄芩含量以平均含量的70%为限度评定，黄芩（以黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的总量计）含量不得低于12.451 mg·g^-1。结果表明，22批样品有3批的黄芩含量达不到评定限度。这种差异主要存在于不同厂家之间。表明企业在黄芩药材的质量控制、生产工艺上存在较大差异。

黄芩是龙胆泻肝片中的主要有效成分，且是生粉入药，显微鉴别在鉴定药材是否为生粉入药时具有不可替代的优势，因此增加黄芩的显微鉴别，建立的黄芩药材、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素薄层色谱鉴别方法，可快速、准确地鉴别该制剂中黄芩的投料情况，建立的QAMS，仅用黄芩苷对照品就能计算出另外3个黄酮类成分的含量，不仅降低了检测成本，节约了检验时间，还能更全面地反映龙胆泻肝片中黄芩的总体质量。本研究建立的黄芩显微鉴别、薄层色谱鉴别及含量测定方法，可为龙胆泻肝片中黄芩药材的质量评价提供参考。

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基金资助

保山市科技计划项目(2024bskj61)