乙酰唑胺片中乙酰唑胺含量的测定

Determination of acetazolamide content in Acetazolamide Tablets

摘要

目的 建立乙酰唑胺片中乙酰唑胺含量的测定方法。 方法 采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（high performance liquid chromatography-diode array detector， HPLC-DAD），配置Alltima C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（冰醋酸调至pH 4.0）（8∶92）作为流动相，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为265 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 µL。 结果 乙酰唑胺质量浓度在124.2~372.6 μg·mL^-1范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.999 9；该方法的专属性强，乙酰唑胺和药品中其他成分以及强制降解产物之间均有良好的分离度；精密度和稳定性的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.15%、1.07%；乙酰唑胺片中乙酰唑胺的平均回收率（n=9）为98.91%，RSD为0.71%。 结论 该方法准确、简单、快速，可用于乙酰唑胺片中乙酰唑胺含量的测定。

Abstract

Objective To establish a determination method for acetazolamide in Acetazolamide Tablets. Methods High performance liquid chromatography-diode array detector （HPLC-DAD） was employed. The chromatographic column used was an Alltima C₁₈ column （150 mm×4.6 mm， 5 µm）. The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.05 mol·L^-1 anhydrous sodium acetate solution （adjusted to pH 4.0 with glacial acetic acid） in a ratio of 8∶92. The flow rate was set at 1.0 mL·min^-1， with a detection wavelength of 265 nm and a column temperature of 30 ℃. The injection volume was 10 µL. Results Acetazolamide exhibited a good linear relationship between mass concentration and peak area in the range of 124.2 to 372.6 µg·mL^-1， with a linear correlation coefficient （r） of 0.999 9. The method demonstrated strong specificity， with good separation between acetazolamide and other components in the tablets， as well as forced degradation products. Precision and stability were satisfactory， with relative standard deviations （RSD） of 0.15% and 1.07%， respectively. The recovery rate was good， with an average recovery rate of 98.91% （n=9） and an RSD of 0.71%. Conclusion The method is accurate， simple， and rapid， making it suitable for the determination of acetazolamide in Acetazolamide Tablets.

Graphical abstract

关键词

乙酰唑胺 / 乙酰唑胺片 / 高效液相色谱 / 含量测定

Key words

acetazolamide / Acetazolamide Tablets / high-performance liquid chromatography / content determination

乙酰唑胺作为结晶磺胺类药物，临床上可用于治疗青光眼、急性高原病、水肿、阻塞性睡眠呼吸暂停等疾病^［1-7］，在眼组织中，其药理活性主要表现在眼压调节方面，通过抑制碳酸酐酶活性，减少房水生成，进而发挥降低眼压的作用^［8］。此外，药理研究发现，乙酰唑胺还具有抗炎、抗肿瘤、保护肾脏等多种生物活性^［9-13］。其中，乙酰唑胺片在临床中常用于治疗各种类型的青光眼，也可作为某些内眼手术前降低眼压的辅助用药。然而，当前针对乙酰唑胺含量测定的研究相对匮乏，仅有早期少量关于生物样品中其含量测定的相关报道^［14］。在乙酰唑胺片的含量测定方面，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2020年版）^［15］采用紫外分光光度法，通过吸光系数法进行定量分析，但该方法存在一定局限性，其测定结果的准确性易受干扰。当杂质或药品辅料在选定测定波长处存在吸收时，会导致测定结果偏高^［16］。相较于高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC），吸光系数法的专属性较弱。HPLC凭借定量准确、分离性能高、专属性强、重复性好等优势，在药品定量分析中占据重要地位^［17-18］，目前，关于乙酰唑胺片含量测定的HPLC方法的相关报道尚不多见。因此，本研究建立乙酰唑胺片中乙酰唑胺含量测定的HPLC-二极管阵列检测（diode array detection，DAD）方法，旨在为乙酰唑胺片的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（配备有LC Open LAB色谱工作站）、Agilent 8453型紫外-可见分光光度计，均购自美国Agilent Technologies公司；XP-205型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-800KDE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GZX-GF101-Ⅱ型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；SPX-250 IC型微电脑人工气候箱（上海博迅实业有限公司）。

1.2 试药

乙腈［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；无水乙酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯），均购自北京化学试剂公司；冰醋酸（分析纯）、盐酸（分析纯）、30%过氧化氢（分析纯），均购自国药集团化学试剂有限公司；乙酰唑胺对照品（批号6020F29S，质量分数为99.0%），购自阿法埃莎（中国）化学有限公司；乙酰唑胺片（规格为含乙酰唑胺250 mg·片^-1，批号为MN9106、RH0621、TY9193），购自加拿大Apotex公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱采用Alltima C₁₈柱（150 mm×4.6 mm， 5 µm）；以乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（用冰醋酸调节pH至4.0）（8∶92）为流动相；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为265 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 µL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液

取乙酰唑胺对照品约250 mg，精密称定，置于200 mL量瓶中，加入0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液120 mL，超声使其溶解，用0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液。取对照品储备液适量，加0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液稀释，制得质量浓度依次为124.2、198.7、248.4、298.1、372.6 μg·mL^-1的系列对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取乙酰唑胺片20片，置于乳钵中，研细，取粉末约0.045 g（约相当于乙酰唑胺25 mg），精密称定，置于100 mL量瓶中，加0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液适量，超声（功率为800 W，频率为40 kHz）处理30 min，加入0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，进样前，用0.22 µm微孔滤膜过滤。

2.2.3 阴性对照溶液

按照乙酰唑胺片说明书，取乙酰唑胺片样品的空白辅料约0.04 g，精密称定，按照2.3项下供试品溶液的制备方法进行操作，配制阴性对照溶液。

2.3 专属性考察

2.3.1 基质干扰实验

取2.2项下配制的阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。乙酰唑胺的保留时间为6.5 min，样品中的辅料不会干扰乙酰唑胺的检测。见图1。

2.3.2 强制降解实验

参照国际通行的人用药品技术要求国际协调理事会（the international council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use，ICH）原则^［19-20］，通过强制降解实验对该方法的专属性进行考察，旨在探究降解条件下产生的降解产物是否会干扰待测成分乙酰唑胺的分析，实验考察条件包括加热、光照、氧化、酸化以及碱化。取乙酰唑胺片（批号为MN9106）适量，置于乳钵中，研细，取粉末约0.045 g（约相当于乙酰唑胺25 mg），精密称定，平行5份，置于100 mL量瓶中，按照不同条件进行处理。①热降解处理：将样品置于105 ℃烘箱中加热6 h，取出冷却至室温后，按照2.2.2项下供试品溶液配制方法制备得到热降解产物考察溶液。②光降解处理：将样品置于光照强度为10 000 lx的微电脑人工气候箱中照射6 h，取出，冷却至室温后，按照2.2.2项下供试品溶液配制方法制备得到光降解产物考察溶液。③氧化降解处理：向样品中加入2 mL体积分数为30%过氧化氢溶液，于25 ℃室温下放置6 h，按照2.2.2项下供试品溶液配制方法制备得到氧化降解产物考察溶液。④酸降解处理：向样品中加入1 mol·L^-1氢氧化钠溶液2 mL，于25 ℃室温下放置6 h，再加入1 mol·L^-1盐酸溶液中和至中性，按照2.2.2项下供试品溶液配制方法制备得到酸降解产物考察溶液。⑤碱降解处理：向样品中加入1 mol·L^-1盐酸溶液2 mL，于25 ℃室温下放置6 h，再加入1 mol·L^-1氢氧化钠溶液中和至中性，按照2.2.2项下供试品溶液配制方法制备得到碱降解产物考察溶液。

取上述各强制降解产物考察溶液各10 µL，按照2.1项下色谱条件进样测定。结果显示，在加热、光照、氧化、酸化及碱化条件下，乙酰唑胺均发生不同程度的降解，其峰面积较未进行强制降解实验的样品有所降低，其中加热条件下降解最显著，氧化条件下次之。光照、酸化及碱化处理后的样品中未检测出明显降解产物色谱峰；加热处理后的样品色谱图中，在保留时间2.487 min处出现明显降解产物色谱峰；氧化处理后的样品色谱图中，保留时间1.520 min处的色谱峰为30%过氧化氢溶液峰，2.489、4.474 min处可见明显降解产物色谱峰，但上述色谱峰的出现均不干扰乙酰唑胺的定量分析。见图2。

2.4 系统适应性和线性实验

取2.2.1项下配制的质量浓度为248.4 μg·mL^-1的对照品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果表明，乙酰唑胺色谱峰的平均理论塔板数为（9 606.8±11.3）（n=6）、对称因子为（1.079±0.002）（n=6）。取2.2.1项下配制的线性系列溶液，按照2.1项下色谱条件下进样测定，记录色谱图。以对照品溶液的质量浓度（μg·mL^-1）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。回归曲线为y=26.41x+28.05，r=0.999 9，线性范围为124.2~372.6 μg·mL^-1。将低质量浓度的对照品溶液用0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液逐级稀释，进样分析。当信噪比（signal-noise ratio，S/N）为3.0时，此时的质量浓度为检测限（limit of detection，LOD），S/N为10.0时，此时的质量浓度为定量限（limit of quantitation，LOQ）。该方法的LOD值为0.012 µg·mL^-1，LOQ值为0.037 µg·mL^-1。

2.5 精密度实验

取乙酰唑胺片（批号为MN9106）适量，置于乳钵中，研细，按照2.2.2项下方法制得供试品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算得峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.15%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取乙酰唑胺片（批号为MN9106）适量，置于乳钵中，研细，每份约0.045 g，精密称定6份，按照2.2.2项下方法制得供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，计算得乙酰唑胺的平均含量为99.24%，RSD为1.45%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.7 回收率实验

取已知含量的乙酰唑胺片（批号为MN9106）适量，置于乳钵中，研细，每份约0.023 g，精密称定9份，每3份分别精密加入2.2.1项下配制的对照品储备液8、10、12 mL，按照2.2.2项下方法制得供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率和RSD。见表1。

2.8 稳定性实验

取乙酰唑胺片（批号为MN9106）适量，置于乳钵中，研细，按照2.2.2项下方法制得供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录峰面积。计算得峰面积的RSD为1.07%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.9 样品测定

采用本文建立的方法和《中国药典》（2020年版）中的方法分别测定3批乙酰唑胺片中乙酰唑胺的含量，每个样品独立制备2份，取平均值。结果表明，2种方法测定结果基本一致，表明本研究所建立的方法可行。见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的确定

在200~400 nm波长范围内对乙酰唑胺对照品溶液进行扫描，结果显示在265 nm波长处有最大吸收，故以265 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件的选择

考察不同流动相体系［甲醇-乙腈-体积分数0.43%无水乙酸钠溶液（冰醋酸调pH至4.0）、乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（冰醋酸调pH至4.0）、甲醇-乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（pH 4.0）、乙腈-体积分数0.1%磷酸、乙腈-0.01 mol·L^-1乙酸铵溶液（冰醋酸调pH至4.0）］对色谱峰峰形的影响，结果显示流动相为乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（pH 4.0）时乙酰唑胺峰形良好，理论塔板数大于9 500。对乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（pH 4.0）不同比例（5∶95、8∶92、10∶90）、不同流速（0.5、0.8、1.0 mL·min^-1）、不同进样体积（5、10、20 µL）进行考察，结果显示当乙腈-0.05 mol·L^-1无水乙酸钠溶液（pH 4.0）比例为8∶92，流速为1.0 mL·min^-1、进样体积为10 µL时，乙酰唑胺色谱峰的保留时间（约为6.5 min）以及响应值均合适，样品中的辅料以及通过强制降解试验产生的降解产物不会对目标成分的定量检测造成干扰。

3.3 提取方法的确定

考察不同浓度氢氧化钠（0.005和0.250 mol·L^-1）作为提取溶剂对提取结果的影响，结果显示，两者均可以提取完全，故选择0.005 mol·L^-1氢氧化钠溶液作为提取溶剂。考察不同超声处理时间（15、20、30、40 min）的影响，结果显示，超声提取时间为15、20、30、40 min时，乙酰唑胺的平均回收率分别为89.7%、92.5%、98.2%、98.4%，表明将超声时间设定为30、40 min时能将乙酰唑胺提取完全，结合《中国药典》（2020年版）对回收率的要求（回收率应在95%~102%^［15］），两者均符合要求。为节省时间，将30 min确定为提取时间。考察不同质量的样品粉末（约相当于乙酰唑胺25、50 mg）的影响，结果显示，当称定约相当于乙酰唑胺25 mg的样品粉末，加溶剂稀释100倍时，乙酰唑胺具有合适的响应值。

本研究采用HPLC-DAD技术，建立了乙酰唑胺片中乙酰唑胺含量的测定方法，建立的方法准确、快速、简便、专属性强，易于推广。经方法学考察，该方法的精密度、重复性、稳定性、回收率均良好，基质无干扰，适合于乙酰唑胺片中乙酰唑胺含量的准确测定，可用于该药品的质量控制，具有一定的参考价值。

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基金资助

首都卫生发展科研专项项目(首发2024-1-4052)